Name: פרופיל ניסוי Bioenergetic באמצעות C2C12 תאים Myoblast (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-06T16:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: למד פרופיל ביואנרגטי של מיטוכונדריה בתאי C2C12 Myoblast באמצעות ניתוח זרימה חוץ-תאית XF 96. שיטה זו מודדת נשימה בסיסית, תחלופת ATP ודליפת פרוטונים לחקר מטבוליזם תאי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

בניסוי זה, C2C12 תאים myoblast הם זורעים בצפיפות נתון בתא צלחות סיהורס תרבות. צריכת החמצן הבסיסי (OCR) ו - תאיים (ECAR) שיעורי החמצה נמדדים להקים שיעורי הבסיס. 1. הזרקת תאים התאים מטבולית מוטרד שלוש תוספות של תרכובות שונות (ברצף), כי השינוי פרופיל bioenergetic של התא. קבוצה אחת תשמש לשלוט, עם מפעיל תקשורת נוסף בשם "תרכובות" שליטה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזריקה הראשונה היא oligomycin. Oligomycin מעכב את סינתזת ATP על ידי חסימת ערוץ פרוטון של synthase o F חלק ATP (V Complex). במחקר המיטוכונדריה, הוא משמש כדי למנוע מצב 3 (phosphorylating) והנשימה. עם תאים, זה יכול לשמש כדי להבדיל את אחוז צריכת O2 מוקדש סינתזה ATP ואחוז צריכת O2 צורך להתגבר על דליפת פרוטון טבעי על פני קרום המיטוכונדריה הפנימית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזריקה השנייה היא FCCP. FCCP (קרבוניל ציאניד-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone) הוא ionophore כי היא נושאת יונים ניידים. זהו סוכן שיחררה כי זה משבש סינתזה ATP על ידי העברת יוני מימן על פני קרום המיטוכונדריה במקום ערוץ פרוטון של ה-ATP synthase (V Complex). זו קריסה של פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה מוביל לצריכה מהירה של אנרגיה וחמצן בלי דור ה-ATP. במקרה זה, הן OCR ו ECAR יגדל, OCR בשל שיחררה ו ECAR כמו תאים הניסיון לשמור על איזון האנרגיה שלהם באמצעות הגליקוליזה ליצירת ATP. טיפול FCCP ניתן להשתמש כדי לחשב את קיבולת "לחסוך" הנשימה של תאים מוגדר כהפרש בין כמותי OCR מבוקרת מירבית OCR הבסיס הראשוני. הוצע כי החזקת יכולת הנשימה חלק חילוף גם בתנאים של גירוי פיזיולוגי או pathophysiological המקסימלי הוא גורם מרכזי בהגדרת חיוניות ו / או ההישרדות של תאים. היכולת של התאים להגיב ללחץ בתנאים של הביקוש לאנרגיה מוגברת היא בחלקה הגדול מושפע קיבולת bioenergetic של המיטוכונדריה. יכולת זו היא להרתיע bioenergetic-ממוקש על ידי מספר גורמים, כולל היכולת של התא כדי לספק מצע אל המיטוכונדריה ואת היכולת התפקודית של אנזימים המעורבים אלקטרון התחבורה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב הזריקה השלישית, rotenone, מעכב קומפלקס אני, הוא הוסיף את התאים. זה יכבה הנשימה המיטוכונדריאלי ולאפשר הן שברים המיטוכונדריה ולא המיטוכונדריה לתרום הנשימה להיות מחושב. אחת יהיה לצפות לירידה OCR בשל תפקוד לקוי של המיטוכונדריה, עם עלייה מקבילה ECAR כתא עובר למצב glycolytic יותר על מנת לשמור על מאזן האנרגיה שלה Rotenone הוא מעכב המיטוכונדריה שמונע את העברת האלקטרונים ממרכז Fe-S במתחם אני אל ubiquinone (אנזים Q). זה עיכוב של קומפלקס אני מונע את האנרגיה הפוטנציאלית של NADH מלהיות להמיר אנרגיה שימושית בצורה של ה-ATP. </li></ol> 2. ריאגנטים חומרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Oligomycin, FCCP, פתרונות Rotenone (סיהורס מבחן מיטו ערכת מתח) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DMEM ריצה מדיה (סיהורס # 100965-000) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DMSO (Sigma D8418) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מים מזוקקים (Gibco 15230-170) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיול חוצץ (סיהורס Bioscience) </li></ol> 3. צמיחה בינונית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 500 מ"ל DMEM (Gibco 11965-092) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> FBS 10% (Hyclone