Name: התגבשות של חלבונים בממברנה ב Mesophases Lipidic (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: למדו שיטת LCP לגבישת חלבוני ממברנה באמצעות LCP-FRAP לזיהוי תנאים אופטימליים. הטכניקה מאפשרת קבלת גבישים באיכות דיפרקציה לקריסטלוגרפיית רנטגן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה בחלקים ידי מענקים NIH GM073197 ו RR025336.

מתווה טיפוסי בניסוי התגבשות טווינה מוצגת תמונה 1 1,2. טרום התגבשות LCP-FRAP מבחני הם אופציונליים, אך הם יכולים להאיץ באופן משמעותי את התהליך של חיפוש אחר התנאים התגבשות ראשונית, במיוחד במקרה של חלבונים בממברנה קשה 3. 1. חלבון הכינון של LCP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר חלבון קרום עניין בתמיסת דטרגנט ולרכז את חלבון / אבקת מתחמי ל ~ 10-20 מ"ג / מ"ל, נזהרת שלא מעל לרכז את 1,4 חומר ניקוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה ~ 25 מ"ג שומנים מארח LCP (בדרך כלל monoolein) או תערובת שומנים לתוך צינור פלסטיק 1.5 מ"ל ו לדגור על 40 מעלות צלזיוס למשך מספר דקות עד השומנים נמס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף מצמד המזרק מזרק 100 גז חזק μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את המזרק עם השומנים המותכת בעזרת פיפטה נפח מתכווננת. הקלט את עוצמת הקול של השומנים בתוך המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוד טען מזרק 100 μL עם פתרון חלבון ביחס חלבון פתרון ל-השומנים 2 / 3 v / נ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את שני מזרקים יחד דרך מצמד את המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Push המזרק בוכנות לחילופין להעביר את השומנים והחלבונים באמצעות מחט הפנימי של מצמד, הלוך וחזור, עד mesophase שומנים הופכת הומוגנית. LCP צורות באופן ספונטני על ערבוב מכני, הופך את החלבון מחדש ב bilayer השומנים של LCP. כינונה של LCP יכול להיות מאומת על ידי עקביות שקוף דמוי ג'ל שלה על ידי בהעדר birefringency כאשר מתחת למיקרוסקופ מצויד צולבות מקטבים, או, אם אפשר, באמצעות זווית קטנה רנטגן עקיפה 1. </li></ol> 2. LCP-FRAP טרום התגבשות מבחני LCP-FRAP מבחני נועדו למדוד את התכונות דיפוזיה של חלבונים בממברנה מחדש ב LCP במגוון של תנאי ההקרנה 3. דיפוזיה לטווח ארוך של חלבונים בממברנה של LCP חיונית התגבשות מוצלח, עם זאת, מיקרו של LCP מגביל דיפוזיה של חלבונים גדולים או אגרגטים חלבון oligomeric. סיבה נפוצה לכישלון של הניסוי התגבשות טווינה היא צבירת חלבון מהיר שמוביל לאובדן של דיפוזיה. הוכח כי התנהגות צבירה של חלבון תלוי לבניית חלבון מסוים, שומנים מארח את ההרכב של פתרון ההקרנה 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבל את החלבון עם פלורסנט לצבוע (Cy3 או דומה) ביחס חלבון / צבע של ~ 100 / 1, להסיר את צבען unreacted ולרכז את החלבון ל ~ 1 מ"ג / מ"ל. תווית או אמינים חינם או thiols חינם. כאשר תיוג אמינים ללא תשלום, לשימוש pH בין 7 ל 7.5 ברובה התווית בחינם N-הסופית. שים לב תיוג אמינו יכול גם תווית שומנים שיתוף מטוהרים עם חלבון 2,3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר את החלבון שכותרתו LCP כמתואר בסעיף 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת לוחות assay, כמתואר בסעיף 3) באמצעות LCP-FRAP פתרונות ההקרנה במקום מסכי התגבשות 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות ב 20 ° C בחושך במשך לפחות 12 שעות כדי להשיג מצב שיווי משקל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום אחד הלוחות בתחנת LCP-FRAP ולהתמקד הראשון גם באמצעות המטרה 10x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת 5 תמונות ניאון כדי ללכוד את המצב ההתחלתי מראש מולבן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טריגר הלייזר. כוח לייזר מספר פולסים צריך להיות מותאם אקונומיקה ~ 30 - 70% של חלבון הנקרא באמצע במקום מולבן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר מפעילה לייזר, להתחיל להקליט רצף מהיר שלאחר הלבנה של ~ 200 תמונות בקצב המהיר ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעל עם הקלטה של ​​רצף שלאחר אקונומיקה איטי של ~ 50 תמונות, בחירת עיכוב בין תמונות כמו 1-20 s, תלוי בקצב הדיפוזיה של החלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב את העוצמה בפנים במקום אקונומיקה במסגרות כל ולתקן אותה הלבנה ואור תנודות בעוצמה במהלך הרכישה על ידי חלוקת העוצמה בתוך המקום מולבן מעוצמת ממוצע של נקודה התייחסות מחוץ לאזור לייזר מולבן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נרמל את עוצמת לתקן כדי להפוך את עוצמת מראש מולבן שווה 1 ואת עוצמת מולבן הראשונית שווה 0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את העיקול של עוצמת זמן מנורמל לעומת, F (t), באמצעות המשוואה הבאה: 5 F (t) = M x exp (-2T / t) x (אני 0 (2T / t) + אני 1 (2T / t)), (Eq.1) שם M היא חלק ניידים של מולקולות לשדר, T הוא הזמן דיפוזיה אופייני, לא זה הזמן האמיתי של כל מסגרת מוקלט, אני 0 ואני 1 הם ה 0 ו 1 כדי רחוב שונה פונקציות בסל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את מקדם הדיפוזיה, D, כמו: D = R 2 / 4T, (Eq.2) כאשר R הוא רדיוס במקום מולבן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר לאo היטב הבא וחזור על שלבים 2.5) - 2.13). