Name: Dissection העין עכבר על הר שלם של האפיתל פיגמנט רשתית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-27T16:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 47 s
Description: למדו את שיטת ניתוח העין בעכבר לקבלת הרכבה שלמה של האפיתל הפיגמנט הרשתית. טכניקה זו מאפשרת חקר התפתחות הרשתית ומחלות עיניים בחיות מודל.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה [K22ES012264 כדי AJRB] ו אמריקאי האגודה למלחמה בסרטן InstitutionalResearch גרנט [ACS-IRG-00-173-04] טייס projectaward [אל AJRB]. אנו מודים גם אנשי המעבדה הבישוף לקריאה ביקורתית של כתב היד והערות על וידאו ואדם בראון בפרט, למשל של מה לא לעשות. אנו מודים ד&quot;ר דונלד מקיואן לחקר הסרטן Greehey ילדים המכון מאפשר לנו להשתמש היקף הניתוחים שלו / וידאו מצלמה הגדרת לצילום הווידאו לנתיחה. אנו מודים Daron בראון מכשירים Corte עבור חידוד ותיקון של כלי microdissection שלנו.

1. הסרה של רקמה חיצוניים מבחוץ של העין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 1X PBS לתוך המכסה של צלחת 35mm. הרמה צריכה להיות ממש מתחת שפת המכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים ישר, להעביר עין (ים) מהצינור אחסון המנה 35mm. עיניים שקועות PBS משתי סיבות: 1. הרקמות החיצוניות יהיה "לצוף" הרחק מן העין, כך שתוכל לראות ולהסיר אותם בקלות, 2. במהלך הניתוח, העין באופן טבעי לשמור על הצורה הכדורית שלו בעוד ההשעיה, ומאפשר לך לעבוד עם הצורה הזו ולא נגדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בשני זוגות של מלקחיים זווית (45 ° ו 15 °), להסיר בעדינות רבה כמו שריר ורקמת חיבור ככל האפשר, מושך את רקמת נגד הזרם (כלומר לכיוון הקרנית). יש רקמת חיבור יישאר. מאמץ צריך להיעשות כדי לסחוט את גלגל העין מעט ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המסחר מלקחיים שלך 15 מעלות במשך מספריים האביב. בעוד מחזיק את העין יציב עם מלקחיים 45 °, להשתמש במספריים באביב כדי לחתוך שריר הנותרים רקמת חיבור, כמו גם את עצב הראייה. * טיפ: השתמש בקצה החיצוני של המספריים לדחוף את רקמת נגד הזרם (לכיוון לחלק corneo-scleral) ולאחר מכן לקצץ. המשך עד שכל הרקמות החיצוניות הוסר מן העין. </li></ol> 2. הסר את הקרנית ואת העדשה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם הקרנית פונה כלפי מעלה, יש להשתמש במלקחיים 45 מעלות לצבוט את קפל קטן במרכז הקרנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים האביב, לעשות חתך קטן בבסיס של דש. עזוב דש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיק את העיניים עדיין עם מלקחיים, הכנס את להב מספריים נמוך לתוך בניצב החתך ולעשות חתך לכיוון לחלק corneo-scleral. נסו לשמור על הלהב התחתונה תחת הקשתית כך גם קרנית איריס נחתכים. אין לחתוך את כל הדרך לחלק corneo-scleral. שמור מספריים מוכנס בעיניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים שלך 45 °, בזהירות לסובב את העיניים כך מספריים שלך מקבילות לחלק corneo-scleral ולעשות חתך קטן. לאט לאט לסובב את העין ° 360, מה שהופך חתכים קטנים כל הדרך מסביב. שוב, מנסה לשמור את הלהב התחתון של המספריים האביב שלך לפי קשתית כך גם את איריס הקרנית נחתכים. הרם את איריס הקרנית רחוק משאר העין וזורקים אותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטה את העין על צידו ולחצו בעדינות על החצי האחורי של העין, מה שאילץ את העדשה החוצה. מחק את העדשה. החלק הפנימי של עיינית הנותר הוא בשורה של הרשתית העצבית, אשר צריך להיראות חלקות אטום. </li></ol> 3. הרובע עיינית וכתוצאה מכך, וכתוצאה מכך 4 - "עטורת פרחים", פרח דמוי מבנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העין צריכה להיות ממוקמת כך פתיחת עיינית היא בניצב לגוף שלך. שימוש במלקחיים 45 ° עד עיינית שלך יציב ואת המיקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזקת מספריים האביב שלך מולך אז הם ניצבים הגוף שלך, להכניס את הלהב התחתון של המספריים האביב שלך לתוך הקצה העליון של גביע לפתוח את העין. בעזרת מלקחיים שלך 45 °, בזהירות ליישר את כוס העין כך חתך בודד, ישר יכול להיות עשוי מחלקים corneo-scleral כלפי ראש עצב הראייה. כל הקיצוצים צריכה להיות בניצב לחלק corneo-scleral ו אלא אם כן צוין, צריך ללכת קרוב לראש עצב הראייה ככל האפשר מבלי לחתוך אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיבוב 180 ° עיינית, שמירה נצבות עם הגוף שלך. השתמש בטכניקה בשלב 3.2 לעשות חתך בניצב השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את עיינית וחזור על הטכניקה המתוארת 3.2 לבצע שני חתכים נוספים. כל ארבעת קיצוצים צריך להיות קרוב עד 90 ° בנפרד האפשרי. יש לזכור כי העין אינה כדורית מושלמת כך יהיו כמה השתנות. </li></ol> 4. חותכים כל אחד מארבעת "עלי כותרת" במחצית, והתוצאה היא מבנה הפרח דמוי שמונה עלה כותרת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את עיינית לרבעים מצלחת 35mm לשקופית נקי. עם עיינית פונה כלפי מעלה, סקופ תחת אותה עם מלקחיים 45 מעלות. הרם בזהירות את זה של הנוזל ומניחים אותו בשקופית נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בשני זוגות של מלקחיים זוויתי, בעדינות לפתוח את העיניים, עם הרשתית העצבית פונה כלפי מעלה. אין להסיר העצבית ברשתית העין, זה עוזר לשמור על כמה צורה כדורית שלה אז אתה לא פועלים נגד זה. הוא גם מגן על הרשתית מפני נזק בטעות בהליכים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את השקף עד שאחד עלי הכותרת הוא בניצב לגוף שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים 15 שלך מעלות, בעדינות לתפוס את הפינה של עלי כותרת. הפינה של עלה כותרת יש הקרנית, לא הרשתית הרשתית העצבית או. הרם את בפינה בעדינות, שמאפשר לו לשמור על העקמומיות שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הלהב התחתון של המספריים האביב שלך בין כותרת לבין שקופיות. הקו עד מספריים שלך כזה אחד, ישר, בניצב לחתוך יכול להיות עשוי מחלקים corneo-scleral כלפי ראש עצב הראייה. גזור קרוב לראש עצב הראייה כפי withou אפשרילא לחתוך אותו. עזוב עלה כותרת, המאפשר זה לשכב על השקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את השקופית 90 °, כך עלה כותרת הבא הוא בניצב לגוף שלך. חזור על שלב 4.