SH90070.03) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 מ"ל פן / סטרפטוקוקוס (Gibco 15140-122) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 מ"ל Pyruvate נתרן (Sigma S8636) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 מ"ל Glutamax (Gibco 35050-061) </li></ol> 4. מתזמן פרוטוקול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים הם זרע XF96 צלחות בתרביות תאים עם 10,000 תאים / היטב μL 100 של מדיום הגידול והושמו 37 ° C חממה עם 10% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים תדבק את הצלחת XF96 תרבית תאים תוך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Assay תאים XF96 24 שעות לאחר זריעה. </li></ol> 5. הכנת תבנית Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אשף Assay (נספח א '), ליצור תבנית עם פריסת הקבוצה הבאה: <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. פריסת רשת ובכן זיהוי משימות טור קבוצה </li></ol> 6. מתחם הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין את תרכובות הבאים XF DMEM Assay התקשורת כדלקמן: 10 Oligomycin אממ, אממ FCCP 30.0, 20.0 Rotenone מיקרומטר, ריכוזים אלה מייצגים את דילול 10X כי ייעשה כאשר תרכובות מוזרקים לתוך הבאר. ריכוזי העובדים הם: 1 Oligomycin אממ, 3.0 UM FCCP, Rotenone 2.0 מיקרומטר </li></ol> 7. מדיה שינוי הכנה Cell <o style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת על תא Prep XF תחנה <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הנפח הסופי של בינוני עד μL 160 דולר גם כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 37 ° C חממה ללא CO 2 למשך 60 דקות כדי לאפשר לתאים טרום לאזן עם המדיום assay. </li> 8. טוען מחסנית חיישן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרכובות חם 37 ° C לפני טעינת מחסנית חיישן עומס תרכובות ליציאות מזרק כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טורים 1-4: טען 16, 18, 20 μL של XF Assay מדיה (DMEM) לתוך היציאות A, B ו-C, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עמודות 5-12: טען 16 μL של Oligomycin לתוך יציאות טען 18 μL של FCCP לתוך יציאות B טען 20 μL של Rotenone לתוך יציאות C </li></ol></li></ol> 9. פרוטוקול פקודות <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פקודה </td><td> זמן (דקות) </td><td> נמל </td></tr><tr><td> לדרג </td><td></td><td></td></tr><tr><td> לאזן </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Loop התחלה </td><td> 3X </td><td></td></tr><tr><td> לערבב </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> חכה </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> למדוד </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Loop End </td><td></td><td></td></tr><tr><td> להזריק </td><td></td><td> </td></tr><tr><td> Loop התחלה </td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td> לערבב </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> חכה </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> למדוד </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> להזריק </td><td></td><td> ב </td></tr><tr><td> Loop התחלה </td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td> לערבב </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> חכה </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> למדוד </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> להזריק </td><td></td><td> ג </td></tr><tr><td> Loop התחלה </td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td> לערבב </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> חכה </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> למדוד </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> סוף </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 1. טבלת פרוטוקול פקודות </o>

