מרובה עכבר Neuroanatomical תהודה מגנטית

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להשיג פנוטיפיה בתפוקה גבוהה בעכברים חיים או מקובעים באמצעות MRI של מוח העכבר במספר רב של דגימות. דבר זה מושג תחילה על ידי הרדמתו של כל עכבר. לאחר מכן, עבור סריקה in vivo, יש להניח כל עכבר על מחוות (sled) בגודל מתאים לפני ההרכבה במערך טעינה והחדרתו אל תוך פתח המגנט.

או עבור דימוי ex vivo, בצעו פרפוזיה טרנס-קרדיאלית, בודדו את מבנה הגולגולת והניחו אותה בתוך מבחנות דימוי, אשר מוצבות לאחר מכן במערך סלילי סולנואיד בעל 16 ערוצים הממוקם בתוך פתח המגנט. בסופו של דבר, ניתן להשיג נפחי דימוי תהודה מגנטית תלת-ממדיים המציגים תמונות מוח באיכות גבוהה המתאימות לפנוטיפינג של מבנים עיקריים ומשניים במוח העכבר. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו היסטולוגיה הוא שהיא משמרת את האנטומיה הגסה של הדגימות בתוך גולגולתם ומאפשרת כיסוי של המוח כולו וניתוח תלת-ממדי.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומים ביו-רפואיים, כגון הקשר בין גנים להבחנות אנטומיות המייצגות פנוטיפים במודל עכבר למחלה. בדרך כלל, חוקרים שאינם בקיאים בטכניקה זו יגלו כי לצורך דימות מוח בתפוקה גבוהה נדרשת פיתוח של מערכי סלילי רדיו-תדר וטעינת עכברים מותאמים אישית. השלב המאתגר ביותר, לפני תחילת פרוטוקול זה, הוא קבלת אישור לכל נהלי הטיפול בבעלי חיים מהוועדה המקומית לטיפול בבעלי חיים, מוועדת האתיקה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) או מהגוף המקביל במוסדכם, עבור נהלים ראשוניים כגון זיהוי ושקילה.

יש לבצע את ההקלטות של בעלי החיים תחת קבינה לבטיחות ביולוגית. לאחר מכן, העבירו את בעלי החיים למכל פלסטיק הניתן לעיקור באוטוקלב לצורך ההובלה לתא ההשראה של ה-MRI. הרדימו את בעלי החיים המיועדים לסריקה בתא ההשראה המחומם מראש באמצעות 4% ISO fluorine וארבעה ליטרים לדקה של חמצן.

החיות נחשבות למורדמות באופן מלא ברגע שהן אינן מגיבות לצביטה בכף הרגל. ניתן להסיר פרווה מחזה החיה באמצעות מסיר שיער כגון nare במידת הצורך, כדי להבטיח מגע טוב יותר עם מכשיר ה-ECG ומכשירי ניטור הטמפרטורה המובנים במזחלת המותאמת אישית. כמו כן, יש למרוח ISV כגון tears natural PMM על העיניים למניעת התייבשות, ולהחדיר כ-0.3 milliliters של סליין באמצעות הזרקה תת-עורית.

להידרציה של בעלי החיים. כעת יש להניח את העכברים על מטענים (sleds) אינדיבידואליים הכוללים גובות מובנות למדידת ECG, נשימה וטמפרטורה. יש להקפיד למקם את הגפיים הקדמיות והאחוריות בתוך השקעים הנמצאים במטענים.

במקרים בהם נדרש ניטור ECG, ודאו שהאזורים נטולי השיער בצדו התחתון של העכבר מיושרים עם אלקטרודות ה-ECG, קבעו כל חיה באמצעות רצועת ראש ורצועת אף, ולאחר מכן החליקו כל מזח לתוך מבחנה קונית בנפח 50 milliliter עם פתח פתוח. ניתן להכין עד שבעה עכברים חיים לסריקה בפעולת דימות אחת. לאחר מכן, הרכיבו את המבחנות הקוניות על מערך הטעינה.

יש לוודא שכל קווי הניטור הפיזיולוגי מחוברים לאחר שכל בעלי החיים הועמסו. הגדירו את רמת ה-isoflurane בתוך חור המגנט ל-2% ואת רמת החמצן לשמונה ליטרים לדקה. כעת העבירו את מערך ההעמסה אל המגנט ומקמו אותו על מערכת המסילות.

השתמשו במערכת המסילות כדי לחבר את מערך הטעינה לכוורת העכברים, שנועדה למקם את העכברים באופן אחיד בתוך כל סליל רדיו-תדר (RF) הממוקם במרכזו של חור המגנט. כאשר המערך מוכנס במלואו למגנט, מבחנות הצנטריפוגה ננעלות למערכת אספקת ההרדמה בתוך סלילי ה-RF כפי שניתן לראות כאן; ISOF פלואור מעורבב בחמצן מסופק מכוורת העכברים ואל הדגימה באמצעות צינור לאורך הציר של כל סליל בנפרד. תערובת גז הרדמה זו זורמת אל המבחנות מעבר לעכברים ונאספת על ידי יחידת שאיבה אקטיבית המחוברת לחלק האחורי של מערך הטעינה.