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 4.5 ו 4.6 פעמיים נוספות. המבנה וכתוצאה מכך צריך להיראות כמו פרח שמונה עלה כותרת. </li></ol> 5. הסר את הרשתית העצבית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 100-200 μL של 1X PBS על הדגימה. זה ימנע את הרשתית העצבית יידבקו כפי שאתה לקלף אותו על הרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדרך כלל הרשתית העצבית מחובר באופן רופף על הרשתית. לעומת זאת, לקחת תרגול ומיומנות כדי להסיר רק את הרשתית העצבית ולא הרשתית. בעדינות לתפוס עלה כותרת של הרשתית העצבית עם זוג אחד מלקחיים זווית תוך ייצוב (החזקת) את שאר בעין עם זוג השני של מלקחיים זווית. משוך את הרשתית העצבית רחוק משאר של העין. המשך הליך זה עד הרשתית העצבית כולה הוסרה. * טיפ: מקל קצה מלקחיים 15 שלך · אל ראש עצב הראייה לעגן את העין. ואז להשתמש במלקחיים 45 מעלות לטאטא מתחת הרשתית העצבית והרם אותו משם. זה בדרך כלל הטובה ביותר להרים את הרשתית העצבית מהראש עצב הראייה לכיוון לחלק corneo-scleral. הקפידו להתרחק מכל שאריות רופפת של איריס. הקשתית דביק למדי, אחרת יכול להיתקע על הרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הדגימה עם 1X PBS. פיפטה 100-200 μL של 1X PBS לתוך הדגימה ולמצוץ אותו בחזרה. בטל PBS. חזור על הצורך להסיר אבק ופסולת. </li></ol> 6. הר את הדגימה (ים) בשקופית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 80-90 μL של גליצרול 90% לשקופית חדשה צורה מלבנית. השתמש בצד של קצה פיפטה לעשות למרוח אפילו, מלבני של גליצרול. (זהו הליך פיחלץ שני הרשתית בשקופית אחת.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הזרוע התחתונה של 15 ° מלקחיים תחת הדגימה. הרם בעדינות את הדגימה את השקופית הניתוחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להוריד את הדגימה לתוך גליצרול. בעדינות לכשכש מלקחיים כמו שאתה מושך אותם מתחת הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 6.1-6.3 עבור הדגימה אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את השקופית כך שהצד הארוך בניצב לגוף שלך. החזק זכוכית לכסות שלך 45 ° זווית לשקופית, כך שהוא נוגע שקופיות. הזז אותו לכיוון למרוח את גליצרול עד שהם נוגעים. שמירה על קשר בין הזכוכית המכסה והחלק, לאט להזיז את זכוכית לכסות הרחק למרוח, לעבר קצה המגלשה. בשורה ארוכה של שקופיות הצדדים ואת מכסה זכוכית, כך הם מקבילים. החזק את קצוות הזכוכית המכסה בין האגודל לאצבע המורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרימי את 15 מלקחיים · ב היד השנייה. עריסת את הקצה העליון (חינם) של זכוכית המכסה בכיפוף של היד. לאט לאט, להוריד את מכסה זכוכית. כאשר הקשר הוא בין הזכוכית המכסה את גליצרול, לעצור ולחכות גליצרול כדי להגר. חזור על הפחתת ומחכה עד mounts כל הרשתית מכוסים במלואם. זה כדי למנוע את גליצרול צמיגה מאוד ללכוד בועות אוויר. אל תלחץ על COVERGLASS - גליצרול יהיה לסחוט אותו מתחת, מה שהופך הידבקות עניים מאוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברור עם לק, צבע מסביב למתחם שבו הזכוכית המכסה והחלק להיפגש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את השקף על גבי מדף ריק לייבוש. </li></ol> 7. נציג תוצאות: התוצאה של הליך זה יש מבנה שנראה כמו פרח צריך להיות סימטרי למדי. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 1"> באיור 1. שלמות הרשתית הר מן העכבר wildtype C67Bl/6J. הרשתית משחור או חיות agouti צריך להיות חום כהה בצבע צריך משטח חלק. זה נורמלי לשים לב הגליות בתוך הטופוגרפיה של עלי הכותרת. פיגמנטציה על כל דגימה לתת יכול להיות משתנה במקצת, עקב צפיפות משתנה של פיגמנטציה של הרשתית והן דמית העין הבסיסית. חיצים הצבע הלבן "ערוצי" hypopigmented - זה נורמלי נובע vasculature הבסיסית של העין. החץ הכחול מצביע על נזק פיזי הרשתית והן דמית העין הבסיסית. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 2"> איור 2. שלמות הרשתית הר מן העכבר לדלל. דוגמאות שנקטפו מן החי ניתן לדלל טווח צבע כמעט שקוף לבית קפה בחלב וכל דגימה אחת היא רוצה השתנות בתוך זה, המצוין עיגולים שחורים כאן. באופן כללי, הרשתית שנקטפו מן החי הצעיר קלים אלה שנקטפו מן החי הם ישנים יותר כהה. החצים מצביעים שחור חלק vasculature הבסיסי, המופיע hypopigmented. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 3"> איור 3. מכתים Phalloidin יכול לשמש כדי לזהות נזק פיזי הרשתית. מכתים Phalloidin בבירור מתאר את קרום התא, מראה את צורת משושה של האפיתל. (א) דוגמה של עכבר שחור. (ב) דוגמה מתוך עכבר לדלל. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 4"> איור 4. הרשתית גזור גרוע מכל עכבר לדלל. (א) בסוגריים מצביעים בשולי הקרנית כי הם רחבים מדי, דבר שיכול לגרום קריסה ו / או קיפול. בתוך העיגול השחור אתה יכול לראות כמויות עודפות של רקמות זרים שלא הוסרו מהחלק האחורי של העין. הם בולטים במיוחד כי המדגם הוא מבעל חיים לדלל. עלה כותרת בצד שמאל למטה הוא מקופל חלקית מעל. (ב) זה הר כולו מראה של שבשבת. החצים מצביעים שחור חלק הקיצוצים שנעשו. רבים חתכים לחלק corneo-scleral כלפי ראש עצב הראייה אינם בקנה אחד עם קוטר. (ג) חיצים שחורים לציין כיצד הקיצוץ צריך להיות עשוי, בהתאם לקוטר ו בניצב המשיק.