<ol><li>Choi, W. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+analysis+of+isolated+cerebrocortical+nerve+terminals+on+a+microgram+scale%3A+spare+respiratory+capacity+and+stochastic+mitochondrial+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure.</a> J Neurochem. 109, 1179-1191 (2009).</li>
<li>Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+the+bioenergetic+reserve+capacity+in+response+to+cardiomyocyte+stress+induced+by+4-hydroxynonenal%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal.</a> Biochem J. 424, 99-107 (2009).</li>
<li>Liu, J., Cao, L., Chen, J., Song, S., Lee, I. H., Quijano, C., Liu, H., Keyvanfar, K., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmi1+regulates+mitochondrial+function+and+the+DNA+damage+response+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bmi1 regulates mitochondrial function and the DNA damage response pathway.</a> Nature. , 459-7245 (2009).</li>
<li>Malmgren, S., Nicholls, D. G., Taneera, J., Bacos, K., Koeck, T., Tamaddon, A., Wibom, R., Groop, L., Ling, C., Mulder, H., Sharoyko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+coupling+between+glucose+and+mitochondrial+metabolism+in+clonal+beta-cells+is+required+for+robust+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Tight coupling between glucose and mitochondrial metabolism in clonal beta-cells is required for robust insulin secretion.</a> J Biol Chem. 284, 32395-32404 (2009).</li>
<li>Dranka, B. P., Hill, B. G., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+reserve+capacity+in+endothelial+cells%3A+The+impact+of+nitric+oxide+and+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial reserve capacity in endothelial cells: The impact of nitric oxide and reactive oxygen species.</a> Free Radic Biol Med. 48, 905-914 (2010).</li>
<li>Perez, J., Hill, B. G., Benavides, G. A., Dranka, B. P., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cellular+bioenergetics+in+smooth+muscle+cell+proliferation+induced+by+platelet-derived+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Role of cellular bioenergetics in smooth muscle cell proliferation induced by platelet-derived growth factor.</a> Biochem J. 428, 255-267 (2010).</li>
<li>Morán, M., Rivera, H., Sánchez-Aragó, M., Blázquez, A., Merinero, B., Ugalde, C., Arenas, J., Cuezva, J. M., Martín, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+bioenergetics+and+dynamics+interplay+in+complex+I-deficient+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial bioenergetics and dynamics interplay in complex I-deficient fibroblasts.</a> Biochim Biophys Acta. , 1802-185 (2010).</li>
<li>Cárdenas, C., Miller, R. A., Smith, I., Bui, T., Molgó, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+regulation+of+cell+bioenergetics+by+constitutive+InsP3+receptor+Ca2%2B+transfer+to+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Essential regulation of cell bioenergetics by constitutive InsP3 receptor Ca2+ transfer to mitochondria.</a> Cell. , 142-142 (2010).</li>
</ol>

מינימום וו, לעמוד בו ג&#39;נסן, ג&#39;ורג&#39; וו רוג&#39;רס, ודוד א Ferrick עובדים של סוסון ים Bioscience, המייצרת ריאגנטים ומכשור הוצגו במאמר זה.

