איסוף משתנה ריכוז מקורר באופן איזוטרמי Calorimetry טיטרציה מערכי נתונים על מנת לקבוע מנגנונים הכבילה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות את המודל הפיזיקלי הנכון המתאר את הקישור של מקרומולקולה לליגנד שלה ולקבוע את הפרמטרים התרמודינמיים הנלווים. זה מושג על ידי הכנת תמיסת מלאי של המקרומולקולה באמצעות דיאליזה נרחבת. לאחר מכן ממיסים את הליגנד המעניין במאגר הדיאליזה הסופי והריכוזים של כל הרכיבים נקבעים בשלב השני.

דגימות המקרומולקולה והליגנד מדוללות בזהירות לסדרה של ריכוזים שונים. לאחר מכן, סדרה של ניסויי קלורימטריית טיטרציה איזותרמית, או ITC מבוצעת במספר ריכוזים של ליגנד וחלבון כדי לייצר סדרה של איזותרמי ITC בשלב האחרון של ההליך. ניתוח גלובלי של סדרת הניסויים מבוצע באמצעות מודלים פיזיקליים שונים והמודל שנותן את ההסכמה הכוללת הטובה ביותר מזוהה כנכון.

היום אראה לכם שיטה שיכולה לעזור לענות על שאלות ביופיזיקליות כמו כיצד מולקולות חלבון קושרות את הליגנדים שלהן ויכולה לספק מדדים מדויקים של פרמטרי קשירה כגון אנטרופיה, אנטרופיה וקבועי אסוציאציה לפני תחילת פרוטוקול זה. טהר את החלבון המעניין המקרומולקולה המשמשת בהדגמה זו היא GLYCOSIDE N חיסוני שש ראשוני, טרנספראז עדין אחד I או C שש ראשוני אחד I.To להתחיל, להכין ארבעה ליטר חיץ דיאליזה ולהתקרר לארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, דיאליזה של נפח קטן של תמיסת מקרומולקולה.

במקרה זה, חמישה מיליליטר של 400 מיקרו-מולרי AAC C שש פריים, עין אחת ב-1.3 ליטר חיץ דיאליזה בארבע מעלות צלזיוס. ניתן לעשות זאת בחדר קירור או במקרר, להחליף עם מאגר טרי כל שמונה שעות ולבצע דיאליזה בסך הכל שלוש פעמים. שמור את פתרון הדיאליזה הסופי.

סנן 750 מיליליטר מתמיסת הדיאליזה הסופית דרך מסנן תאית של 0.45 מיקרון ואחסן בארבע מעלות צלזיוס. מאגר זה, המכונה כעת המאגר הפועל, ישמש לשטיפות וכמדלל. עבור הדגימות, יש לשטוף היטב מסנן מזרק 0.2 מיקרון עם מאגר פועל.

החל את דגימת החלבון וסנן. אסוף בעדינות את הדגימה בצינור חרוטי לפני אחסון תמיסת החלבון, קבע את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת חלבון סטנדרטית. במקרה זה, ריכוז החלבון נמדד על ידי ABSORBENCE ב-280 ננומטר וריכוז האנזים מחושב.

באמצעות מקדם הכחדה שנוצר מהשרת הפרוטאומי EXI, אחסן את החלבון באופן שימקסם את היציבות לטווח ארוך. יש לאחסן AAC C שש עיניים ראשוניות בארבע מעלות צלזיוס מכיוון שהיא אינה שומרת על פעילות לאחר הקפאה והפשרה לאחר מכן המיסה את הליגנד ואת המאגר הפועל. לצורך הדגמה זו, ארבעה מיליגרם של אצטיל קואנזים A הומסו ב-200 מיקרוליטר של מאגר רץ כדי ליצור תמיסת מלאי של 25 מילי-מולאר.

ניתן לאחסן ליגנד זה במינוס 78 מעלות צלזיוס עד שהוא מוכן לשימוש להכנת דגימות ה-ITC, ראשית, חשב את ריכוז האנזים כדי לקבל ערך C של 64 כמתואר בפרוטוקול הכתוב עבור AAC שש ראשוני אחד I. זה מתאים לריכוז של 192 מיקרומולר. הכן תמיסה של שני מיליליטר של המקרומולקולה בריכוז זה, ודלל את תמיסת המלאי עם המאגר הרץ המסונן FIA ליישב קו-אנזים הפשרה, הקו-אנזים האצטי תמיסה באמבט מי קרח. לאחר הפשרת תערובת הקו-אנזים האצטלית, חשב בעדינות את ריכוז תמיסת הליגנד על ידי הכפלת ריכוז המקרומולקולה במספר אתרי הקישור כפול 10.

הכן את הקו-אנזים אצטיל תמיסה על ידי הוספת 80 מיקרוליטר של קו-אנזים ACE 25 מילי-מולרי, תמיסת מלאי ל-420 מיקרוליטר של מאגר רץ וערבוב. העבירו את תמיסת ACE הקו-אנזים המדולל אצטיל לתוך צינור מילוי פיפטה והחזירו את תמיסת המלאי הנותרת של 25 מילי-מולר למינוס 78 מעלות צלזיוס לאחסון. Degas a C שש ראשוני עין אחת וקו-אנזים עדין, A תמיסות תחת ואקום למשך חמש דקות ב-19 מעלות צלזיוס, שהיא מעלה אחת מתחת לטמפרטורת הריצה הרצויה של הניסוי.

כדי להגדיר את מזרק ההזרקה, הכנס את המזרק דרך מחזיק מזרק עד שהמזרק המותקן prem clamp יהיה באותו גובה כמו המחזיק. הזינו את מהדק המזרק השני מעל מזרק ההזרקה עד שהוא נלחץ היטב לתחתית מחזיק המזרק. הדק בעדינות את ה-clamp עם כונן המשושה הכדורי המצורף בגודל 0.05 אינץ'.