<ol><li>Bishop, A. J., Kosaras, B., Sidman, R. L., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzo%28a%29pyrene+andX-rays+induce+reversions+of+the+pink-eyed+unstable+mutation+in+the+retinal+pigmentepithelium+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res.%22%5BJournal%5D)">Benzo(a)pyrene andX-rays induce reversions of the pink-eyed unstable mutation in the retinal pigmentepithelium of mice.</a> Mutat. Res.. 457, 31-31 (2000).</li>
<li>Reliene, R. H. lavacove, Mahadevan, A., Baird, B., M, W., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diesel+exhaust+particles+cause+increased+levels+of+DNA+deletions+after+transplacental+exposure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Diesel exhaust particles cause increased levels of DNA deletions after transplacental exposure in mice.</a> Mutat. Res. 570, 245-2452 (2005).</li>
<li>Bishop, A. J., Barlow, C., Wynshaw-Boris, A. J., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atm+deficiency+causes+increased+frequency+of+intrachromosomal+homologous+recombination+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Atm deficiency causes increased frequency of intrachromosomal homologous recombination in mice.</a> Cancer Res. 60, 395-399 (2000).</li>
<li>Brown, A. D., Claybon, A. B., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+WRN+helicase+domain+is+not+required+for+spontaneous+homologous+recombination-mediated+DNA+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Mouse WRN helicase domain is not required for spontaneous homologous recombination-mediated DNA deletion.</a> J. Nucleic Acids. , (2010).</li>
<li>Claybon, A., Karia, B., Bruce, C., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP1+suppresses+homologous+recombination+events+in+mice+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">PARP1 suppresses homologous recombination events in mice in vivo.</a> Nucleic Acids Res. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53-%2C+and+Gadd45a-deficient+mice+show+an+increased+frequency+ofhomologous+recombination+at+different+stages+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">p53-, and Gadd45a-deficient mice show an increased frequency ofhomologous recombination at different stages during development.</a> Cancer Res. 63, 5335-5343 (2003).</li>
<li>Bodenstein, L., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+development+of+the+mouse+retinalpigment+epithelium.+Part+I.+Cell+and+tissue+morphometrics+and+topography+of+mitoticactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth and development of the mouse retinalpigment epithelium. Part I. Cell and tissue morphometrics and topography of mitoticactivity.</a> Dev Biol. 121, 192-204 (1987).</li>
<li>Burke, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+phenotype+and+the+RPE%3A+is+the+answer+blowing+in+the+Wnt%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Epithelial phenotype and the RPE: is the answer blowing in the Wnt?</a> Prog Retin. Eye Res. 27, 579-595 (2008).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הרשתית היא אתר של האו&quot;ם p assay, ב assay-vivo של תיקון הומולוגיה מכוונת. Assay בלתי p נעשה שימוש כדי לחקור את ההשפעות של נזקי דנ&quot;א שונה 1,2 ו נזק לדנ&quot;א איתות גנים לתקן 3,4,5 על תדר של תיקון, הומולוגיה מכוונת. Assay זה רגיש במיוחד, גילוי תא בודד אירועים על הרשתית 1. היא יכולה גם לזהות הבדלים העיתוי של הומולוגיה מכוונת אירועים לתקן במהלך הפיתוח 6. העין Murine מפתחת רדיאלית החו...