Assay זה נגזר הניסוי הקלאסי לחקור תפקוד המיטוכונדריה ומשמש כמסגרת שבה לבנות ניסויים מורכבים יותר להבנת שינויים שונים מטבוליזם התא, תפקוד המיטוכונדריה, ו bioenergetics הכוללת. תרכובות כל שימוש בניסוי זה צריך להיות מותאם ריכוז המספק את האפקט המרבי. כלומר, יש לבצע ניסויים טיטרציה נפרד לברר את הערכים הללו. זה חשוב במיוחד עם FCCP, כמו עקומת טיטרציה נוטה להיות חריף למדי, FCCP יותר מדי בעצם יכול להפחית תגובות OCR. טווחי אופיינית (ריכוזים הסופי) כדי לבדוק את תהיה: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.1-1.0 UG / mL של Oligomycin </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.1-5.0 אממ FCCP </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.1-1.0 Rotenone UM </li></ul> שים לב כי כל התגובות מתחם לעיל (במיוחד FCCP) יושפע הרכב assay התקשורת (סוג הבסיס, [גלוקוז], [pyruvate], נוכחות / היעדרות של BSA, וכו '). יתר על כן, אם הרכב מדיה XF assay משתנה, אופטימיזציה יהיה צורך לבצע מחדש. נוכחות וריכוז pyruvate חשוב במיוחד בהשגת יכולת הנשימה מירבית בשל FCCP. סוסון ים Bioscience יש לצפות במספר שורות תאים השמטה של ​​pyruvate מבטלת את היכולת של התאים להגיב מקסימאלי (מעל הבסיס) כדי FCCP. בדרך כלל, ריכוזי pyruvate mM 1-10 צריך להיבדק כדי להבין את ריכוז אופטימלי של pyruvate להשיג נשימה מקסימאלית. שים לב [pyruvate] ו [גלוקוז] ייתכן שיהיה צורך "לחצות טיטרציה" כדי להשיג את המדיה תנאים אופטימליים עבור הניסוי. תוצאות אופייניות של ניסוי זה מוצגים להלן גרף המציגים OCR לעומת זמן ועוד זמן מול המראה ECAR: <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> 2. איור OCR זמן לעומת <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> 3. איור ECAR זמן לעומת כאן ראינו את התגובות הצפויות OCR ו ECAR כמו תאים מטופלים עם כל תרכובת רצופים. עבור oligomycin, OCR פוחתת כתוצאה חסימת סינתזת ה-ATP על קומפלקס המיטוכונדריה V. מכיוון שהתאים אינם מסוגלים לסנתז ATP דרך OXPHOS, הם לחזור הגליקוליזה כדי לענות על הביקוש שלהם עבור ה-ATP, ולכן אנו צופים גידול ECAR. כפי שהראינו לעיל, FCCP פועל כסוכן שיחררה את סוגר. מכיוון שתאי חייב עכשיו להתגבר על דליפת פרוטון על פני קרום המיטוכונדריה הפנימית, OCR מגדילה באופן משמעותי כמו O2 יותר נצרך כדי לשאוב את עודף פרוטונים חזרה דרך הממברנה של המיטוכונדריה. לבסוף, אני מעכב rotenone המיטוכונדריאלי קומפלקס מורכב III, בהתאמה, אשר גורם לזרימת האלקטרונים להפסיק את שרשרת הובלת האלקטרונים, ולכן הצריכה של O2 מצטמצם באופן דרסטי. <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. נשימה פרמטרים מעבר לשינויים הצפויים הנשימה ECAR, מספר פרמטרים הנשימה ניתן לקבל נתונים אלה. זה מסוכם באיור לעיל: כאן אנו רואים כי אנו עשויים לקבל מידע על הנשימה הבסיס של התאים, אחוז צריכת O2 מוקדש ייצור ATP, כמו גם את הסכום המוקדש שמירה על שיפוע פרוטון (H + עקב דליפה). יתר על כן, אנו עשויים לקבל את קצב הנשימה מקסימלית בתנאים הנשימה זוגיים (המכונה לעתים יכולת הנשימה כמו חילוף) ולבסוף, אנו יכולים לקבוע את כמות הצריכה O2 לא בשל תהליכי המיטוכונדריה. מספר הולך וגדל במהירות של מחקרים הם המעסיקים את הפרופיל של המיטוכונדריה להעריך bioenergetics הסלולר, לזהות תפקוד המיטוכונדריה ו לחזות את היכולת של התאים להגיב על הלחץ ו / או עלבונות. למידע ופרטים נוספים על שיטה זו ניסיוניים את הרעיון של יכולת הנשימה חילוף, ראה להפנות את הפרסומים הבאים 1-8.