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השוואת שברים ניידים מקדמי דיפוזיה שהושגו על תנאי ההקרנה שונים. התגבשות עיצוב חדש המסכים המבוססים על רכיבים שאפשרו דיפוזיה חלבון ותנאי למעט עבורו דיפוזיה חלבון לא נצפתה. אם החלבון לא מפוזר בכל התנאים הוקרנו, שקול להרחיב את שטח הקרנה או מנסה חלבון חדש לבנות. </li></ol> 3. הגדרת ניסויים התגבשות LCP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלבון מחדש ב LCP כמתואר בסעיף 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את LCP חלבון עמוס לתוך מזרק 10 גז חזק μL מצורף מזרק מנפק חוזרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף מחט נשלף קצר (מד 26, 10 מ"מ אורך) כדי המזרק μL 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר על 200 פיתיונות מיובשים NL של LCP על פני השטח של ארבע בארות סמוכות ויוצרים ריבוע 2x2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסוי כל אחד פיתיונות מיובשים LCP עם μL 1 של התגבשות הפתרון המתאים למסך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שווי ארבע בארות עמוסה coverslip זכוכית 18 מ"מ מרובע. החלת לחץ עדין על coverslip לאטום את הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.4) -3.6) עם סט הבא של 4 הבארות עד צלחת כולו מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת בטמפרטורה קבועה, מעת לעת בדיקה ליצירת צמיחה קריסטל. </li></ol> 4. מסיק מן קריסטלים LCP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת עם גבישי חלבון תחת מיקרוסקופ סטריאופוני עם זום משתנה, מצויד מקטב מנתח מסתובב ליניארי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התמקד גם ריבית באמצעות זום צריכת חשמל נמוכה, כך גם כל מושם בתוך שדה הראייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציון הזכוכית coverslip בתוך ארבע משיכות עושה ריבוע בתוך גבולות גם באמצעות אבן הפינה החדה של חיתוך קרמיקה נימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ מסביב הבקיע עם פינצטה חדה נקודה חזקה כדי להפיץ את שריטות באמצעות עובי הזכוכית coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פאנץ שני חורים קטנים בפינות מול הכיכר הבקיע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק μL כמה פתרון נמהר דרך אחד החורים להפחית התייבשות במהלך השלבים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות בדיקה זווית מחט חדה לשבור את הכוס לאורך אחד או שני הצדדים לשחרר את הכיכר לחתוך החוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם בזהירות את צופה מרובע זכוכית בולוס השלב מעוקב. אם בולוס הוא דבק coverslip, ואז להפוך את הכיכר זכוכית מעל ומניחים על תחתית הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף μL מספר נוסף של פתרון נמהר, בתוספת cryo-מגנים, במידת הצורך, על גבי בולוס חשפו את השלב מעוקב בבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדל את ההגדלה של המיקרוסקופ ולהתמקד גביש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הזווית בין מקטב לבין מנתח להגדיל את הניגוד בין הגביש birefringent ואת הרקע, תוך שמירה על מספיק אור כדי לראות את הלולאה קציר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר MicroMount MiTeGen בקוטר התאמת גודל קריסטל ואז מסיק קריסטל ישירות LCP על ידי וגרף אותו לתוך MicroMount. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלאש להקפיא את MicroMount עם הגביש שנקטפו בחנקן נוזלי, ולשלוח אותו beamline מקור synchrotron עבור רנטגן איסוף הנתונים 6. </li></ol> 5. נציג תוצאות: בטא מהונדסים אדם 2 adrenergic G-חלבון קולטן מצמידים (β 2 AR-T4L) באה לידי ביטוי baculovirus sf9 נגועים בתאי חרקים מטוהרים ב dodecylmaltoside (DDM) / cholesteryl hemisuccinate (CHS) פתרון אבקת חייב אגוניסט הפוך חלקי carazolol 7. חלבון היה תווית עם אסתר NHS Cy3 בשימוש LCP-FRAP טרום התגבשות מבחני (איור 2). מסכי רשת גס מבוסס על כמה תנאים שנבחרו מתוצאות LCP-FRAP מבחני הפיק הראשוני קריסטל דמוי להיטים (איור 3). אופטימיזציה נוספת של התנאים נמהר הניבו איכות עקיפה גבישים (איור 4). <img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. תרשים זרימה של ניסוי LCP טיפוסי התגבשות. צעדים בתיבות אפור לא מתוארים בפרוטוקולים הנוכחי. <img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> 2. איור LCP-FRAP assay עם AR-T4L/carazolol 2 β ב LCP monoolein מבוסס. א) תוצאות של assay LCP-FRAP ביצע במצב תפוקה גבוהה אוטומטית, שבה כל דגימה של צלחת 96-גם הוא מחומצן ברצף והתאוששות הקרינה נמדדת לאחר דגירה 30 דקות. החלמה הקרינה שהתקבלו, המייצגים את השבר הנייד מדגם זה, הם זממו במשך כל 96 דגימות. פתרונות סינון מכילים 0.1 M טריס pH 8, 30% v / v PEG 400 בשילוב עם 48 מלחים שונים בשני ריכוזים שונים. ב) התאוששות פרופילים Fluorescence עבור נציג מספרresentative תנאים. עקומות קו מוצק מייצגים מתאים על ידי Eq. שברים ניידים 1.The ואת מקדמי דיפוזיה נקבעים באמצעות Eqs. 1 ו -2. התאוששות מהירה של פחות מ -10% במדגם המכיל כלוריד Na נובע שומנים שכותרתו fluorescently שיתוף מטוהרים עם החלבון. <img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. להיטים קריסטל ראשוניות של AR-T4L/carazolol 2 β מתקבל על ידי מיון רשת גס סביב התנאים המבטיחים ביותר שזוהה על ידי LCP-FRAP, המכיל סולפט Na (פאנל) ו Na Formate (לוח ב '). חלבון הוא תווית עם אסתר NHS Cy3 ותמונות פלורסנט נלקחים באמצעות עירור ב 543 ננומטר פליטה ב 605 ננומטר. <img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. גבישים אופטימליים של AR-T4L/carazolol 2 β. התמונות של גבישים גדל בנוכחות סולפט Na (לוחות A ו-B) ו-K Formate (פאנלים C ו-D) נלקח במצב brightfield (לוחות A ו-C) ושימוש צולבות מקטבים (לוחות B ו-D).