בהתאם למדדים הפיזיולוגיים של בעלי החיים, כגון נשימה וטמפרטורה, יש לקבוע את רמות ה-isoflurane בין 0.9 ל-2%. כעת, סרקו את בעלי החיים באמצעות רצף fast bin echo. משך כל סריקה תלת-ממדית הוא כשלוש שעות, עם רזולוציית תמונה נתונה של 125 micrometers. הקפידו לנטר את מדדי ה-ECG, הנשימה והטמפרטורה בכל בעל חיים לאורך כל מהלך הסריקה.

יש לשמור על חום גופם של בעלי החיים במהלך סשן הסריקה באמצעות זרימה של אוויר מחומם. עם השלמת הסריקה, הוצא את מערך הטעינה מהמגנט והנח אותו בתא אינדוקציה חם ממולא ב-100% oxygen. הוצא את בעלי החיים מהמבחנות והעבר אותם למכלים פלסטיים אטומים לצורך הובלה למbigcup בטיחות ביולוגית.

לבסוף, מקמו את בעלי החיים בכלוב חמים ללא זרימות אוויר ואפשרו להם להתאושש מההרדמה לצורך דימות exvivo של בעלי חיים. ראשית, הרדימו את בעלי החיים באופן מלא באמצעות הזרקה תוך-peritoneal של שילוב של ketamine ו-xylazine. לפני תחילת הפרפוזיה, העריכו את עומק ההרדמה הכירורגית באמצעות צביטה בבוהן או בכף הרגל.

פתחו את חלל בית החזה והחדירו מחט או סט עירוי עם כנפיים (safety winged infusion set) לתוך החדר השמאלי של הלב. לאחר מכן, גזרו את העליה הימנית כדי להתחיל פרפוזיה דרך הלב (trans cardiac perfusion). ראשית, בצעו שטיפה עם 30 milliliters של phosphate buffered saline בריכוז one x בטמפרטורת החדר, המעורבב עם one microliter per milliliter heparin ו-two millimolar protease inhibitors, בקצב זרימה של כ-100 milliliters per hour.

תהליך זה אמור להימשך כ-20 דקות. שלב הקיבוע הבא יבוצע עם 30 milliliters של 4% paraform aldehyde בטמפרטורת החדר, מעורבב עם 2 millimolar pro hands, בקצב של 100 milliliters לשעה. כעת יש לבצע דקפיטציה לבעל החיים ולהסיר את העור, הלסת התחתונה, האוזניים ואת קצה האף הסחוסית.

לאחר מכן, יש להניח את שאר מבנה הגולגולת ב-4% paraformaldehyde המעורבב עם two millimolar pro hands ולהשאיר למשך לילה בטמפרטורה של 4°C. למחרת, יש להעביר את הדגימה לתמיסה של 1x phosphate buffered saline, המעורבבת עם 0.02% sodium azide ו-two millimolar pro hands לצורך שימור. סריקת MRI תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה ב-7 Tesla צריכה להתבצע לאחר ארבעה ימים לפחות, אך לא לאחר יותר משני וחצי חודשים.

לאחר הפרפוזיה, מקמו את המוחות המיועדים לדימות במערך סלילי סולנואיד של 16 ערוצים והכניסו זאת לסורק. כעת, סרקו את הדגימות באמצעות רצף fast spin echo.

משך סריקה זו הוא כ-12 שעות, והתמונות הסופיות יהיו בעלות רזולוציה איזוטרופית של 32 micrometers. לאחר השלמת הסריקה, הוצא את הדגימות מסליל הדימות והנח כל גולגולת בתמיסת formalin 10% עם two millimolar pro hands לצורך שימור המייצג את המצב in vivo. כאן מוצגות תמונות מרובות של מוח עכבר מסריקה אחת שנמשכה שלוש שעות.

איור זה מציג שלושה צירי צפייה עבור כל אחד משבעת העכברים שנסרקו. כאן מוצגת תמונת מוח מייצגת ex vivo ברזולוציה איזוטרופית של 32 micron. וכאן ניתן לראות רינדור תלת-ממדי של נפח תמונה ex vivo לאחר עיבוד.

ניתן לבצע טכניקה זו in vivo תוך שלוש עד ארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי. חוקרים בתחומים ביו-רפואיים רבים יכולים להשתמש בטכניקה זו כדי לחקור מחלות כגון לופוס, מחלת هنتינגטון ומחלת אלצהיימר במודל עכברים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן ההדמיה של נבדקים חיים וקיבועים כדי להשיג תמונות מוח באיכות גבוהה באמצעות MRI.

תודה שצפיתם.