<table><tbody><tr><td>פינצטה ישרה</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-4903</td><td>קצה: .08 x .04 mm חומר: INOX</td></tr><tr><td>פינצטה 45&amp;#x00B0;</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5005</td><td>קצה: .05 x.01 mm חומר: INOX</td></tr><tr><td>פינצטה 15&amp;#x00B0; &quot;up&quot;</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5045A</td><td>קצה: .1 x.06 mm חומר: INOX</td></tr><tr><td>מספרי קפיץ</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5604</td><td>רוחב קצה משולב 0.3mm אורך להב חיתוך 3mm חומר: פלדת אל חלד</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דיסקציה בינוקולרי</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Discovery V.8</td><td>השתמש במקור אור מחזיר</td></tr><tr><td>phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A22283</td><td>Alexa Fluor 546</td></tr></tbody></table>

dissection העין עכבר על הר שלם של האפיתל פיגמנט רשתית

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

אפיתל הפיגמנט ברשתית (הרשתית) שוכנת בחלק האחורי של העין של יונקים, ממש מתחת לרשתית עצביים, אשר מכיל את photoreceptors (מוטות קונוסים). הרשתית היא monolayer של תאים cuboidal וחבריו בשיתוף פעולה הדוק עם פיגמנט הרשתית העצבית בדיוק מעל אותה. אגודה זו הופכת את הרשתית עניין רב החוקרים ללמוד מחלות רשתית. הרשתית היא גם באתר של assay ב-vivo של תיקון הומולוגיה ביים DNA, assay בלתי p. העין עכבר קשה במיוחד לנתח בשל גודלו הקטן (כ 3.5 מ&quot;מ קוטר) ואת הצורה הכדורית שלו. מאמר זה מדגים בפירוט הליך לנתיחה של העין וכתוצאה מכך הר שלם של הרשתית. בהליך זה, אנו מראים כיצד לעבוד עם, ולא נגד, במבנה הכדורית של העין. בקצרה, ברקמת השריר החיבור, ואת עצב הראייה יוסרו מהחלק האחורי של העין. ואז, הקרנית ואת העדשה יוסרו. בשלב הבא, חתכים אסטרטגי נעשים כי התוצאה משטחת משמעותי של הרקמה הנותרת. לבסוף, הרשתית העצבית היא הרימה בעדינות את וחשף הרשתית שלם, אשר מחוברת עדיין דמית העין הבסיס והלחמית. הר זה כל שניתן להשתמש בהם כדי לבצע את assay בלתי p או הערכה או אימונוהיסטוכימיה immunofluorescent של רקמת הרשתית.

הפגנה רשמית של דיסקציה של העין עכבר, וכתוצאה מכך הר שלם של אפיתל הפיגמנט ברשתית.

Dissection העין עכבר על הר שלם של האפיתל פיגמנט רשתית

האפיתל הפיגמנטי של הרשתית (RPE) שוכן בחלקו האחורי של עינו של היונק, ממש מתחת לרשתית העצבית, המכילה את הפוטורצפטורים (קולבליים ו...