<ol><li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).</li>
<li>Cherezov, V., Abola, E., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+the+structure+determination+of+GPCRs%2C+a+membrane+protein+family+with+high+potential+as+pharmaceutical+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recent progress in the structure determination of GPCRs, a membrane protein family with high potential as pharmaceutical targets.</a> Methods Mol. Biol. 654, 141-170 (2010).</li>
<li>Cherezov, V., Liu, J., Hanson, M. A., Griffith, M. T., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LCP-FRAP+assay+for+pre-screening+membrane+proteins+for+in+meso+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cryst.+Growth+Design%22%5BJournal%5D)">LCP-FRAP assay for pre-screening membrane proteins for in meso crystallization.</a> J. Cryst. Growth Design. 8, 4307-4315 (2008).</li>
<li>Misquitta, Y., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergents+destabilize+the+cubic+phase+of+monoolein%3A+implications+for+membrane+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Detergents destabilize the cubic phase of monoolein: implications for membrane protein crystallization.</a> Biophys. J. 79, 394-405 (2003).</li>
<li>Soumpasis, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+analysis+of+fluorescence+photobleaching+recovery+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Theoretical analysis of fluorescence photobleaching recovery experiments.</a> Biophys. J. 41, 95-97 (1983).</li>
<li>Cherezov, V., Hanson, M. A., Griffith, M. T., Hilgart, M. C., Sanishvili, R., Nagarajan, V., Stepanov, S., Fischetti, R. F., Kuhn, P., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rastering+strategy+for+screening+and+centering+of+microcrystal+samples+of+human+membrane+proteins+with+a+sub-10+micrometer+size+X-ray+synchrotron+beam%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Rastering strategy for screening and centering of microcrystal samples of human membrane proteins with a sub-10 micrometer size X-ray synchrotron beam.</a> J. R. Soc. Interface. 6, S587-S597 (2009).</li>
<li>Cherezov, V., Rosenbaum, D. M., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Kuhn, P., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318, 1258-1265 (2007).</li>
<li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D. 60, 1795-1807 (2004).</li>
<li>Kissick, D. J., Gualtieri, E. J., Simpson, G. J., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+optical+imaging+of+integral+membrane+protein+crystals+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonlinear optical imaging of integral membrane protein crystals in lipidic mesophases.</a> Anal. Chem. 82, 491-497 (2010).</li>
<li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Lipids%22%5BJournal%5D)">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li>
<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+inexpensive+nanoliter-volume+dispenser+for+highly+viscous+materials+used+in+membrane+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Cryst%22%5BJournal%5D)">A simple and inexpensive nanoliter-volume dispenser for highly viscous materials used in membrane protein crystallization.</a> J. Appl. Cryst. 38, 398-400 (2005).</li>
<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast%2C+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Cryst%22%5BJournal%5D)">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).</li>
<li>Cherezov, V., Fersi, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+screens%3A+compatibility+with+the+lipidic+cubic+phase+for+in+meso+crystallization+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Crystallization screens: compatibility with the lipidic cubic phase for in meso crystallization of membrane proteins.</a> Biophys J. 81, 225-242 (2001).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

