פרופיל ניסוי Bioenergetic באמצעות C2C12 תאים Myoblast

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבחון את המצב התפקודי של מיטוכונדריה בתאים חיים ובמיטוכונדריה מבודדת, על ידי מדידת פרמטרים מרובים של מטבוליזם חמצוני באמצעות אנליזר הזרימה החוץ-תאית XF 96. פרמטרים אלו הם נשימה בסיסית, מחזור ATP, דליפת פרוטונים ונשימה מקסימלית או קיבולת נשימתית רזרבית. דבר זה מושג על ידי הוספה רצפית של מודולטורים ספציפיים של נשימה מיטוכונדריאלית לתאי מיובלאסט C2C12, ומדידת השינוי בקצב צריכת החמצן, או OCR, המהווה אינדיקטור לנשימה, והמרת גלוקוז ללקטט, התהליך המייצר ATP באמצעות גליקוליזה.

נתיב האנרגיה המרכזי השני בתאים נמדד אף הוא כ-ECAR או קצב החמצתו החוץ-תאי (extracellular acidification rate). ניתן לקבל תוצאות של פרופיל מיטוכונדריאלי המספקות תובנה לגבי התפקיד המרכזי שממלא התפקוד המיטוכונדריאלי בקביעת אורך החיים של תאים. שלום, שמי דייוויד ניקולס.

הייתי חוקר של מיטוכונדריה לאורך כל הקריירה שלי, והמכשיר החשוב ביותר שבו השתמשתי במחקרי היה אלקטרודת חמצן. אם ניתן למדוד את קצב צריכת החמצן בתנאים שונים עם מיטוכונדריה מבודדת, ניתן להשיג מידע רב וחשוב. כאשר עוברים לעבוד עם תאים, ובמיוחד תאים המגודלים בלוח עם מספר בארות או על זכוכית כיסוי, שיטות קלאסיות אינן יעילות.

זוהי בעיה מרכזית, אשר נפתרה לפני מספר שנים באמצעות פיתוח בדיקת לוחיות רב-בארים המאפשרת לנו לחקור את נשימת התאים במקביל בפורמט של לוחית רב-בארים. מה שתראו היום הוא ניסוי פשוט מאוד אך עשיר במידע, אותו תכננו כדי לנטר תפקוד ביואנרגטי מיטוכונדריאלי בסיסי בתאים מתורגבים. כדי להתחיל, זרעו תאים בלוחיות תרבית תאים XF 96 בריכוז של 10,000 תאים לבאר ב-100 µL של מצע גידול, והניחו אותם באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם 10% CO2.

ניתן לבצע את הבדיקה של התאים ב-XF 96, 24 שעות לאחר הזריעה באמצעות הבדיקה. ה-Wizard יוצר תבנית עם פריסת הקבוצות הבאה: עמודות 1 עד 12 כולן מכילות 10,000 תאי C two C 12.

קבוצה אחת בכחול משמשת כתאי בקרה. לקבוצה השנייה באדום ינתנו התרופות oligo Mycin, FCCP ו-roone. לאחר מכן, הכין את התרכובות במצע בדיקה מסוג X-F-D-M-E-M כפי שמתואר בחלק הכתוב של הפרוטוקול.

Oligo Mycin, FCCP ו-rotention ידועים. תרכובות אלה מוגשות מראש בערכה לבדיקת מאמץ מיטוכונדריאלי (MIT stress test kit) של XF cell. באמצעות תחנת ההכנה של XF, החליפו את מצע הגידול במצע הרצה מסוג DMEM.

לבסוף, דגרו את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ללא פחמן דו-חמצני למשך 60 דקות, כדי לאפשר לתאים להגיע לשיווי משקל עם תווך הבדיקה לפני הוספת התרכובות להזרקה למחסנית החיישן. חממו את התרכובות לטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, טענו אותן לפתחי ההזרקה באופן הבא: עבור עמודות אחת עד ארבע, טענו 16, 18 ו-20 µL של תווך בדיקת XF או DMEM לפתחים A, B ו-C בהתאמה.

עבור עמודות חמש עד 12, טענו 16 µL של oligamycin לתוך פורט A, 16 µL של FCCP לתוך פורט B, ו-20 µL של rotenone לתוך פורט C. לאחר מכן, הגדירו את הפרוטוקול: הגדירו את ה-Commands set loop לשלוש פעמים, את ה-Mix לשלוש דקות ואת ה-Measure לשלוש דקות. לבסוף, לחצו על start.

פעלו לפי ההוראות על המסך, שינחו את המשתמש מתי להטעין את המחסנית עם השלמת הכיול. עקבו אחר הנחיות המשתמש והוסיפו את פלטת התאים עבור הניסוי. לאחר מכן לחצו על המשך ואפשרו לבדיקה לרוץ.

הוצא את הפלטה עם סיום הניסוי. בדיקה זו נגזרת מהניסוי הקלאסי לאפיון תפקוד מיטוכונדריאלי ומשמשת כמסגרת לבניית ניסויים מורכבים יותר שמטרתם להבין השפעות של תרכובות שונות על מטבוליזם של תאים, תפקוד מיטוכונדריאלי ופעילויות ביואנרגטיות כלליות. כאן צפינו בתגובה הצפויה בקצב צריכת החמצן בעוד התאים טופלו בכל סדרת תרכובות.

עבור liga Mycin, רמת ה-Oard פחתה כתוצאה מחסימת סינתזת TP בקומפלקס מיטוכונדריאלי חמישי. מכיוון שהתאים לא היו מסוגלים לסנתז TP באמצעות זרימה חמצונית (oxidative phosphorylation) לאחר טיפול ב-liga mycin, הם חזרו להסתמך על גליקוליזה כדי לספק את דרישתם ל-TP. לפיכך, הבחנו בעלייה ב-ECAR, קצב החמצת הנוזל החוץ-תאי, המהווה אינדיקטור לגליקוליזה כפי שהודגם בעבר. FCCP פועל כחומר מבטל צימוד (uncoupling agent) ומסיר את ההגבלה על כניסה חוזרת של פרוטונים.

הנשימה מאיצה וכעת היא מוגבלת על ידי הובלת האלקטרונים. לבסוף, rote known מעכב את קומפלקס 1 המיטוכונדריאלי, דבר הגורם להפסקת זרימת האלקטרונים בשרשרת הובלת האלקטרונים, ובכך צריכת החמצן פחתה באופן דרמטי. כאן מתקבל מידע על הנשימה הבסיסית של התאים, אחוז צריכת החמצן המוקדש לייצור ATP, וכן הכמות המוקדשת לשמירה על מפלס הפרוטונים עקב דליפת פרוטונים.

בנוסף, אנו עשויים לקבל את קצב הנשימה המקסימלי בתנאים של נשימה לא מצומדת (uncoupled respiration), המכונה לעיתים קיבולת נשימה רזרבית (spare respiratory capacity). ולבסוף, אנו יכולים לקבוע את כמות צריכת החמצן שאינה נובעת מתהליכים מיטוכונדריאליים. הרגע ראיתם זאת באמצעות ה-seahorse.

XF 96, סדרה של ניסויים המספקת כמות עצומה של מידע על האנרגטיקה הביו-אנרגטית (BIE) של המיטוכונדריה בתא. הניסוי הבסיסי, שהוא כה חשוב, נקרא ניסוי מספר אחת, והוא מספק מידע על נשימה בסיסית, מחזור ATP, דליפת פרוטונים מיטוכונדריאלית וקיבולת נשימה רזרבית. פרמטרים אלו מספקים מידע יסודי על המצב הביו-אנרגטי של המיטוכונדריה בתא.