שמי אליסון קלאבון. אני עוזרת מחקר של ד"ר אלכס בישופ במכון גרי למחקר סרטן ילדים במרכז מדעי הבריאות של UT בסן אנטוניו, טקסס. היום אני אדגים כיצד לבצע נתיחה של עין מכרסם לצורך בידוד של שכבת האפיתל הפיגמנטרי של הרשתית באופן מלא.רקמה זו מעניינת לצורך חקר התפתחות הרשתית ומחלותיה, והיא משמשת גם כאתר לבדיקת תיקון DNA מוכוון הומולוגיה in vivo. לכן, בואו נתחיל. כאן מופיעה עין המוכנה לניתוח.ראשית, נבחן את המבנים האנטומיים שישמשו כנקודות ציון במהלך הפרוצדורה. אלו עיניים של בעל חיים דלול. כאן נמצא העצב האופטי בחלק האחורי של העין ממול.זוהי הקרנייה. הקשת נראית דרך הקרנייה. האזור הלבנבן בחלק האחורי של העין הוא הלובנה.לפיכך, אזור זה נקרא למחיצה בין הקרנית לסקלרה. השלב הראשון של הניתוח הוא הסרת רקמות עודפות, כגון רקמת חיבור של השרירים והעצב האופטי. לאחר מכן, יש להסיר את הקרנית באמצעות חיתוך מעגלי.בשלב זה, ניתן להוציא את העדשה, מה שיוביל לקבלת גביע עיני חלול. ארבעת החתכים הבאים מבוצעים מקו ההפרדה בין הקרנית ללחמית לכיוון ראש העצב האופטי. המבנה שמתקבלresemble לפרח בעל ארבעה עלי כותרת.כל אחד מארבעה עלי כותרת אלו נחתך לאחר מכן במרכזו, מה שיוצר מבנה הדומה לפרח בעל שמונה עלי כותרת. בשלב זה, ה-I עלול להתעקם באזורים מסוימים בשל טבעו הכדורי. כדי להתגבר על כך ולהשיג הרכבה שטוחה יותר לחור, ניתן לבצע שמונה חתכים קצרים יותר העוברים דרך נקודת העיקום.יהיו זמין בעמדת העבודה מספר חומרים, כולל פיפטה של 100 או 200 µL וטיפים תואמים, צלחות X-P-B-S-A בקוטר 35 מ"מ, תויות זכוכית ובזזים, glycerol 90% ולק שקוף להכנת התויות, מעמד לייבוש תויות, קופסת נייר סופג מסוג Kim wipes ומיכל פסולת להצבה על המותניים. בנוסף לחומרים נפוצים אלו, תזדקקו לסט של כלי מיקרו-דיסקציה ייעודיים, הכולל פינצטה ישרה; פינצטה בזווית של 45 מעלות משמשת להחזקה, סיבוב ומניפולציה כללית של העין במהלך הדיסקציה. פינצטה זו, בעלת זווית של 15 מעלות כלפי מעלה, משמשת גם היא לטיפול ומניפולציה של העין.לבסוף, תזדקקו לזוג מספרי קפיץ. חשוב מאוד להשתמש במספרי קפיץ בניגוד למספריים בסגנון מסורתי. עבור נתיחה זו, לפני תחילת הנתיחה, ודאו שגובה הכיסא מכוון כך שכאשר אתם יושבים זקוף, עיניכם נמצאות בגובה העדשות (oculars).ישיבה שפופה מול המיקרוסקופ גורמת לכאבי כתפיים וגב ופוגעת באיכות הדיסקציות. לתחילת העבודה, שפכו מעט XPBS אל מכסה של צלחת 35 מילימטר. לאחר מכן, העבירו את העיניים שאתם מתכננים להבדיל אל הצלחת.זוהי עין של עכבר C 57 שחור מסוג פרא (wild type). ניתן לראות שהיא קטנה מאוד, בקוטר של כ-3.5 מילימטרים. העכירות של הלובן (sclera) מעניקה לה גוון כחלחל.השלב הראשון בניתוח הוא הסרת כל הרקמות העודפות שסביב העין, כגון רקמת חיבור שרירית והעצב האופטי. כאן אני מחזיק את הפינצטה של 45 מעלות בידי השמאלית ואת הפינצטה של 15 מעלות בידי הימנית. ניתן להשתמש בזוג פינצטות אחד כדי לייצב את העין תוך כדי משיכת הרקמה הרחוקה באמצעות השנייה.כאשר פיסה גדולה של רקמה נפרדת, נגבו בזהירות את הפינצטה על נייר ניגוב מסוג Kim wipe. הקפידו לא למעוך או לדקור את העין. אחד היתרונות של ביצוע נתיחה זו בתליה הוא שניתן לראות בקלות את רקמת החיבור צפה הרחק מהעין.בסופו של דבר, תגיעו לנקודה שבה לא ניתן יהיה להסיר רקמה נוספת באמצעות פינצטה. החליפו את הפינצטה בזווית של 15 מעלות במספרי קפיץ. השתמשו במספרי הקפיץ כדי לחתוך את העצב האופטי.השתמשו בקצה החיצוני של הלהב כדי לדחוף את הרקמה קדימה לעבר הגבול שבין הקרנית ללחמית. לאחר מכן, קצצו ונגבו בעדינות את המספריים בעזרת נייר ניגוב (Kimwipe). בואו נראה זאת שוב.כאשר הרקמה בולטת כלפי מעלה, דחפו אותה קדימה לכיוון הגבול שבין הקרנית ללוחית עם הקצה החיצוני של המספריים. גזרו, המשיכו לדחוף חלקי רקמה קדימה באמצעות הקצה הקהה של המספריים ולאחר מכן גזרו אותם, עד להסרה של כל הרקמה העודפת. בדרך כלל קיימים שני פסי רקמה קשיחה על העין.