פרוטוקולים לספק הדרכה Visual Basic עבור שלבים עיקריים מעורבים בביצוע ניסויים טווינה התגבשות. מעמיק יותר פרטים הקשורים הפרוטוקולים הללו, תוך הדגשת החסרונות אפשרי, חסרונות או מסלולים חלופיים זמינים במקומות אחרים 1,2. אופציונלי LCP-FRAP מבחני יכול לעזור בשלבים מוקדם כדי לבחור את מבנה החלבון המבטיחים ביותר, שומנים LCP מארח ותוספים שומנים בדם, כמו גם להגביל את טווח מזרזים אפשרי ותנאי חיץ 3. לאחר ללהיט התגבשות ראשונית נמצא, הוא צריך להיות מותאם כדי להשיג גבישים באיכות טובה יותר. אופטימיזציה של בתנאים טווינה התגבשות דומה בעיקרו אופטימיזציה התנאים חלבונים מסיסים בתוספת פרמטרים נוספים הקשורים בהרכב LCP 1. חלבון ממברנה גבישים הגדלים mesophase lipidic הם בדרך כלל קטנים יותר מאשר לקבל גבישים בתמיסה חומרי ניקוי, אך הורה יותר, ובכך, הנאה מאוד מלהשתמש microfocus beamlines זמין המודרנית מקורות synchrotron 6. רבים מן הנהלים הקשורים ב התגבשות טווינה, כולל הגדרת לוחות התגבשות או assay, ניהול LCP-FRAP מבחני ואת גילוי גבישים, כבר למחצה או אוטומטי לחלוטין 1,2,8,9, המאפשר הקרנת מגוון גדול של תנאים בעוד לצרוך כמויות קטנות של חלבון ושומן. מצד שני, reconstitutions חלבון LCP והקציר קריסטל להישאר פעולות ידניות ומייגע יותר, ולכן יש צורך בשיפור.

<table><tbody><tr><td>מזרקה אטומה לגז בנפח 100 &amp;mu;L</td><td>Hamilton Co</td><td>7656-01</td><td>נדרשות 2 מזרקות</td></tr><tr><td>מזרקה אטומה לגז בנפח 10 &amp;mu;L</td><td>Hamilton Co</td><td>7653-01</td><td></td></tr><tr><td>מחבר מזרקות</td><td>Hamilton Co</td><td>7770-02 30902</td><td>ניתן להרכיב את המחבר מחלקים זמינים כפי שמתואר במקור 10</td></tr><tr><td>מתקן חלוקה חוזר למזרקה</td><td>Hamilton Co</td><td>83700</td><td>ניתן לשנות את מתקן החלוקה החוזר כדי להפחית את נפח החלוקה פי ~3&lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>מחט נתיקה קצרה (0.375&amp;#8221;) בעלת קצה שטוח (סגנון חוד 3, gauge 26)</td><td>Hamilton Co</td><td>7804-03</td><td></td></tr><tr><td>פלטת זכוכית מסוג sandwich בעלת 96 בארות</td><td>Marienfeld</td><td>08 900 03</td><td>לביצוע פעולות ידניות, נוח יותר להרכיב את פלטת ה-sandwich מזכוכית באמצעות זכוכיות מיקרוסקופ סטנדרטיות וסרט דביק דו-צדדי עם חורים מחוררים&lt;sup&gt;1,2,12&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית (coverslip)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63787-01</td><td></td></tr><tr><td>monoolein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7765</td><td></td></tr><tr><td>מסכי התגבשות</td><td>Hampton Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience</td><td></td><td>ניתן להשתמש ברוב המסכים המסחריים הזמינים לסריקה ראשונית. תנאים הגורמים לעיתים קרובות לפירוק של LCP ניתן לדלל פי 2 לשיפור התאימות&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>אבן לחיתוך קפילריה</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-334</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה בעלת חוד דק</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>510</td><td></td></tr><tr><td>גשושית (probe) חדה וזוויתית</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>13650</td><td></td></tr><tr><td>MicroMounts</td><td>MiTeGen</td><td>M1-Lxx-xx</td><td>יש לבחור את קוטר ה-MicroMount בהתאמה לגודל הגביש</td></tr></tbody></table>

