איסוף משתנה ריכוז מקורר באופן איזוטרמי Calorimetry טיטרציה מערכי נתונים על מנת לקבוע מנגנונים הכבילה

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לזהות את המודל הפיזי הנכון המתאר את קישור המקרומולקולה לליגנד שלה ולקבוע את הפרמטרים התרמודינמיים הקשורים לכך. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הכנת תמיסת מקור של המקרומולקולה באמצעות דיאליזה נרחבת. לאחר מכן, הליגנד הרלוונטי מומס בבופר הדיאליזה הסופי, ובשלב השני נקבעים הריכוזים של כל הרכיבים.

דגימות המקרומולקולה והליגנד מדוללות בזהירות לסדרה של ריכוזים שונים. לאחר מכן, מבוצעת סדרה של ניסויי קלורימטריה של טיטורה איזותרמית, או ITC, בריכוזים שונים של הליגנד והחלבון, כדי להפיק סדרה של איזותרמות ITC בשלב הסופי של הפרוטוקול. ניתוח גלובלי של סדרת הניסויים מבוצע באמצעות מודלים פיזיקליים שונים, והמודל המניב את ההתאמה הכללית הטובה ביותר מזוהה כנכון.

היום אדגים לכם שיטה שיכולה לסייע במענה על שאלות ביופיזיקליות, כגון האופן שבו מולקולות חלבון נקשרות לליגנדים שלהן, ויכולה לספק מדדים מדויקים של פרמטרי קישור כגון אנตรופיה, אנטלפיה וקבועי אסוציאציה. לפני תחילת הפרוטוקול, טהרו את החלבון המבוקש; המקרומולקולה המשמשת בהדגמה זו היא immuno GLYCOSIDE N six prime, a subtle transferase one I או C six prime one I. כדי להתחיל, הכינו ארבעה ליטרים של בופר דיאליזה קררו אותם ל-4 °C. לאחר מכן, בצעו דיאליזה לנפח קטן של תמיסת המקרומולקולה.

במקרה זה, חמישה מיליליטר של 400 micromolar AAC C six prime, one eye ב-1.3 liters של בופר דיאליזה בטמפרטורה של 4 °C. ניתן לבצע זאת בחדר קירור או במקרר, להחליף לבופר טרי מדי שמונה שעות ולבצע דיאליזה שלוש פעמים בסך הכל. שמור את תמיסת הדיאליזה הסופית.

סננו 750 milliliters של תמיסת הדיאליזה הסופית דרך מסנן צלולוז של 0.45 micron ואחסנו בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius. בופר זה, אשר יכונה כעת בופר הרצה (running buffer), ישמש לשטיפות וכמדלל. עבור הדגימות, שטפו ביסודיות מסנן מזרק של 0.2 micron באמצעות בופר הרצה.

יש להניח את דגימת החלבון ולסנן. יש לאסוף בעדינות את הדגימה לשפופרת קונית לפני אחסון תמיסת החלבון, ולקבוע את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת חלבון סטנדרטית. במקרה זה, ריכוז החלבון נמדד על ידי ספיגה (ABSORBENCE) ב-280 ננומטרים וריכוז האנזים מחושב.

תוך שימוש במקדם הכחדה שהופק משרת הפרוטאומיקה EXI, אחסנו את החלבון באופן שימקסם את היציבות לטווח ארוך. יש לאחסן את AAC C six prime one eye בטמפרטורה של 4 °C מאחר שהוא אינו שומר על פעילותו לאחר הקפאה והפשרה. לאחר מכן, המיסו את הליגנד ואת באפר ההרצה. לצורך הדגמה זו, 4 mg של acetyl coenzyme A הומסו ב-200 µL של באפר הרצה כדי להכין תמיסת סטוק בריכוז 25 mM.