<table><tbody><tr><td>תמיסות Oligomycin, FCCP, Rotenone ו-Antimycin A</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td>ערכה לבדיקת מאמץ מיטוכונדריאלי של Seahorse</td></tr><tr><td>מצע הרצה DMEM</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100965-000</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>מים מזוקקים</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15230-170</td><td></td></tr><tr><td>בופר כיול</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

פרופיל ניסוי bioenergetic באמצעות c2c12 תאים myoblast

Bioenergetic Profile Experiment using C2C12 Myoblast Cells

היכולת למדוד את חילוף החומרים הסלולר להבין תפקוד המיטוכונדריה, אפשרה למדענים ברחבי העולם כדי לקדם את המחקר שלהם בהבנת תפקידה של פונקציה המיטוכונדריה בהשמנה, רעילות, סוכרת הזדקנות, סרטן, תפקוד בטיחות לב וכלי דם. מטבוליזם נייד הוא תהליך של ספיגת המצע, כגון חמצן, גלוקוז, חומצות שומן, גלוטמין ו, ו המרת אנרגיה בהמשך באמצעות סדרה של חמצון מבוקר enzymatically ותגובות הפחתה. התוצאה אלה תגובות ביוכימיות תאיים בייצור של ה-ATP, על שחרורו של תוצרי לוואי חום כימיים, כגון לקטט ו-CO 2 לתוך הסביבה תאיים. תובנה חשובה המדינה הפיזיולוגיות של תאים, ועל שינוי של מצב של תאים אלה, ניתן להשיג באמצעות מדידת שיעור החמצן הנצרכת על ידי התאים, אינדיקטור הנשימה המיטוכונדריאלי - שיעור צריכת חמצן - או OCR. תאים גם ליצור ATP דרך הגליקוליזה, כלומר: המרה של גלוקוז אל לקטט, עצמאית של חמצן. בבארות תרבותי, חומצת החלב הוא המקור העיקרי של פרוטונים. מדידת חומצת חלב המיוצר בעקיפין באמצעות פרוטונים שוחרר לתוך המדיום תאיים המקיף את התאים, אשר גורם החמצה של המדיום מספק את שיעור Extra-Cellular החמצה - או ECAR. בניסוי זה, C2C12 תאים myoblast הם זורעים בצפיפות נתון בתא צלחות סיהורס תרבות. צריכת החמצן הבסיסי (OCR) ו - תאיים (ECAR) שיעורי החמצה נמדדים להקים שיעורי הבסיס. התאים אז מטבולית מוטרד שלוש תוספות של תרכובות שונות (ברצף), כי השינוי פרופיל bioenergetic של התא. Assay זה נגזר בניסוי הקלאסי להעריך המיטוכונדריה ומשמש כמסגרת שבה לבנות ניסויים מורכבים יותר להבנת תפקוד פיזיולוגי הן pathophysiologic של מיטוכונדריה לחזות את היכולת של התאים להגיב על הלחץ ו / או עלבונות.

תיאור של השיטה עבור פרופיל תפקיד המיטוכונדריה בתאים מסופק. הפרופיל המיטוכונדריה שנוצר מספק ארבעת הפרמטרים של הפונקציה המיטוכונדריה כי ניתן למדוד בניסוי אחד: קצב הנשימה הבסיסי, ה-ATP צמודות הנשימה, דליפה פרוטון, ויכולת מילואים.