התגבשות של חלבונים בממברנה ב mesophases lipidic

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

חלבונים ממברנה לבצע פונקציות קריטיות בתאים חיים הקשורים אותות, התמרה התחבורה טרנספורמציות אנרגיה, וככאלה, הם מעורבים במגוון רחב של תקלות ומחלות. עם זאת, הבנה מבניים ותפקודיים של חלבונים בממברנה הוא מאוד מפגר כי השותפים מסיסים שלהם, בעיקר, בשל קשיים הקשורים solubilization שלהם לדור של גבישים באיכות עקיפה. התגבשות ב mesophases lipidic (הידוע גם בשם ב התגבשות טווינה או LCP) היא טכניקה מבטיחה אשר יושמה בהצלחה להשיג מבנים ברזולוציה גבוהה של rhodopsins חיידקים, חלבונים פוטוסינתטיים, החיצוני בטא חביות הממברנה G-חלבון בשילוב קולטנים. בשנת טווינה התגבשות מנצל הסביבה יליד דמוי קרום ובדרך כלל מייצרת גבישי עם תוכן ממס נמוך יותר מזמין לעומת התגבשות מסורתיים פתרונות ניקוי. השיטה היא לא קשה, אבל דורש הבנה של התנהגות השומנים שלב ופרקטיקה בטיפול בחומרים mesophase צמיג. כאן אנו מדגימים דרך פשוטה ויעילה של עשיית LCP ואת ומשחזר חלבון הממברנה ב bilayer השומנים של LCP באמצעות מערבל מזרק, ואחריו מחלק מנות nanoliter של LCP לתוך assay או צלחת התגבשות, ביצוע מבחני טרום התגבשות והקציר גבישים מ המטריצה ​​LCP. פרוטוקולים אלה מספקים מדריך בסיסי מתקרב בניסויים טווינה התגבשות, אולם, כמו כל ניסוי התגבשות, הקרנת נרחב ואופטימיזציה נדרשים, ואת התוצאה המוצלחת אינה מובטחת בהכרח.

הפרוטוקולים מתארים את הצעדים החיוניים לקבלת איכות עקיפה גבישים של חלבון ממברנה החל הכינון מחדש של החלבון בשלב מעוקב lipidic (LCP), מציאת התנאים הראשוניים עם LCP-FRAP טרום התגבשות מבחני, הגדרת ניסויים התגבשות LCP וקריסטלים קציר .

התגבשות של חלבונים בממברנה ב Mesophases Lipidic

חלבונים ממברנתיים ממלאים תפקידים קריטיים בתאים חיים הקשורים להעברת אותות, להסעה ולהמרות אנרגיה, וככ таких, הם...