ניתן לאחסן ליגנד זה בטמפרטורה של 78- מעלות צלזיוס עד למועד השימוש. להכנת דגימות ה-ITC, ראשית, חשבו את ריכוז האנזים כדי להגיע לערך C של 64, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב עבור AAC six prime one I. דבר זה תואם לריכוז של 192 micromolar. הכינו תמיסה של 2 milliliters של המקרו-מולקולה בריכוז זה, על ידי דילול תמיסת המלאי ב-running buffer מסונן של FIA settle co-enzyme a. הפשיר את תמיסת ה-acetal coenzyme a באמבט קרח ומים. לאחר שהתמיסה של ה-acetal co-enzyme a הופשרה, ערבבו בעדינות. חשבו את ריכוז תמיסת הליגנד על ידי הכפלת ריכוז המקרו-מולקולה במספר אתרי הקשירה וב-10.

הכינו תמיסת acetyl co-enzyme A על ידי הוספת 80 µL מתמיסת המלאי של ACE co-enzyme A בריכוז 25 mM ל-420 µL של running buffer וערבוב. העבירו את תמיסת ה-acetyl co-enzyme ACE המדוללת לשפופרת מילוי של פפטה והחזירו את שארית תמיסת המלאי בריכוז 25 mM לטמפרטורה של 78- °C לאחסון. בצעו ניקוי גזים (Degas) לתמיסות a C six prime one eye ו-acetyl co-enzyme A תחת ואקום למשך חמש דקות בטמפרטורה של 19 °C, שהיא מעלה אחת פחות מטמפרטורת ההפעלה הרצויה בניסוי.

להכנת מזרק ההזרקה, הכניסו את המזרק דרך מחזיק מזרקים עד שמהדק המזרק המותקן מראש נמצא באותו גובה של המחזיק. החליקו את מהדק המזרק השני מעל מזרק ההזרקה עד שיהיה לחוץ בחוזקה אל תחתית מחזיק המזרקים. הדקו בעדינות את המהדק באמצעות מפתח אלן עם ראש כדורי של 0.05 inch המצורף.

בשלב הבא, מקמו את מחזיק המזרק בתוך מחזיק הפיפטה. החליקו בעדינות את מחליף הפיפטה לתוך מזרק ההזרקה וודאו שקצה הבוכנה נכנס ישירות לחור של המזרק. לאחר ההחדרה המלאה, הבריגו את טבעת הנעילה של מחזיק המזרק לתוך מחליף הפיפטה.

לפני טעינת תמיסת דגימת החלבון A a C six prime one eye, השתמשו במערכת שטיפת התאים המסופקת עם המכשיר כדי לשטוף את תא הדגימה עם לפחות 50 milliliters של בופר הרצה. הסירו את הבופר הנותר מתא הדגימה באמצעות שאיבה עם מזרק זכוכית של 2.5 milliliter בעל מחט ארוכה. הסירו את התמיסות מוואקום ניקוי הגזים באמצעות מחט ארוכה, נקייה ויבשה שנייה.

מזרק של 2.5 מיליליטר. שאבו בזהירות כמות מינימלית של 1.8 מיליליטר מדגימת החלבון A a C six prime one eye אל תוך המזרק. הימנעו מהיווצרות בועות אוויר.

לאחר שהמזרק טעון בדגימת החלבון, הכניסו את המחט לתא הדגימה וגעו בעדינות בתחתית התא. הרימו את המחט בכ-1 מילימטר והזריקו בעדינות את הדגימה לתא עד שנוזל עודף ייראה מעל חלקו העליון של תא הדגימה. כדי לשטוף את התא מבועות אוויר כלואות, הרימו את המחט בכ-1 סנטימטר תוך וידוא שהתמיסה נשארת בחלק העודף, ושאבו והזריקו במהירות כ-0.25 מיליליטר מהתמיסה.

כעת החליקו בעדינות את המחט כלפי מעלה לאורך דופן פיתח הנטיפה (overflow). בבאר הדגימה, המחט תפגוש מדף. שאבו את כל הנוזל שמעל מדף זה, שכן המדף מצביע על הגובה הרצוי עבור תמיסת ההרצה.

