Dissection העין עכבר על הר שלם של האפיתל פיגמנט רשתית

שמי אליסון קלאבון. אני עוזרת מחקר של ד"ר אלכס בישופ במכון גרי למחקר סרטן ילדים במרכז מדעי הבריאות של UT בסן אנטוניו, טקסס. היום אני אדגים כיצד לבצע נתיחה של עין מכרסם לצורך בידוד של שכבת האפיתל הפיגמנטרי של הרשתית באופן מלא.

רקמה זו מעניינת לצורך חקר התפתחות הרשתית ומחלותיה, והיא משמשת גם כאתר לבדיקת תיקון DNA מוכוון הומולוגיה in vivo. לכן, בואו נתחיל. כאן מופיעה עין המוכנה לניתוח.

ראשית, נבחן את המבנים האנטומיים שישמשו כנקודות ציון במהלך הפרוצדורה. אלו עיניים של בעל חיים דלול. כאן נמצא העצב האופטי בחלק האחורי של העין ממול.

זוהי הקרנייה. הקשת נראית דרך הקרנייה. האזור הלבנבן בחלק האחורי של העין הוא הלובנה.

לפיכך, אזור זה נקרא למחיצה בין הקרנית לסקלרה. השלב הראשון של הניתוח הוא הסרת רקמות עודפות, כגון רקמת חיבור של השרירים והעצב האופטי. לאחר מכן, יש להסיר את הקרנית באמצעות חיתוך מעגלי.

בשלב זה, ניתן להוציא את העדשה, מה שיוביל לקבלת גביע עיני חלול. ארבעת החתכים הבאים מבוצעים מקו ההפרדה בין הקרנית ללחמית לכיוון ראש העצב האופטי. המבנה שמתקבלresemble לפרח בעל ארבעה עלי כותרת.

כל אחד מארבעה עלי כותרת אלו נחתך לאחר מכן במרכזו, מה שיוצר מבנה הדומה לפרח בעל שמונה עלי כותרת. בשלב זה, ה-I עלול להתעקם באזורים מסוימים בשל טבעו הכדורי. כדי להתגבר על כך ולהשיג הרכבה שטוחה יותר לחור, ניתן לבצע שמונה חתכים קצרים יותר העוברים דרך נקודת העיקום.

יהיו זמין בעמדת העבודה מספר חומרים, כולל פיפטה של 100 או 200 µL וטיפים תואמים, צלחות X-P-B-S-A בקוטר 35 מ"מ, תויות זכוכית ובזזים, glycerol 90% ולק שקוף להכנת התויות, מעמד לייבוש תויות, קופסת נייר סופג מסוג Kim wipes ומיכל פסולת להצבה על המותניים. בנוסף לחומרים נפוצים אלו, תזדקקו לסט של כלי מיקרו-דיסקציה ייעודיים, הכולל פינצטה ישרה; פינצטה בזווית של 45 מעלות משמשת להחזקה, סיבוב ומניפולציה כללית של העין במהלך הדיסקציה. פינצטה זו, בעלת זווית של 15 מעלות כלפי מעלה, משמשת גם היא לטיפול ומניפולציה של העין.

לבסוף, תזדקקו לזוג מספרי קפיץ. חשוב מאוד להשתמש במספרי קפיץ בניגוד למספריים בסגנון מסורתי. עבור נתיחה זו, לפני תחילת הנתיחה, ודאו שגובה הכיסא מכוון כך שכאשר אתם יושבים זקוף, עיניכם נמצאות בגובה העדשות (oculars).

ישיבה שפופה מול המיקרוסקופ גורמת לכאבי כתפיים וגב ופוגעת באיכות הדיסקציות. לתחילת העבודה, שפכו מעט XPBS אל מכסה של צלחת 35 מילימטר. לאחר מכן, העבירו את העיניים שאתם מתכננים להבדיל אל הצלחת.

זוהי עין של עכבר C 57 שחור מסוג פרא (wild type). ניתן לראות שהיא קטנה מאוד, בקוטר של כ-3.5 מילימטרים. העכירות של הלובן (sclera) מעניקה לה גוון כחלחל.

השלב הראשון בניתוח הוא הסרת כל הרקמות העודפות שסביב העין, כגון רקמת חיבור שרירית והעצב האופטי. כאן אני מחזיק את הפינצטה של 45 מעלות בידי השמאלית ואת הפינצטה של 15 מעלות בידי הימנית. ניתן להשתמש בזוג פינצטות אחד כדי לייצב את העין תוך כדי משיכת הרקמה הרחוקה באמצעות השנייה.