המטרה הכללית של הפרוצדורה הבאה היא להשיג גבישים באיכות גבוהה של חלבון ממברנה לצורך קביעת מבנה באמצעות קריסטלוגרפיית קרני X. דבר זה מושג על ידי שחזור של החלבון לתוך הממברנה של פאזה קובית ליפידית (lipidic cubic phase) ודגירה עם תמיסת משקיפה, אשר גורמת לגרעון ולצמיחה של גבישים הודות למרחב התגבשות רחב ומשוב מוגבל מניסויי התגבשות. בדיקת התגבשות באמצעות התאוששות פלואורסצנציה לאחר הלבנה פוטוכימית בפאזה קובית ליפידית, או LCP Frap Prec, פותחה כדי לבחור את תנאי ההתגבשות המבטיחים ביותר.בדיקה זו מפחיתה את כמות הסריקה ומגדילה את הסיכויים להשגת תוצאות ראשוניות של התגבשות. לאחר מציאת התוצאות הראשוניות, מוקמים ניסויי אופטימיזציה במטרה לשפר את גידול הגבישים. לבסוף, הגבישים שעברו אופטימיזציה נאספים והוקפאים בחנקן נוזלי לצורך איסוף נתונים במקור סינכרוטרון.התוצאות מראות את השימוש היעיל בבדיקת LCP FRA להשגת גבישים ראשוניים של BE two two adrenergic receptor ב-LCP, אשר אופטימיזציה נוספת שלהם הובילה לגבישים באיכות דיפרקציה. טכניקה זו מנצלת סביבת ממבנה דמוית סביבה טבעית המסופקת על ידי הפאזה הקובית החוזרת, ובדרך כלל מביאה לגבישים עם תכולת ממיס נמוכה וסדר טוב יותר בהשוואה לגביש ובתמיסות דטרגנטים. באופן כללי, אנשים שאינם מורגלים בשיטה זו יתקשרו בשל הצמיגות הגבוהה והתכונות ההיטאיניות של פאזות המסה של ליפידים, ההופכות את החומרים הללו לקשים לטיפול.עם זאת, כאשר משתמשים בכלים הנכונים ושולטים בטכניקה, הליך זה אינו קשה יותר מכל טכניקת התגבשות חלבונים אחרת, והוא מתאים לאוטומציה ולסריקה רחבה (high throughput). אז בואו נתחיל. טהרו את חלבון הממברנה הרלוונטי בתמיסת דטרגנט ורכזו את קומפלקסי החלבון-דטרגנט לריכוז של כ-10 עד 20 mg/mL.העבירו כ-25 milligrams של ליפיד מאח ב-LCP או תערובת ליפידים לתוך מבחנה מפלסטיק, והדגירו בטמפרטורה של 40 °C למשך מספר דקות עד להמסת הליפיד. לאחר מכן, חברו מחבר מזרק למזרק Gast tight בנפח של 100 µL. טענו את המזרק בליפיד המומס באמצעות פיפטה בעלת נפח מתכוונן.רשמו את נפח הליפידים במזרק; מלאו מזרק נוסף של 100 microliter בכמות מספקת של תמיסת חלבון כך שיתקבל יחס נפחי של שתיים עד שלוש בין תמיסת החלבון לליפידים. חברו את שני המזרקים באמצעות מחבר מזרקים. דחפו את בוכנות המזרקים לסירוגין כדי להעביר את הליפידים והחלבון הלוך וחזור דרך המחט הפנימית של המחבר, עד שהשלב המזו (meso phase) של הליפידים יהיה הומוגני.LCP נוצר באופן ספונטני בעקבות ערבוב מכני, והחלבון משתחזר בתוך השכבה הליפידית הכפולה של ה-LCP. ניתן לוודא את היווצרותו של ה-LCP על פי עקביותו השקופה והג'ל-ית, ועל פי היעדר ביריפרנג'נס (birefringence) בצפייה תחת מיקרוסקופ המצויד במקטבים מצטלבים, או במידת האפשר באמצעות דיפרקציית קרני X בזווית קטנה. כדי להתחיל בבדיקות FRAP של LCP, סמנו את החלבון בצבע פלואורסצנטי ביחס של כ-100 חלבונים לכל צבע, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.הסיר את הצבע הבלתי פעיל ורכז את החלבון לכ-1 mg/mL. לאחר מכן, שחזר את החלבון המסומן ב-LCP באופן דומה לדרך שבה שוחזר החלבון שאינו מסומן. הכן את לוחות הבדיקה.שימוש במעטפת LCP עבור תמיסאות סריקה. ראשית, העבירו את ה-LCP העמוס בחלבון למזרק אטום לגז בנפח 10 µL המחובר למפיק מזרקים חוזר, ולאחר מכן חברו מחט קצרה נתיקה למזרק ה-10 µL. הניחו בולוסים של 200 nL של LCP על פני ארבעה בארות סמוכות, כך שייווצר ריבוע של שתיים על שתיים; כסו כל אחד מבולוסי ה-LCP בנפח של 1 µL מתמיסת הסריקה המתאימה של LCP FRA.לאחר חלוקת תמיסת הסריקה, כסו את ארבעה הבארות הטעונות באמצעות זכוכית כיסוי ריבועית של 18 מילימטר. הפילו לחץ עדין על זכוכית הכיסוי כדי לאטום את הבארות. חזרו על תהליך זה עבור קבוצת ארבע הבארות הבאה עד למילוי הפלטה כולה.לאחר המילוי, כסו את הפלטה בנייר אלומיניום. דגרו את הפלטות בטמפרטורה של 20 °C למשך 12 שעות לפחות. כדי להגיע למצב של שיווי משקל, הניחו את אחת הפלטות בתחנת ה-LCP Frap ובצעו פוקוס על הבאר הראשונה באמצעות עדשה של 10x.רכישת נתוני ה-frap מבוצעת באופן אוטומטי באמצעות סקריפט של image pro, שבו המשתמש מזין תחילה את כל פרמטרי הרכישה ולאחר מכן לוחץ על כפתור ההפעלה. רצף רכישה טיפוסי מתחיל בהקלטה של חמישה תמונות טרום-הלבנה, לאחר מכן מפעיל את לייזר ההלבנה בסנכרון עם הזרמה של רצף התאוששות מהיר של כ-200 תמונות בקצב המהיר ביותר האפשרי, ואחריו צילום רצף התאוששות איטי של 50 תמונות במרווחים של שנייה אחת עד 20 שניות בין התמונות, בהתאם לקצב דיפוזיית החלבון. עם סיום איסוף הנתונים, יש לבצע אינטגרציה של העוצמה בתוך נקודת ההלבנה ובנקודות ייחוס שהוצבו מחוץ לאזור שהולבן בלייזר בכל הפריימים המתוקנים.