לאחר מכן, הנח את מחזיק המזרק לתוך מחזיק הפיפטה. החלק בעדינות את מזרק הפיפטה לתוך מזרק ההזרקה וודא שקצה הבוכנה מוזן ישירות לתוך חור המזרק. לאחר הכנסתו במלואו, הברג את צווארון הנעילה של מחזיק המזרק לתוך מזרק הפיפטה.

לפני טעינת תמיסת דגימת חלבון העין A a C שש פריים, השתמש במערכת שטיפת התאים המסופקת עם המכשיר כדי לשטוף את תא הדגימה עם לפחות 50 מיליליטר של מאגר פועל. הסר את המאגר השיורי מתא הדגימה על ידי שאיפה בעזרת מזרק זכוכית מחט ארוך של 2.5 מיליליטר. הסר את התמיסות מהשואב באמצעות מחט ארוכה נקייה ויבשה שנייה.

מזרק 2.5 מיליליטר. שאב בזהירות מינימום של 1.8 מיליליטר של דגימת חלבון העין A a C שש ראשונית לתוך המזרק. היזהר כדי להימנע מבועות אוויר.

לאחר שהמזרק נטען בדגימת החלבון, הכנס את המחט לתא הדגימה וגע בעדינות בתחתית התא. הרם את המחט כמילימטר אחד והזריק בעדינות את הדגימה לתא עד שנראה עודף נוזל מעל החלק העליון של תא הדגימה. כדי לשטוף את התא מבועות אוויר כלואות, הרם את המחט בכסנטימטר אחד תוך הקפדה על השארת התמיסה בגלישה ומשוך במהירות והזריק כ-0.25 מיליליטר מהתמיסה.

כעת החלק בעדינות את המחט כלפי מעלה לאורך הצד של הצפה. בבאר המדגם המחט תפגע במדף. משוך את כל הנוזל מעל מדף זה מכיוון שהמדף מציין את הגובה הרצוי לתמיסת הריצה.

כדי לטעון את מזרק ההזרקה, חבר את מזרק הנפיחות של צינור הפלסטיק ליציאת המילוי והורד את קצה הבוכנה לחלק העליון של יציאת המילוי. כעת הנח את צינור מילוי הפיפטה של תמיסת הליגנד DGAs בתחתית מחזיק הפיפטה. בדוק שקצה המזרק אינו נוגע בתחתית צינור המילוי ושאב לאט את התמיסה לתוך המזרק עד שכמות קטנה נכנסת לצינור של מזרק הטעינה.

לאחר מכן, סגור את יציאת המילוי על ידי הורדת קצה הבוכנה. זה נעשה על ידי לחיצה על כפתור סגירת יציאת המילוי. לאחר מכן כדי להסיר בועות אוויר שעלולות להילכד במהלך הטעינה.

נקה ומלא מחדש על-ידי לחיצה על לחצן המילוי החוזר. יש לטהר ולמלא מחדש בסך הכל שלוש פעמים. לאחר השלמת תהליך מילוי הטיהור, הסר את צינור המילוי ממחזיק הפיפטה ונגב בעדינות את קצה המזרק בנייר טישו מעבדה.

כעת הורד את המזרק של מכלול הפיפטה לתוך הדגימה. ובכן, היזהר והמשך לאט מכיוון שהמחט יכולה להתכופף בקלות. ודא שהמזרק מוכנס לחלוטין על ידי לחיצה כלפי מטה על בסיס צווארון הנעילה.

לאחר אבטחת המזרק, הגדר את טמפרטורת הריצה הרצויה ובחר הספק ייחוס הגדול מעט מזרימת חום ההזרקה המקסימלית הצפויה. בדוגמה זו, 20 מעלות צלזיוס ו-20 מיקרו קלוריות לשנייה משמשות כטמפרטורת הריצה וכוח הייחוס בהתאמה. לאחר מכן תכנת את נפחי ההזרקה והעיכובים הרצויים.

כאן משתמשים ב-28 זריקות כאשר הראשונה בנפח של שני מיקרוליטר ועיכוב 62 והזריקות הבאות בנפח של 10 מיקרוליטר עם עיכובים של 332. הניסוי המודגם כאן מספק את הבסיס ליצירת מערך נתונים בריכוז יחיד כדי ליצור את העקומות הנוספות הדרושות. חזור על תהליך זה עם ירידה בריכוזי המקרומולקולות והליגנד.

ודא שכל דגימות המקרומולקולות והליגנד מקורן באותה תמיסת מלאי כדי למזער את השגיאה בריכוזים. מוצג כאן עקבות קלורימטריית טיטרציה איזותרמית גולמית המופקת מטיטרציה של 3.86 מילי-מולרית אצטיל קואנזים A ל-192 מיקרומולר של מולקולת המיקרו. A A C שש ראשוניות אחת.

ערכים משולבים בעין שימשו לקביעת פרמטרי הקישור עם התאמה רציפה של שני אתרים. גרף זה מתאר את האיזותרמיות שנוצרו על ידי ITC של ריכוזים שונים של ACE קו-אנזים A ו-AAC C שש פריים עין אחת. נתוני הניסוי המיוצגים על ידי מעגלים פתוחים התאימו הן למודל עצמאי של שתי קבוצות של אתרים, והן למודל עוקב של שני אתרים.

ניתן לראות הסכמה טובה יותר עם המודל הרציף של שני האתרים. ריכוזי החלבון המשמשים מוגדרים בטקסט הנלווה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להיות מדויק מאוד בדילול שלך מכיוון שלשינוי בריכוזים יכולה להיות השפעה דרסטית על התוצאות שלך.