Name: תרבויות cerebellar Organotypic: אתגרים אפופטוטיים וזיהוי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: חקור את השפעת fast ligand על תרביות cerebellar אורגנוטיפיות מעכברים מסוג wild type ומוטנטים. שיטה זו מאפשרת ניתוח אפופטוזה בתאי מוח באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית ומספקת תובנות לביולוגיה של תאי עצב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן בחלקו על ידי קרן IPSEN. IMV היא האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן פרופ &#39;לביולוגיה מולקולרית, ואת הקתדרה ארווין וג&#39;ואן ג&#39;ייקובס במדעי החיים למופת. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תרומות של NIH, Leducq Foundation, קרן Meriaux, אליסון רפואי הקרן, Ipsen / Biomeasure, סאנופי אוונטיס, סרטן הערמונית קרן, ואת ח&quot;נ ופרנסס ג קרן ברגר. PAS ממומנת על ידי הקרן קרן מק &#39;נייט למדעי המוח לבין המכון הלאומי לשימוש בסמים (R01 DA019022). המחברים מבקשים להודות מרק שמיט. אמנות גרפי תוכנן על ידי ג&#39;יימי טי סיימון. חסות סופק על ידי חביב Invitrogen.

1. תרבויות cerebellar Organotypic: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור בהצלחה תרבויות cerebellar organotypic להשתמש בעכברים בין P0-P3 או P8-P12. לצורך ניסוי שלנו השתמשנו עכברים בטווח P8-P12 כי זה שלב התפתחותי היה מתאים יותר במחקר שלנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את לנתיחה ואת בינוני תרבות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיסקציה המוח והכנת פרוסה מתבצעות מלאכותית נמוך נוזל המוח והשדרה נתרן (ACSF) המכיל סידן כלוריד 1mm, 10mm D-גלוקוז, 4mm אשלגן כלורי, מגנזיום כלוריד 5mm, סודיום ביקרבונט 26mM, סוכרוז 246mM פתרון פנול אדום (1:1000) , pH 7.3. כדי לעקר את הפתרון, לסנן אותה דרך פילטר 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוסות cerebellar הם בתרבית 75% מינימום בינוני הנשר חיוניים (ממ), 25% חום מומת סרום סוס, HEPES 25mm, 1mm גלוטמין, 5 מג / מ"ל ​​גלוקוז, פניצילין (100 U / mL) וסטרפטומיצין (100 U / mL). סינון בינוני דרך פילטר 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס לכל היותר שבועיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח מוח קר כקרח בינוני ACSF מבעבע בעבר עם Carbogen (95% חמצן ופחמן דו חמצני 5%) שים לב, כי הרוויה עם Carbogen תשנה את ה-pH של התמיסה כך יעבור מאדום לכתום. דיסקציה צריכה להתבצע במינימום זמן אפשרי נזהרים שלא לפגוע במבנה המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פורסים את המוח בסעיפים sagittal של 400 מיקרומטר באמצעות vibratome. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך sagittal בסכין גילוח בהמיספירה אחת, מנסה לחתוך כמה שפחות של המוח הקטן, זה יספק משטח שטוח עבור חיתוך. קליפת המוח משמשת רק תמיכה על מנת להפוך את חיתוך קל אך מאז היא נושא חשוב זה נוח יותר לחתוך את החצי מקורי של קליפת המוח עם סכין גילוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש cyanoacrylate (הפלא) כדי לתקן את המיקום של המוח על הצלחת vibratome מתכת. חשוב לצנן את הצלחת על הקרח לפני הוספת דבק להפיץ אותו היטב בעזרת קצה של הצינור כדי ליצור שכבת דבק דקה. אם יש עודף של הפלא, זה יהיה לנתק מהצלחת כשמדובר במגע עם ACSF ואת מדגם יאבדו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהמוח מחובר הצלחת vibratome, מספיק להוסיף מדיה ACSF כדי לכסות את המוח לשים קרח מתחת הצלחת לשמור את זה קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים פרוסות 400 מיקרומטר ולהעביר אותם עם פיפטה פסטר מפלסטיק (לחתוך את קצה להרחיב אותו ולמנוע נזק פרוסות) אל צלחת 6-גם תא המכיל תרבות ACSF על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את המוח הקטן משאר חלקי המוח בעזרת שני מזרקים אינסולין (מזרקים עם קוטר קטן 28-מד מחטים) תחת המיקרוסקופ לנתח. כמה פרוסות יהיה הפלא המצורפת את הקצוות: זה הרגע כדי לנסות להסיר את זה כמו שזה יכול להשפיע על הכדאיות של הפרוסה. חשוב לעשות זאת בזהירות מבלי לפגוע במבנה המוח הקטן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את פרוסות cerebellar עד 6-30mm היטב צלחות המכילות צלחת מוסיף תרבות עם נקבוביות 0.4 מיקרומטר. הוסף 1 מ"ל של התקשורת בתרבות לכל טוב, זה היה טרום מותנה הדגירה של לפחות 2 שעות ב 37 ° C ו 5% CO 2 (בתרבות תא חממה). מניחים את מוסיף על גבי מדיה לוודא שאין בועות אוויר שנלכדו מתחת ולאחר מכן למקם את פרוסות המוח הקטן (1-3 לכל הכנס) על גבי מוסיף לוודא שהם המורחבת מלא וכי אין נוזל מכסה אותם. לשאוב עודף של התקשורת במידת הצורך. לדגור על 37 ° C ו 5% CO 2 לשנות את התקשורת בכל תרבות 2 או 3 ימים. מומלץ להחליף רק חלק בינוני (למשל נפח ½) בבת אחת, שכן המדיום המשמש מכיל פרוסה הנגזרות trophic גורמים חשובים להישרדות התא. </li></ol> 2. פאס טיפול מכתים של Slices cerebellar: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך ניסוי האתגר אפופטוטיים, אנחנו בתרבות הראשון פרוסות במשך 5 ימים שינוי התקשורת ביום במבחנה 3 (DIV3). ביום DIV5 תרבויות מטופלים עם 0.