פרופיל ניסוי Bioenergetic באמצעות C2C12 תאים Myoblast

היכולת למדוד מטבוליזם תאי ולהבין תפקוד לקוי של מיטוכונדריה אפשרה למדענים ברחבי העולם להקדם את מחקרם ב...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבחון את המצב התפקודי של מיטוכונדריה בתאים חיים ובמיטוכונדריה מבודדת, על ידי מדידה של פרמטרים מרובים של מטבוליזם חמצוני באמצעות ה-XF 96 extracellular flux analyzer. פרמטרים אלו הם נשימה בסיסית, מחזור ATP, דליפת פרוטונים ונשימה מקסימלית או קיבולת נשימה רזרבית. דבר זה מושג על ידי הוספה רציפה של מודולטורים ספציפיים של נשימה מיטוכונדריאלית לתאי myoblast מסוג C2C12, ומדידת השינוי בשיעור צריכת החמצן, או OCR, המהווה אינדיקטור לנשימה, והמרת גלוקוז ללקטט, המייצרת ATP באמצעות גליקוליזה.נתיב האנרגיה המרכזי השני בתאים נמדד גם הוא כ-ECAR או קצב החמצות חוץ-תאי. ניתן לקבל תוצאות של פרופיל מיטוכונדריאלי המספקות תובנה לגבי התפקיד המרכזי שפונקציית המיטוכונדריה ממלאת בקביעת תוחלת החיים של תאים. שלום, שמי דייוויד ניקולס.הייתי חוקר של מיטוכונדריה לאורך כל הקריירה שלי, והציוד החשוב ביותר שבו השתמשתי במחקרי היה אלקטרודת החמצן. אם ניתן למדוד את קצב צריכת החמצן בתנאים שונים עם מיטוכונדריה מבודדת, מקבלים מידע רב וחשוב. כאשר עוברים לעבוד עם תאים, במיוחד תאים המגודלים בלוחית רב-בארים או על זכוכית כיסוי, השיטות הקלאסיות אינן יעילות.זוהי בעיה מרכזית, שהופסקה לפני מספר שנים באמצעות פיתוח של בדיקת פלטות רב-בארים (multi-well plate assay), המאפשרת לנו לחקור את נשימת התאים במקביל בפורמט של פלטת רב-בארים. מה שתראו היום הוא ניסוי פשוט מאוד אך עשיר במידע, אותו תכננו כדי לנטר תפקוד ביו-אנרגטי מיטוכונדריאלי בסיסי בתאים בתרבית. כדי להתחיל, זרעו תאים בפלטות תרבית תאים XF 96 בריכוז של 10,000 תאים לבאר ב-100 µL של מצע גידול, והניחו באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם 10% CO2.ניתן לבצע בדיקה של התאים ב-XF 96, 24 שעות לאחר הזריעה באמצעות הבדיקה. ה-Wizard יוצר תבנית עם פריסת הקבוצות הבאה. עמודות 1 עד 12 מכילות כולן 10,000 תאי C two C 12.קבוצה אחת בכחול משמשת כתאי ביקורת. לקבוצה שנייה באדום יוענקו התרופות oligo Mycin, FCCP ו-roone. לאחר מכן, הכין את התרכובות בתווך בדיקה X-F-D-M-E-M כפי שמתואר בחלק הכתוב של הפרוטוקול.Oligo Mycin, FCCP, rotenone ידועים. תרכובות אלו מחולקות מראש בערכת XF cell MIT stress test. באמצעות תחנת ההכנה XF prep station, החליפו את מצע הגידול במצע הרצה DMEM.