הראשון מחובר בממשק שבין הקרנית לסקלרה, והשני מוצג בשלב הקיצוץ. נקודה זו נמצאת בערך במחצית הדרך בין הממשק שבין הקרנית לסקלרה לבין ראש העצב האופטי. השלב הבא בדיסקציה הוא הסרת הקרנית והעדשה.השתמשו בפינצטה של 45 מעלות כדי להרים מקפלת בקירוב במרכז הקרנית. לאחר מכן, השתמשו במספרי קפיץ כדי לבצע חתך קטן בבסיס המקפלת. הכניסו את הלהב התחתון של המספריים לתוך החתך מתחת לקשתית.בצעו חתך לכיוון המבוא של הקרנית והסקלרה, אך לא לתוכו. כעת, סובבו את העין באיטיות ב-360 מעלות, תוך ביצוע חתכים קטנים מסביב. השתדלו להחזיק את המספריים מתחת לקשתית, כך שתחתכו את הקרנית ואת הקשתית בו-זמנית.נדרש תרגול רב כדי לבצע זאת בקלות כפי שאני מראה כאן. לאחר הסרת הקרנית, הפוך את העין על צדה ולחץ בעדינות על החלק החיצוני של העין כדי לדחוף את העדשה החוצה. המבנה שנותר יהיה דמוי גביע.יש לחלק את העין לרבעים. לצורך כך, הפוך את העין על צדה והכנס את הלהב התחתון של מספרי הקפיץ. בצע חתך לאורכי לכיוון ראש העצב האופטי, אך מבלי להגיע עד אליו.כדי לעשות זאת, החזיקו את זרועותיכם לצדי הגוף ואת המספריים לפניכם, במצב כמעט ניצב לגוף ולחתך העין. בצעו את החתך השני ישירות מול החתך הראשון. הקדישו את הזמן הדרוש ליישור כדי שתוכלו לבצע חתך חלק.ביצוע חתכים מרובים עלול לגרום לקצוות משוננים, אך אם הם מיושרים בזהירות, הם אינם מורגשים. שימו לב כיצד אני מסוגל לעבוד עם הצורה הכדורית של העין במקום נגדה, מכיוון שהעין שומרת על צורתה הרגילה. כאשר העין תלויה ב-PBS, שאר תהליך הנתיחה יתבצע על תבנית זכוכית. החזיקו את העין בעזרת פינסטות בזווית של 45 מעלות והרימו אותה מה-PBS.הניחו את העין על תגית זכוכית נקייה. בעזרת שני זוגות של פינצטות זוויתיות, פתחו בזהירות את העין. שימו לב כי קיים שוליים קטנים של קרנית וקשתית מסביב להיקף העין, דבר המקל על הטיפול בה.בשלב הבא, יש לחתוך כל אחד מארבעת העליכים לחצי. סובב את העין כך שאחד העליכים יהיה ניצב לגופך. אחז בפינת העליכים באמצעות הפינצטה עם זווית של 15 מעלות.הרימו מעט ולאחר מכן בצעו חיתוך מהגבול שבין הקרנית לסקלרה לכיוון ראש העצב האופטי. חיתוכים אלו צריכים להיות ניצבים למשיק. משיק הוא קו הניצב לקוטר.לפיכך, החיתוכים שלכם צריכים להיות בקו אחד עם קוטר העין. כעת סובבו את התובית כך שהפדל הבא יהיה בניצב לגופכם וחזרו על הפעולה. אחזו בפינת הפדל.הרימו מעט וגזרו. חזרו על הפעולה עד שכל אחד מארבעת העליקים הגדולים ייגזר לחצי. החומר הלבנнови הוא הרשתית העצבית, המכסה ישירות את ה-RPE.הרשתית העצבית יכולה להגן על ה-RPE, לכן השאירו אותה שלמה עד לסיום כל החתכים. שימו לב שהפדלים מעוקלים מעט. אל תנסו להתנגד לכך.הקדישו את הזמן הדרוש לסימון מדויק כדי שתוכלו לבצע חיתוך יחיד ונקי. בשל צורתו העגולה של העין, היא נוטה להתעקם; כדי למנוע עיקום זה, ניתן לבצע שמונה חיתוכים קצרים.אחת בכל עליכבה. השתמש באותה אסטרטגיה בסיסית כבסיבוב הקודם של ארבעה חתכים. הרם את פינת העליכבה ובצע חתך, אך במקרה זה, חתוך רק עד כמחצית מאורכה של העליכבה.לאחר ביצוע כל החתכים, ניתן להסיר את הרשתית העצבית. כאן אני מוסיף מספר טיפות של 1X PBS לדגימה. יש להימנע מהתייבשות של ה-RPE.הרשתית העצבית צריכה להיות מקושרת באופן רפוי בלבד ל-RPE שמתחתיה. ניתן לראות שהיא נפרדת בקלות רבה. עם זאת, היא בדרך כלל תישאר מחוברת במקום המפגש בין הקרנית לסקלרה, שבתחלתו של העין הוא רכס גבשושי הנקרא הגוף הציליארי.ניתן להחדיר את קצה הפינצטה בעלת הזווית של 15 מעלות אל ראש עצב הראייה כדי לקבע את הדגימה בזמן הסרת הרשתית העצבית. הגוף הציליארי מסמן את קצה ה-RPE, הרקמה בעלת הפיגמנטציה הכהה שהוסרה. כאן מופיעה הקשתית, ולא ה-RPE.אני ממליץ להסיר כמה שיותר מהקשתית מכיוון שהיא דביקה מאוד ויכולה להתקפל ולהידבק ל-RPE אם הרשתית העצבית מתקלפת או אם שאריות שלה נשארות דבוקות ל-RPE. סביר להניח שאחד משני דברים השתבשו. או שהעיניים לא קובעו כראוי, למשל למשך זמן רב מדי או קצר מדי, או שהן היו באחסון זמן רב מדי לפני הניתוח.