כאשר פיסה גדולה של רקמה נפרדת, נגבו בזהירות את הפינצטה על נייר ניגוב מסוג Kim wipe. הקפידו לא למעוך או לדקור את העין. אחד היתרונות של ביצוע נתיחה זו בתליה הוא שניתן לראות בקלות את רקמת החיבור צפה הרחק מהעין.

בסופו של דבר, תגיעו לנקודה שבה לא ניתן יהיה להסיר רקמה נוספת באמצעות פינצטה. החליפו את הפינצטה בזווית של 15 מעלות במספרי קפיץ. השתמשו במספרי הקפיץ כדי לחתוך את העצב האופטי.

השתמשו בקצה החיצוני של הלהב כדי לדחוף את הרקמה קדימה לעבר הגבול שבין הקרנית ללחמית. לאחר מכן, קצצו ונגבו בעדינות את המספריים בעזרת נייר ניגוב (Kimwipe). בואו נראה זאת שוב.

כאשר הרקמה בולטת כלפי מעלה, דחפו אותה קדימה לכיוון הגבול שבין הקרנית ללוחית עם הקצה החיצוני של המספריים. גזרו, המשיכו לדחוף חלקי רקמה קדימה באמצעות הקצה הקהה של המספריים ולאחר מכן גזרו אותם, עד להסרה של כל הרקמה העודפת. בדרך כלל קיימים שני פסי רקמה קשיחה על העין.

הראשון מחובר בממשק שבין הקרנית לסקלרה, והשני מוצג בשלב הקיצוץ. נקודה זו נמצאת בערך במחצית הדרך בין הממשק שבין הקרנית לסקלרה לבין ראש העצב האופטי. השלב הבא בדיסקציה הוא הסרת הקרנית והעדשה.

השתמשו בפינצטה של 45 מעלות כדי להרים מקפלת בקירוב במרכז הקרנית. לאחר מכן, השתמשו במספרי קפיץ כדי לבצע חתך קטן בבסיס המקפלת. הכניסו את הלהב התחתון של המספריים לתוך החתך מתחת לקשתית.

בצעו חתך לכיוון המבוא של הקרנית והסקלרה, אך לא לתוכו. כעת, סובבו את העין באיטיות ב-360 מעלות, תוך ביצוע חתכים קטנים מסביב. השתדלו להחזיק את המספריים מתחת לקשתית, כך שתחתכו את הקרנית ואת הקשתית בו-זמנית.

נדרש תרגול רב כדי לבצע זאת בקלות כפי שאני מראה כאן. לאחר הסרת הקרנית, הפוך את העין על צדה ולחץ בעדינות על החלק החיצוני של העין כדי לדחוף את העדשה החוצה. המבנה שנותר יהיה דמוי גביע.

יש לחלק את העין לרבעים. לצורך כך, הפוך את העין על צדה והכנס את הלהב התחתון של מספרי הקפיץ. בצע חתך לאורכי לכיוון ראש העצב האופטי, אך מבלי להגיע עד אליו.

כדי לעשות זאת, החזיקו את זרועותיכם לצדי הגוף ואת המספריים לפניכם, במצב כמעט ניצב לגוף ולחתך העין. בצעו את החתך השני ישירות מול החתך הראשון. הקדישו את הזמן הדרוש ליישור כדי שתוכלו לבצע חתך חלק.

ביצוע חתכים מרובים עלול לגרום לקצוות משוננים, אך אם הם מיושרים בזהירות, הם אינם מורגשים. שימו לב כיצד אני מסוגל לעבוד עם הצורה הכדורית של העין במקום נגדה, מכיוון שהעין שומרת על צורתה הרגילה. כאשר העין תלויה ב-PBS, שאר תהליך הנתיחה יתבצע על תבנית זכוכית. החזיקו את העין בעזרת פינסטות בזווית של 45 מעלות והרימו אותה מה-PBS.

הניחו את העין על תגית זכוכית נקייה. בעזרת שני זוגות של פינצטות זוויתיות, פתחו בזהירות את העין. שימו לב כי קיים שוליים קטנים של קרנית וקשתית מסביב להיקף העין, דבר המקל על הטיפול בה.