לבסוף, דגרו את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ללא פחמן דו-חמצני למשך 60 דקות כדי לאפשר לתאים להגיע לשיווי משקל עם מדיום הבדיקה לפני הוספת התרכובות להזרקה למחסנית החיישן; חממו את התרכובות ל-37 °C. לאחר מכן, טענו אותן לפתחי המזרק באופן הבא: עבור עמודות אחת עד ארבע, טענו 16, 18 ו-20 µL של מדיום XF assay או DMEM לפתחים A, B ו-C בהתאמה.עבור עמודות חמש עד 12, טען 16 µL של oligomycin לתוך יציאה A, 16 µL של FCCP לתוך יציאה B, ו-20 µL של rotenone לתוך יציאה C. לאחר מכן, הגדר את פקודות הפרוטוקול: קבע את הלולאה (loop) לשלוש פעמים, ערבוב (mix) לשלוש דקות ומדידה (measure) לשלוש דקות. לבסוף, לחץ על start.עקבו אחר ההוראות על המסך, שינחו את המשתמש מתי להטעין את המחסנית עם סיום הכיול. פעל לפי הנחיות המשתמש והוסף את פלטת התאים עבור הניסוי. לאחר מכן לחץ על המשך ואפשר לבדיקה לרוץ.הוצא את הפלטה כאשר הניסוי הסתיים. בדיקה זו נגזרת מהניסוי הקלאסי לאפיון תפקוד מיטוכונדריאלי ומשמשת כמסגרת לבניית ניסויים מורכבים יותר שמטרתם להבין השפעות של תרכובות שונות על חילוף החומרים בתא, על התפקוד המיטוכונדריאלי ועל פעילויות ביו-אנרגטיות כלליות. כאן צפינו לתגובה הצפויה בקצב צריכת החמצן בעוד התאים טופלו בכל רצף של תרכובות.עבור ליגמיצין (oligomycin), רמת ה-ATP פחתה כתוצאה מחסימת סינתזת ATP בקומפלקס המיטוכונדרי החמישי. מכיוון שהתאים לא היו מסוגלים לסנתז ATP באמצעות חמצון פוספורילציה לאחר הטיפול בליגמיצין, הם חזרו להשתמש בגליקוליזה כדי לספק את דרישתם ל-ATP. לפיכך, הבחנו בעלייה ב-ECAR, קצב החמצצת החוץ-תאית, המהווה אינדיקטור לגליקוליזה כפי שהודגם בעבר. FCCP פועל כחומר מפקיע (uncoupling agent) ומסיר את המגבלה על כניסת הפרוטונים חזרה.הנשימה מאיצה וכעת היא מוגבלת על ידי הובלת האלקטרונים. לבסוף, rotenone מעכב את קומפלקס 1 המיטוכונדריאלי, דבר הגורם להפסקת זרימת האלקטרונים בשרשרת הובלת האלקטרונים, ובכך צריכת החמצן הופחתה באופן דרמטי. בדרך זו מתקבל מידע על הנשימה הבסיסית של התאים, אחוז צריכת החמצן המוקדש לייצור ATP, וכן הכמות המוקדשת לשמירה על מפל הפרוטונים עקב דליפת פרוטונים.יתרה מכך, אנו עשויים לקבל את קצב הנשימה המקסימלי בתנאים של נשימה לא מצומדת (uncoupled respiration), המכונה לעיתים קיבולת נשימה רזרבית (spare respiratory capacity). ולבסוף, אנו יכולים לקבוע את כמות צריכת החמצן שאינה נובעת מתהליכים מיטוכונדריאליים. ראיתם זאת כעת באמצעות ה-seahorse.XF 96, סדרת ניסויים המספקת כמות עצומה של מידע על האנרגטיקה הביו-אנרגטית (BIE) של המיטוכונדריה בתא. הניסוי הבסיסי, שהוא כה חשוב, נקרא על ידינו ניסוי מספר אחת, והוא מספק מידע על נשימה בסיסית, מחזור ATP, דליפת פרוטונים מיטוכונדריאלית וקיבולת נשימה רזרבית. פרמטרים אלו מעניקים מידע בסיסי על המצב הביו-אנרגטי של המיטוכונדריה בתא.