הדוושה שאני חושף כאן עדיין לא קיבלה את קיצור הדרך שלה. ניתן לראות כי הדוושה נמצאת במרחק של כשליש מקצה ה-RPE. זו הסיבה לכך שמומלץ להשתמש בשמונת קיצורי הדרך.לאחר שהסרת את כל הרשתית העצבית, השתמש בפיפט כדי לשטוף את ה-RPE מספר פעמים עם 100 עד 200 µL של PBS עד להסרה מלאה של כל האבק והפסולת. טפטף באמצעות פיפט 80 עד 90 µL של 90% glycerol על זכוכית כיסייה נקייה בצורה מלבנית. שים לב, זהו הנפח האופטימלי של glycerol עבור זכוכית כיסייה בגודל 22 על 50 mm ויש להתאימו בהתאם.עבור גדלים אחרים של זכוכית כיסוי, השתמש בקצה הפ pipette כדי לפרוס את הגליצרין. הקפד לא להחדיר בועות אוויר אל תוך הגליצרין. אם נוצרה בועה, גרור אותה אל הקצה שם היא תתפוצץ.החליקו את הזרוע התחתונה של הפינצטה בגישה של 15 מעלות אל מתחת ל-RPE והרימו בזהירות, ולאחר מכן הורידו באיטיות את ה-RPE אל תוך הגליצרול. ה-RPE יצוף על פני הגליצרול ועשוי להתכווץ או להתפתל מעט. השתמשו בפינצטה כדי ליישר את ה-RPE ולהפיץ את הגליצרול על פניו.אם נוצרות בועות אוויר, גררו אותן אל הקצה שם הן יתפוצצו, תוך החזקת זכוכית הכיסוי בזווית של כ-45 Degrees. התיקו אותה לקצה הגליצרין.לאחר מכן, העבירו אותו לכיוון קצה הזכוכית. החזיקו את תחתית זכוכית הכיסוי בעזרת האגודל והאצבע המורה ותמכו בקצה הנגדי באמצעות פינצטה של 15 מעלות. הורידו את זכוכית הכיסוי לאט מאוד לכיוון הזכוכית ברגע שנוצר מגע.בעת המגע עם ה-RPE, הפסיקו את ההורדה כדי לאפשר לגליצרול לנדוד, ולאחר מכן המשיכו להוריד את זכוכית הכיסוי באיטיות. אם תורידו את זכוכית הכיסוי במהירות רבה מדי, בועות אוויר עלולות להילכד בתוך הפיתוח. אני אוריד את זכוכית הכיסוי באיטיות בזמן שהיא נוגעת ב-RPE ואאפשר לגליצרול לנדוד.ניתן לראות שכאשר אני משחרר את זכוכית הכיסוי במהירות, נוצרות בועות אוויר. השתמשו בכמות נדיבה של לק שקוף כדי להצמיד את קצות זכוכית הכיסוית לסלייד לאורך כל ההיקף.זהו RPE טיפוסי מעכבר C 57 שחור. זהו מצב נורמלי לראות את כלי הדם התת-קרקעיים כפי שמסומן כאן. זהו גם מצב נורמלי לראות שונות מסוימת בפיגמנטציה, כגון אזורים שנראים פחות פיגמנטריים.עם זאת, נקודות בהירות כגון זו נובעות ככל הנראה מנזק פיזי ל-RPE ולכורואיד שמתחתיו. מכיוון שגם הכורואיד של העין הוא פיגמנטרי, ייתכן שנזק ל-RPE שחור לא יבוא לידי ביטוי אם הכורואיד נותר שלם.זהו RPE טיפוסי מעכבר עם דילול פיגמנט (dilute). כפי שניתן לראות, ניתן להבחין בכלי דם ותהיה שונות מסוימת בפיגמנטציה, כגון אזורים כהים יותר ואזורים בהירים יותר. עם זאת, כמעט בלתי אפשרי לזהות נזק ב-RPE של עכבר עם דילול פיגמנט.האם כתמים קטנים אלו הם נזק או שהם שונות רגילה בפיגמנטציה? אני מציע לבצע צביעה ומיפוי כדי לבחון שאלה זו. הדבר ייתן לך מושג אם אתה מטפל ב-I two בצורה גסה מדי.הצביעה ממסגרת בבירור את קרומי התאים, ובכך הופכת נקודות פגועות לבולטות, אך למעשה ה-RPE עמיד למדי, ואם תאחזו בעין דרך הקרנית, לא סביר שתגרמו לנזק. לפניכם דגימה שלמה (whole mount) עם שורה של בעיות, שהפשוטה שבהן, המצוינת כאן, היא שולי קרנית רחבים מדי, דבר שעלול להוביל לקמטות וקיפולים של החומר הגלי. ניתן לראות כאן רקמה חיצונית מאסיבית שנותרה בחלק האחורי של העין.דוושה זו מקופלת חלקית, וכאן ניתן לראות שה-RPE נקרע חלקית. בעיה נוספת היא שלעין זו יש מראה של גלגל רוח. כאן סימנתי את זוויות החיתוכים.עם זאת, כך הם היו אמורים להיראות. זכרו, החתכים שלכם צריכים להיות מאונכים למשיק ובקו אחד עם הקוטר. הרגע הדגמתי כיצד לבצע נתיחה של עין עכבר לצורך דגימה שלמה (whole mount) של הפיגמנט הרשתי.בנוגע לאפיתל, הדבר החשוב ביותר הוא לשמור על יציבה נכונה, אך נסו להישאר רגועים. אני מקווה שמצאתם סרטון זה מועיל ומאחל לכם הצלחה רבה בניסוייכם העתידיים.