בשלב הבא, יש לחתוך כל אחד מארבעת העליכים לחצי. סובב את העין כך שאחד העליכים יהיה ניצב לגופך. אחז בפינת העליכים באמצעות הפינצטה עם זווית של 15 מעלות.

הרימו מעט ולאחר מכן בצעו חיתוך מהגבול שבין הקרנית לסקלרה לכיוון ראש העצב האופטי. חיתוכים אלו צריכים להיות ניצבים למשיק. משיק הוא קו הניצב לקוטר.

לפיכך, החיתוכים שלכם צריכים להיות בקו אחד עם קוטר העין. כעת סובבו את התובית כך שהפדל הבא יהיה בניצב לגופכם וחזרו על הפעולה. אחזו בפינת הפדל.

הרימו מעט וגזרו. חזרו על הפעולה עד שכל אחד מארבעת העליקים הגדולים ייגזר לחצי. החומר הלבנнови הוא הרשתית העצבית, המכסה ישירות את ה-RPE.

הרשתית העצבית יכולה להגן על ה-RPE, לכן השאירו אותה שלמה עד לסיום כל החתכים. שימו לב שהפדלים מעוקלים מעט. אל תנסו להתנגד לכך.

הקדישו את הזמן הדרוש לסימון מדויק כדי שתוכלו לבצע חיתוך יחיד ונקי. בשל צורתו העגולה של העין, היא נוטה להתעקם; כדי למנוע עיקום זה, ניתן לבצע שמונה חיתוכים קצרים.

אחת בכל עליכבה. השתמש באותה אסטרטגיה בסיסית כבסיבוב הקודם של ארבעה חתכים. הרם את פינת העליכבה ובצע חתך, אך במקרה זה, חתוך רק עד כמחצית מאורכה של העליכבה.

לאחר ביצוע כל החתכים, ניתן להסיר את הרשתית העצבית. כאן אני מוסיף מספר טיפות של 1X PBS לדגימה. יש להימנע מהתייבשות של ה-RPE.

הרשתית העצבית צריכה להיות מקושרת באופן רפוי בלבד ל-RPE שמתחתיה. ניתן לראות שהיא נפרדת בקלות רבה. עם זאת, היא בדרך כלל תישאר מחוברת במקום המפגש בין הקרנית לסקלרה, שבתחלתו של העין הוא רכס גבשושי הנקרא הגוף הציליארי.

ניתן להחדיר את קצה הפינצטה בעלת הזווית של 15 מעלות אל ראש עצב הראייה כדי לקבע את הדגימה בזמן הסרת הרשתית העצבית. הגוף הציליארי מסמן את קצה ה-RPE, הרקמה בעלת הפיגמנטציה הכהה שהוסרה. כאן מופיעה הקשתית, ולא ה-RPE.

אני ממליץ להסיר כמה שיותר מהקשתית מכיוון שהיא דביקה מאוד ויכולה להתקפל ולהידבק ל-RPE אם הרשתית העצבית מתקלפת או אם שאריות שלה נשארות דבוקות ל-RPE. סביר להניח שאחד משני דברים השתבשו. או שהעיניים לא קובעו כראוי, למשל למשך זמן רב מדי או קצר מדי, או שהן היו באחסון זמן רב מדי לפני הניתוח.

הדוושה שאני חושף כאן עדיין לא קיבלה את קיצור הדרך שלה. ניתן לראות כי הדוושה נמצאת במרחק של כשליש מקצה ה-RPE. זו הסיבה לכך שמומלץ להשתמש בשמונת קיצורי הדרך.

לאחר שהסרת את כל הרשתית העצבית, השתמש בפיפט כדי לשטוף את ה-RPE מספר פעמים עם 100 עד 200 µL של PBS עד להסרה מלאה של כל האבק והפסולת. טפטף באמצעות פיפט 80 עד 90 µL של 90% glycerol על זכוכית כיסייה נקייה בצורה מלבנית. שים לב, זהו הנפח האופטימלי של glycerol עבור זכוכית כיסייה בגודל 22 על 50 mm ויש להתאימו בהתאם.

עבור גדלים אחרים של זכוכית כיסוי, השתמש בקצה הפ pipette כדי לפרוס את הגליצרין. הקפד לא להחדיר בועות אוויר אל תוך הגליצרין. אם נוצרה בועה, גרור אותה אל הקצה שם היא תתפוצץ.