עקומת העוצמה המשולבת עבור סטיות הנגרמות מתנודות של אור והלבנה במהלך רכישת הנתונים מנרמלת את העוצמה המתוקנת כך שהעוצמה לפני ההלבנה תהיה שווה לאחד והעוצמה הראשונית לאחר ההלבנה תהיה שווה לאפס; התאימו את עקומת העוצמה המנורמלת כנגד הזמן כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב כדי לקבל את החלק הנייד (mobile fraction) ואת מקדם הדיפוזיה. חזרו על הליך זה עבור הדגימות הבאות, והשוו את החלקים הניידים ומקדמי הדיפוזיה שהתקבלו עבור תנאי הסריקה השונים. תכננו מסכי התגבשות חדשים בהתבסס על הרכיבים שסייעו לדיפוזיית חלבונים, תוך הדרת תנאים שבהם לא נצפתה דיפוזיה של חלבון, כדי להקים ניסויי התגבשות LCP.שחזר את החלבון ב-LCP כפי שבוצע קודם לכן, ולאחר מכן הכן פלטות התגבשות כפי שנעשה עבור LCP frap, אך עם תמיססי סריקת התגבשות. לחלופין, ניתן להקים ניסויי התגבשות באופן רובוטי לאחר שהוכנו פלטות ההתגבשות; דגור אותן בטמפרטורה קבועה ובדוק באופן תקופתי את היווצרות הגבישים ואת צמיחתם. לאחר שגבישי החלבון צמחו, הנח פלטה עם הגבישים תחת מיקרוסקופ סטריאו בעל זום משתנה, המצויד במקטב מסתובב ליניארי ובאנליזר.התמקד בבאר הרלוונטית באמצעות זום בהגדלה נמוכה, כך שכל הבאר תהיה בתוך שדה הראייה. חרוץ את זכוכית כיסוי המיקרוסקופ בארבעה תנועות, כדי ליצור ריבוע בתוך גבולות הבאר, באמצעות פינה חדה של אבן חיתוך קרמית לקפילרות. לחץ סביב ההיקף החרוץ באמצעות פינצטה בעלת חוד חזק וחד כדי להעביר את השריטות דרך עובי הכיסוי.נקבו באמצעות זכוכית דקה שני חורים קטנים בפינות מנוגדות של הריבוע המסומן. מזריקו מספר מיקרוליטרים של תמיסת משקיעה דרך אחד החורים כדי להפחית התייבשות במהלך השלבים הבאים. באמצעות מחט חדה וזוויתית, שברו את הזכוכית לאורך צד אחד או שניים כדי לשחרר את הריבוע הגזור.הרם בזהירות את ריבוע הזכוכית תוך מעקב אחר בולוס הפאזה הקובית. הוסף במידת הצורך מספר מיקרוליטרים נוספים של תמיסת משקיע עם חומר קריו-פרוטקטור מעל בולוס הפאזה הקובית החשוף בבאר, הגדל את הגדלה של המיקרוסקופ ומקד את הפוקוס על גבי גביש. כוון את הזווית בין המקטב (polarizer) לבין האנלייזר כדי להגביר את הניגודיות בין הגביש לרקע, תוך שמירה על מספיק אור כדי לראות את לולאת הדגימה.לאחר מכן, הסירו את עודפי הליפידים ואספו את הגביש ישירות מה-LCP על ידי העברתו ל-mighty gen micro mount שנבחר כך שקוטרו יתאים לגודל הגביש. הקפיאו את ה-microm mount עם הגביש שנאסף בחנקן נוזלי ושלחו אותו לקו קרן של סנכרוטרון לצורך איסוף נתוני x-ray. קולטן בטא 2 אדרנרגי מהונדס סומן עם S SI three NHS ester ושימש בבדיקות pre-crystallization של LCP Frep במצב אוטומטי עם תפוקה גבוהה, שבהם כל דגימה בלוח של 96 בארות מולבנתה באופן סדרתי ואת התאוששות הפלואורסצנציה מודדים לאחר דגירה של 30 דקות. התאוששויות הפלואורסצנציה שהתקבלו, המייצגות את הפракציה הניידת בכל דגימה, מוצגות בגרף עבור כל 96 הדגימות.תמיסות הסריקה מכילות 0.1 molar tris pH eight ו-30% volume by volume PEG 400, בשילוב עם 48 מלחים שונים בשתי ריכוזים שונים. מוצגים פרופילי התאוששות של פלואורסצנציה עבור מספר תנאים מייצגים. עקומים בקו רצוף מייצגים התאמות של העוצמה הנורמלית לעומת זמן; התאוששות מהירה של פחות מ-10% בדגימה המכילה sodium chloride נובעת מליפידים המסומנים פלואורסצנטית.בניסיונות ראשוניים לסריקת גבישים של קו-פיוריפיקציה של ה-beta two adrenergic receptor במתחם עם olol, התקבלו פגיעות ראשוניות בסריקת רשת גסה סביב התנאים המבטיחים ביותר שזוהו ב-LCP Frap הכיל sodium sulfate ו-sodium formate. אופטימיזציה נוספת של תנאי המשקיע הניבה גבישים באיכות דיפרקציה. כאן, תמונות של גבישים שגדלו בנוכחות sodium sulfate ו-potassium formate צולמו במצב brightfield.ניתן לצפות באותם גבישים גם באמצעות מקטבים מצטלבים (cross polarizers). לאחר רכישת המיומנות, ניתן להשלים את השחזור של חלבון בפאזות קוביות של ליפידים תוך 10 עד 15 דקות, והקמה ידנית של פלטת התגבשות בעלת 96 בארות תוך שעה אחת. בדיקת L three B wrap במצב גבוה דורשת כשעתיים לכל פלטה של 96 בארות, וה-H crystal לוקח בערך 10 עד 20 דקות לכל בארה. הפרוצדורות המוצגות בסרטון זה מספקות מדריך בסיסי לביצוע ניסויי התגבשות של חלבונים.עם זאת, כפי שקורה בכל ניסוי התגבשות, נדרשים סריקה רחבה ואופטימיזציה, ותוצאה מוצלחת אינה מובטחת בהכרח.