dissection-mouse-eye-for-whole-mount-retinal-pigment

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

הטכניקה לנתיחה מדגים הוצאת הקרביים של הזגוגית, הרשתית, ואת העדשה מהעין העכבר, הפרדה על ידי צנטריפוגה, ואפיון עם מבחני חלבון.

הוצאת הקרביים של הזגוגיות עכבר רשתית עבור ניתוח proteomic

טכניקת הנתיחה ממחישה enucleation של עין העכבר לקיבוע רקמות כדי לבצע phenotyping במסכי תפוקה גבוהה.

Enucleation עיני העכבר לphenotyping מרחוק תפוקה גבוהה

הפרוטוקול המתואר כאן מיועד להערכה מבנית של תכשיר רשתית שלם. זה כולל תיאורים של דיסקציה של רקמות, הרכבה על תוספת ממברנה פוליטטרפלואורואתילן הידרופילית (PTFE), העמסת בולוס עם סמנים פלואורסצנטיים, והשוואה של קיבוע עם קרבודימיד ופרפורמלדהיד לניתוח אימונוהיסטוכימי של רכיבים תאיים וסינפטיים.

פרוטוקול אופטימלי עבור רשתית Wholemount הכנה להדמיה ואימונוהיסטוכימיה

דו ח זה מתאר שיטות מקיפות של הכנת העכבר הקפוא מקטעים רשתית עבור אימונוהיסטוכימיה (IHC).  השיטות שתוארו כוללות ניתוח של הספל האחורי העינית, קיבעון הפרפורמלדהיד, הטבעה של טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) מדיה ורקמות כיוון, הסרת וכתמים חיסוני.

הכנת שאיפה של העכבר רשתית-סעיפים עבור אימונוהיסטוכימיה

פרוטוקול זה, אשר דווח במקור על ידי פרננדז-Godino ואח '. בשנת 20161, מתאר שיטה לבודד ביעילות ותרבות העכבר RPE תאים, אשר יוצרים מונולייר RPE פונקציונלי מקוטב בתוך שבוע על לוחות Transwell. ההליך לוקח בערך 3 שעות.

ניתוח יעיל ותרבות של תאי אפיתל פיגמנט רשתית העכבר הראשי

מאמר זה מציג פרוטוקול למיקרו-דיסקציה עינית במכרסמים. התהליך כולל את האינקולציה של גלגל העין יחד עם הממברנה הניקטיבית (כלומר, העפעף השלישי). לאחר מכן מתבצעת הפרדה של המשקפיים האחוריים והקדמיים.

מיקרודיסקציה של עין המכרסם

מודלים של עכברים יכולים להיות כלים שימושיים לחקר הביולוגיה של אפיתל פיגמנטי ברשתית (RPE). נקבע כי עכברים יכולים לפתח מערך של פתולוגיות RPE. כאן, אנו מתארים פרוטוקול פנוטיפ כדי להבהיר ולכמת פתולוגיות RPE בעכברים באמצעות אור, אלקטרונים הולכה ומיקרוסקופ קונפוקלי.

פרוטוקול להערכה וכימות של פתולוגיות אפיתל פיגמנטי ברשתית במודלים עכבריים של ניוון מקולרי הקשור לגיל

אפיתל פיגמנט ברשתית (RPE) פועל כמחסום מכריע בין הכורואיד לרשתית, ומקדם את בריאותם ותפקודם של סוגי תאי רשתית, כגון פוטורצפטורים. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול פשוט ויעיל לבידוד וטיפוח RPE של מורין בוגר.

שיטה פשוטה לבידוד ותרבית של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית מעכברים בוגרים

פרוטוקול זה מתאר את ההליך לבידוד רשתית העכבר בהרכבה שלמה וביצוע immunostaining כדי לתייג את כל תאי גנגליון הרשתית (RGCs). התהליך מלווה בהדמיה וספירה אוטומטית של RGCs באמצעות תוכנה מבוססת בינה מלאכותית, המספקת שיטה פשוטה, מהירה ומדויקת לכימות RGCs בכל רשתית העכבר.

Immunostaining בהר שלם וספירה אוטומטית של תאי גנגליון רשתית עכבר

מתואר פרוטוקול להכנת הקפאות רשתית של עכברים וביצוע צביעה חיסונית על קולטני אור. מאמר זה מאפשר לחוקרים לייצר באופן עקבי חלקים קפואים ברשתית של עכברים עם מורפולוגיה שמורה היטב ותוצאות צביעה חיסונית באיכות גבוהה.

הקפאה וצביעה חיסונית של רשתית העכבר

הרשתית מציגה ארגון מרחבי מורכב על פני המבנה הלמינרי שלה. טכניקות מודרניות של טרנסקריפטומיקה מרחבית וריצוף דורשות קטעי רקמה בעובי &lt; 20 מיקרומטר, מה שמגביל את תחולת מחקר הרשתית. שיטת הקפאה טרייה זו מייצרת קטעי פנים דקים של רשתית העכבר תוך שמירה על יחסים מרחביים מישוריים, ומאפשרת מיפוי מולקולרי מקיף על פני הלמינות.

פנים פנים הקפאה של רשתית עכבר לניתוח מרחבי מרחבי בממדים גבוהים

למדו את שיטת ניתוח העין בעכבר לקבלת הרכבה שלמה של האפיתל הפיגמנט הרשתית. טכניקה זו מאפשרת חקר התפתחות הרשתית ומחלות עיניים בחיות מודל.

Dissection העין עכבר על הר שלם של האפיתל פיגמנט רשתית

גלה סרטונים נוספים