החליקו את הזרוע התחתונה של הפינצטה בגישה של 15 מעלות אל מתחת ל-RPE והרימו בזהירות, ולאחר מכן הורידו באיטיות את ה-RPE אל תוך הגליצרול. ה-RPE יצוף על פני הגליצרול ועשוי להתכווץ או להתפתל מעט. השתמשו בפינצטה כדי ליישר את ה-RPE ולהפיץ את הגליצרול על פניו.

אם נוצרות בועות אוויר, גררו אותן אל הקצה שם הן יתפוצצו, תוך החזקת זכוכית הכיסוי בזווית של כ-45 Degrees. התיקו אותה לקצה הגליצרין.

לאחר מכן, העבירו אותו לכיוון קצה הזכוכית. החזיקו את תחתית זכוכית הכיסוי בעזרת האגודל והאצבע המורה ותמכו בקצה הנגדי באמצעות פינצטה של 15 מעלות. הורידו את זכוכית הכיסוי לאט מאוד לכיוון הזכוכית ברגע שנוצר מגע.

בעת המגע עם ה-RPE, הפסיקו את ההורדה כדי לאפשר לגליצרול לנדוד, ולאחר מכן המשיכו להוריד את זכוכית הכיסוי באיטיות. אם תורידו את זכוכית הכיסוי במהירות רבה מדי, בועות אוויר עלולות להילכד בתוך הפיתוח. אני אוריד את זכוכית הכיסוי באיטיות בזמן שהיא נוגעת ב-RPE ואאפשר לגליצרול לנדוד.

ניתן לראות שכאשר אני משחרר את זכוכית הכיסוי במהירות, נוצרות בועות אוויר. השתמשו בכמות נדיבה של לק שקוף כדי להצמיד את קצות זכוכית הכיסוית לסלייד לאורך כל ההיקף.

זהו RPE טיפוסי מעכבר C 57 שחור. זהו מצב נורמלי לראות את כלי הדם התת-קרקעיים כפי שמסומן כאן. זהו גם מצב נורמלי לראות שונות מסוימת בפיגמנטציה, כגון אזורים שנראים פחות פיגמנטריים.

עם זאת, נקודות בהירות כגון זו נובעות ככל הנראה מנזק פיזי ל-RPE ולכורואיד שמתחתיו. מכיוון שגם הכורואיד של העין הוא פיגמנטרי, ייתכן שנזק ל-RPE שחור לא יבוא לידי ביטוי אם הכורואיד נותר שלם.

זהו RPE טיפוסי מעכבר עם דילול פיגמנט (dilute). כפי שניתן לראות, ניתן להבחין בכלי דם ותהיה שונות מסוימת בפיגמנטציה, כגון אזורים כהים יותר ואזורים בהירים יותר. עם זאת, כמעט בלתי אפשרי לזהות נזק ב-RPE של עכבר עם דילול פיגמנט.

האם כתמים קטנים אלו הם נזק או שהם שונות רגילה בפיגמנטציה? אני מציע לבצע צביעה ומיפוי כדי לבחון שאלה זו. הדבר ייתן לך מושג אם אתה מטפל ב-I two בצורה גסה מדי.

הצביעה ממסגרת בבירור את קרומי התאים, ובכך הופכת נקודות פגועות לבולטות, אך למעשה ה-RPE עמיד למדי, ואם תאחזו בעין דרך הקרנית, לא סביר שתגרמו לנזק. לפניכם דגימה שלמה (whole mount) עם שורה של בעיות, שהפשוטה שבהן, המצוינת כאן, היא שולי קרנית רחבים מדי, דבר שעלול להוביל לקמטות וקיפולים של החומר הגלי. ניתן לראות כאן רקמה חיצונית מאסיבית שנותרה בחלק האחורי של העין.

דוושה זו מקופלת חלקית, וכאן ניתן לראות שה-RPE נקרע חלקית. בעיה נוספת היא שלעין זו יש מראה של גלגל רוח. כאן סימנתי את זוויות החיתוכים.

עם זאת, כך הם היו אמורים להיראות. זכרו, החתכים שלכם צריכים להיות מאונכים למשיק ובקו אחד עם הקוטר. הרגע הדגמתי כיצד לבצע נתיחה של עין עכבר לצורך דגימה שלמה (whole mount) של הפיגמנט הרשתי.

בנוגע לאפיתל, הדבר החשוב ביותר הוא לשמור על יציבה נכונה, אך נסו להישאר רגועים. אני מקווה שמצאתם סרטון זה מועיל ומאחל לכם הצלחה רבה בניסוייכם העתידיים.