כדי למלא את מזרק ההזרקה, חברו את מזרק השאיבה עם צינור הפלסטיק אל פתח המילוי והורידו את קצה הבוכנה עד לראש פתח המילוי. כעת, מקמו את צינור מילוי הפ pipette של תמיסת הליגנד של DGAs בתחתית מחזיק הפיפטה. ודאו שקצה המזרק אינו נוגע בתחתית צינור המילוי, ושאבו לאט את התמיסה אל תוך המזרק עד שכמות קטנה תיכנס לצינור של מזרק הטעינה.

בשלב הבא, סגרו את פתח המילוי על ידי הורדת קצה הבוכנה. פעולה זו מתבצעת באמצעות לחיצה על כפתור סגירת פתח המילוי. לאחר מכן, הסירו בועות אוויר שייתכן וכלואו במהלך הטעינה.

בצעו ריקון ומילוי על ידי לחיצה על כפתור ה-purge refill. חזרו על פעולת הריקון והמילוי סך הכל שלוש פעמים. עם סיום תהליך הריקון והמילוי, הוציאו את צינור המילוי מתושבת הפיפטה ונגבו בעדינות את קצה המזרק בעזרת נייר ספיגה למעבדה.

כעת הורד את המזרק של מכלול הפיפטה אל תוך הדגימה. יש לנהוג בזהירות ולהמשיך באיטיות, שכן המחט עלולה להתכופף בקלות. ודא שהמזרק מוכנס במלואו על ידי לחיצה על בסיס טבעת הנעילה.

לאחר קיבוע המזרק, הגדירו את טמפרטורת העבודה הרצויה ובחרו הספק ייחוס הגבוה במעט מזרימת החום המקסימלית הצפויה בזמן ההזרקה. בדוגמה זו, נעשה שימוש ב-20 degrees Celsius כטמפרטורת העבודה וב-20 micro calories per second כהספק הייחוס. לאחר מכן, תכננו את נפחי ההזרקה וההשהיות הרצויות.

כאן נעשה שימוש ב-28 הזרקות, כאשר להזרקה הראשונה נפח של 2 µL והשהיה של 62, ולהזרקות העוקבות נפח של 10 µL עם השהיות של 332. הניסוי המוצג כאן מהווה את הבסיס ליצירת מערך נתונים בריכוז בודד, לצורך יצירת העקומות הנוספות הדרושות. חזרו על תהליך זה עם ריכוזים נמוכים יותר של המקרומולקולה והליגנד.

יש לוודא שכל דגימות המקרו-מולקולות והליגנדים מגיעות מאותו תמיסת מאגר כדי למזער שגיאות בריכוזים. מוצג כאן עקומת המדידה הגולמית של קלורימטריה של טיטרציה איזותרמית שהתקבלה מהטיטרציה של 3.86 millimolar של הליגנד acetyl coenzyme A לתוך 192 micromolar של המקרו-מולקולה A A C six prime one.

ערכים משולבים מהעין שימשו לקביעת פרמטרי הקשירה באמצעות התאמה רצופית לשני אתרים. גרף זה מציג את האיזותרמות שנוצרו באמצעות ITC של ריכוזים משתנים של ACE Coenzyme A ו-AAC C six Prime One Eye. הנתונים הניסיוניים, המיוצגים על ידי עיגולים פתוחים, הותאמו הן למודל של שתי קבוצות אתרים בלתי תלויות והן למודל רצופי של שני אתרים.

הסכמה טובה יותר נצפית במודל הרצפי של שני האתרים. ריכוזי החלבון שבהם נעשה שימוש מוגדרים בטקסט הנלווה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לדייק מאוד בדילול, שכן שינוי בריכוזים עלול להשפיע באופן דרסטי על התוצאות.