crystallization-of-membrane-proteins-in-lipidic-mesophases

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בזאת הוא תיאר את ההליך מיושם קבוצת מבניים ותפקודיים ביולוגיה קאפרי ממברנה להגדיר באופן ידני ניסויים התגבשות של חלבונים בממברנה ב mesophases lipidic.

גיבוש חלבונים בממברנה עבור קביעת מבנה באמצעות Mesophases Lipidic

הערכת דו ממדי (2D) ניסויים התגבשות להקמת מערכי חלבון הורה הממברנה היא משימה קריטית מאוד קשה קריסטלוגרפיה אלקטרונים. כאן אנו מתארים את הגישה שלנו ההקרנה וזיהוי 2D גבישים של חלבונים בממברנה קטן בעיקר בטווח של 15 - 90kDa.

הערכת דו מימדי ניסויים התגבשות של חלבונים בממברנה קטנים ללימודי לביולוגיה מבנית על ידי קריסטלוגרפיה אלקטרונים

Bicelles הם תערובות שומנים / amphiphile כי לשמור על חלבונים בממברנה (הפרלמנט) בתוך bilayer השומנים אבל יש שלב התנהגות ייחודית המאפשרת תפוקה גבוהה סינון על ידי רובוטים התגבשות. טכניקה זו ייצרה בהצלחה מספר ברזולוציה גבוהה מבנים משני מקורות פרוקריוטים ו האיקריוטים. וידאו זה מתאר פרוטוקולים ליצירת תערובת lipidic bicelle, המאגדת חברי פרלמנט לתוך התערובת bicelle, הקמת crystallizations ניסויים (באופן ידני, כמו גם רובוט) וקריסטלים קצירת מן המדיום.

תפוקה גבוהה התגבשות של חלבונים בממברנה שימוש בשיטה Lipidic Bicelle

במסמך מתואר גישה רובוטית להתגבשות תפוקה גבוהה של חלבונים בממברנה בmesophases lipidic לשימוש בקביעת מבנה באמצעות קריסטלוגרפיה macromolecular ה-X. שלושה רובוטים המסוגל להתמודד mesophase הצמיג ודביק חלבון העמוס האינטגרלי לשיטה הם הציגו.

שימוש ברובוט להתגבשות תפוקה גבוהה של חלבונים בממברנה בMesophases Lipidic

במסמך מתואר נהלים המיושמים בממברנה קבוצת ביולוגיה המבנית ופונקציונלית לגבישי חלבון קרום קציר וcryo-מגניב שגודלו בשלבים עוקבים וספוג lipidic לשימוש בקביעת מבנה באמצעות קריסטלוגרפיה macromolecular רנטגן קאפרי.

קצירה וCryo-קירור גבישים של חלבונים בממברנה גדלו בMesophases Lipidic לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה Macromolecular

β חלבוני ממברנה חיצונית (OMPs) משרתים פונקציות רבות בתוך הממברנות החיצוניות של חיידקים גראם-שליליים, מיטוכונדריה וכלורופלסטים. כאן, אנו מקווים להקל על צוואר בקבוק ידוע במחקרים מבניים על ידי הצגת פרוטוקולים לייצור OMPs של β חביות בכמויות מספיקות לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן או ספקטרוסקופיה NMR.

מתוך בונה קריסטלים - לקראת מבנה קביעת β-חבית החיצון ממברנה חלבונים

אנו מתארים נהלים להכנה ואספקה של מיקרו-גבישי חלבון ממברנה בשלב מעוקב ליפידי עבור קריסטלוגרפיה סדרתית בלייזרים אלקטרונים חופשיים של קרני רנטגן ומקורות סינכרוטרון. ניתן ליישם פרוטוקולים אלה גם לשילוב ואספקה של מיקרו-גבישי חלבון מסיסים, מה שמוביל להפחתה משמעותית בצריכת הדגימה בהשוואה להזרקת נוזלים.

הכנה והגשת microcrystals חלבון בשלב lipidic מעוקב עבור קריסטלוגרפיה Femtosecond סידורי

שומנים חד-שכבתיים שימשו כבסיס ליצירת גבישי חלבון דו-ממדיים (דו-ממדיים) למחקרים מבניים במשך עשרות שנים. הם יציבים בממשק מי האוויר ויכולים לשמש כחומר תומך דק להדמיית אלקטרונים. כאן אנו מציגים את הצעדים המוכחים על הכנת monolayers השומנים למחקרים ביולוגיים.

הכנה לדוגמה באמצעות שיטת חד שכבתית שומנים למחקרים קריסטלוגרפיים אלקטרונים

פרוטוקול זה מתאר מערך להתגבשות של טרנספורטר הסטרול ABCG5/G8. ABCG5/G8 משוחזר לאופניים לצורך התגבשות טיפה תלויה. הפרוטוקול אינו דורש חומרים או מצעים מיוחדים, מה שהופך אותו לנגיש וקל להתאמה בכל מעבדה לקביעת מבנה החלבון באמצעות קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן.

התגבשות ABCG5/G8 בסביבת ביצלה ליפידית לקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן

נתאר שיטה אשר מודד את קינטיקה של תחבורה יון של חלבונים בממברנה לצד ניתוח אתר ספציפי של שינויים קונפורמציה באמצעות הקרינה על תאים בודדים. טכניקה זו ניתנת להתאמה תעלות יונים, מובילי משאבות יונים יכול להיות מנוצל כדי לקבוע מגבלות המרחק בין יחידות משנה חלבון.

בחינת Dynamics קונפורמציה של חלבונים בממברנה באתרו עם תיוג, האתר מכוון פלואורסצנטי

למדו שיטת LCP לגבישת חלבוני ממברנה באמצעות LCP-FRAP לזיהוי תנאים אופטימליים. הטכניקה מאפשרת קבלת גבישים באיכות דיפרקציה לקריסטלוגרפיית רנטגן.

התגבשות של חלבונים בממברנה ב Mesophases Lipidic

גלה סרטונים נוספים