bioenergetic-profile-experiment-using-c2c12-myoblast-cells

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אמצעי לא פולשני להערכת ההצלחה של השתלה והיצמדות מתואר. השיטה מנצלת את גן כתב היתוך מאוחד המורכבים של גנים אשר ביטוי ניתן הדמיה בשיטות הדמיה שונות. הנה, אנחנו עושים שימוש...

מולקולרית והדמיה ליעד בתאים שריר מושתלים

גליקוליזה היא סמן מטבולי מגדיר במערכות ביולוגיות מרובות. ניטור גליקוליזה על ידי מדידת השטף החוץ-תאי של H+ הוא נפוץ, אך דורש תיקון כמותי וחד משמעי. כאן, אנו מדגימים כיצד לאסוף ולתקן נתוני שטף חוץ-תאי כדי להבחין בין מקורות נשימתיים וגליקוליטיים של החמצה חוץ-תאית.

מדידה וניתוח של תאי ייצור חומצה לקביעת glycolytic דרג

בפרוטוקול זה, אנו מציגים את ההליכים בהקמת מודלי myoblast myotonic ניוון 1, כוללים תחזוקת תא מותאם C2C12, transfection גן / תמרה, והבחנת myocyte.

דוגמנות Myotonic ניוון 1 בתאים C2C12 myoblast

המיטוכונדריה תא האנדותל היא קריטית כדי לשמור על שלמות דם-מוח-מכשול. אנחנו מציגים את פרוטוקול למדידת תפקוד bioenergetic בתאי האנדותל של כלי דם מוחיים.

הערכה של תפקוד Bioenergetic בתאי האנדותל מוחות דם

חקר חילוף החומרים הופך רלוונטי יותר ויותר למחקר אימונולוגי. כאן, אנו מציגים שיטה אופטימלית למדידת גליקוליזה ונשימה מיטוכונדריאלית בטחול עכברים, ולימפוציטים T ו-B.

פרוטוקול אופטימיזציה כדי לנתח הגליקוליזה מיטוכונדריאלי הנשימה לימפוציטים

המטרה של פרוטוקול זה היא לפקח spectrophotometrically טרנס-פלזמה ממברנה אלקטרון תחבורה ניצול אלקטרון חוץ-תאית acceptors לנתח אנזימטי אינטראקציות העלולות להתעורר עם אלה acceptors אלקטרון חוץ-תאית.

מדידת הטרנס-פלזמה ממברנה אלקטרון תעבורה על-ידי C2C12 Myotubes

אנו מספקים פרוטוקול כדי להפיל גנים מטריקס קידוד מטריצות (ECM) חלבונים ב C2C12 myoblasts באמצעות סיכת ראש קטן (sh) RNA. פילוח ADAMTSL2 כדוגמה, אנו מתארים את השיטות לאימות היעילות של הנוק-אין, חלבון, ורמת הסלולר במהלך C2C12 myoblast כדי לאפשר בידול צינור.

יציבה מנוק של גנים הקידוד מיקתאי מטריקס חלבונים ב C2C12 Myאובלסט התא באמצעות סיכת ראש קטן (sh) RNA

בדיקת שטף מטבולי של תאים בזמן אמת מודדת את קצב צריכת החמצן ואת קצב ההחמצה החוץ-תאית, המתאים לייצור אדנוזין טריפוספט מיטוכונדריאלי וגליקוליטי, באמצעות חיישני pH וחמצן. כתב היד מסביר שיטה להבנת מצב האנרגיה של אוסטאובלסטים ואפיון ופרשנות של המצב הביו-אנרגטי התאי.

שימוש במנתח שטף מטבולי של תאים בזמן אמת לניטור ביו-אנרגיה של אוסטאובלסט

המצב המטבולי של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית האנושית (H-RPE) משקף את בריאותם ותפקודם. מוצג כאן פרוטוקול אופטימלי לבחינת שטף מטבולי בזמן אמת של H-RPE באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה.

ניתוח בזמן אמת של ביואנרגטיקה בתאי אפיתל פיגמנט רשתית ראשוניים בבני אדם באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה

תאי דם חד-גרעיניים היקפיים מבודדים יכולים לשמש לניתוח של תפקודים והפרעות חיסוניות, מחלות מטבוליות או תפקודים מיטוכונדריאליים. בעבודה זו, אנו מתארים שיטה סטנדרטית להכנת PBMCs מדם שלם ושימור בהקפאה לאחר מכן. שימור בהקפאה הופך את הזמן והמקום הזה לעצמאיים.

שימור קריוגני והערכה ביואנרגטית של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי אנושי

למד פרופיל ביואנרגטי של מיטוכונדריה בתאי C2C12 Myoblast באמצעות ניתוח זרימה חוץ-תאית XF 96. שיטה זו מודדת נשימה בסיסית, תחלופת ATP ודליפת פרוטונים לחקר מטבוליזם תאי.

פרופיל ניסוי Bioenergetic באמצעות C2C12 תאים Myoblast

גלה סרטונים נוספים