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​של Jo2 אגוניסט פאס נוגדן ידי הוספתו ישירות לתקשורת על מנת לקבל רקע נקי של מוות של תאים מאז השינויים של התקשורת יכול לגרום כמה התמותה התרבויות. מחצית הבארות הם מטפלים כפקדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות להסיר את המדיה מתחת מוסיף את ידי יניקה. כדי לתקן את הפרוסות, להוסיף 1 מ"ל של קרים כקרח PFA 4% מתחת ו 1 מ"ל לעיל להכניס את. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 10 דקות להסיר את PFA לשטוף קצר עם PBS קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבא להסיר את PBS ולהוסיף 1 מתחת מ"ל ו 1 מ"ל לעיל להכניס של מתנול קר כקרח 20% PBS ו דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו שוב עם PBS ולהוסיף 1 מ"ל ו 1 מ"ל מתחת מעל להכניס את של 0.5% Triton-X-100 ב PBS עבור permeabilization. דגירה למינימום של 12 שעות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר permeabilization, בלוק עם BSA 20% PBS עבור מינימום של4 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° C. בשלב זה הפרוסות יכולים להישמר פתרון חסימת לפחות 3 ימים 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת כתם הפרוסות בזהירות לחתוך את פיסת קרום להכניס המצורפת הפרוסה cerebellar ולהעביר אותו 24 גם צלחות המכילות PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Immunostaining נעשית ברצף, תחילה לשעה אחת ואז עם נוגדן Calbidin לילה עם מגיב TUNEL. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב PBS ולהוסיף 250 μL את מגיב TUNEL לתוך זה גם לוודא שהוא מכסה את כל פני השטח של הפרוסה. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה להסיר את תערובת TUNEL ולשטוף עם PBS שלוש פעמים במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף האחרון, להסיר את PBS ולהוסיף 250 μL של דילול 1 / 1000 של הנוגדן Calbindin ב PBS ו דגירה לילה בשעה 4 ° C בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון נוגדן ראשוני ולשטוף עם PBS שלוש פעמים במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 250 μL של נוגדנים משני בדילול 1 / 500 ב PBS ו דגירה של לפחות שלוש שעות בטמפרטורת החדר בחושך. הערכה TUNEL השתמשנו התווית TMR אדום, ולכן נוגדנים משני שלנו Calbindin הוא מצומדות כדי Alexa-488. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים במשך 10 דקות עם PBS ואת ההר פרוסות גבי זכוכית מיקרוסקופ באמצעות התקשורת הרכבה המכיל DAPI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה הפרוסות עם מיקרוסקופ confocal באמצעות 488 nm ו 561 nm עירור wavelenght עבור Calbindin ו TUNEL בהתאמה. </li></ol></li></ol> 3. נציג תוצאות: האתגר העיקרי של פרוטוקול זה להיות מסוגל ליצור בריא תרבויות פרוסה cerebellar, במיוחד מאז readout הסופי שלנו יהיה מוות של תאים. תרבות בריאה מופיע אחד שבו שכבת גוף התא הוא שקוף ומאפשר לך לראות את המבנה foliated של המוח הקטן מתחת למיקרוסקופ (איור 1). אחרי כמה ימים בתרבות פרוסות מתחילים התאים דק ולא נוירונים ניתן לצפות נודדות הרחק בשוליים של הפרוסה. התאים עגול כהה (מקרופאגים סביר ביותר) שמכסים את פרוסות אחרי כמה ימים בתרבות, בסופו של דבר לירידה במספר לאחר 10-14 ימים במבחנה (איור 2) 5. ההוכחה האולטימטיבית עבור לקיומה של פרוסות היא כתם על סמנים סלולריות שונות, כגון Calbindin עבור התאים פורקינג'. איור 3 מראה תמונה נציג מיקרוסקופ confocal של שכבת תאים פורקינג' עם גרעינים TUNEL מספר חיובי. חשוב לקחת בחשבון כי גם אם כמה פרוסות קיבל גירוי אפופטוטיים, הם נחשפו רק למשך 24 שעות. זה איפשר מספיק זמן כדי לבחון פיצול ה-DNA בתאים מתים עם מכתים את TUNEL, אבל תא מוגדר שכבת פורקינג' עדיין נוכח. <img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. פרוסה cerebellar בריא DIV2. תמונה זו מציגה את תא שקוף הגוף שכבת ומבנה cerebellar foliated ב פרוסה בריא. <img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. פרוסה cerebellar בריא ב DIV 7. בתמונה זו אנחנו עדיין יכולים לראות את המבנה foliated של המוח הקטן ואת המראה של גופי התא כהה. <img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. תמונה נציג פרוסה פאס שטופלו cerebellar. Confocal תמונה זו מראה את התאים פורקינג' מוכתם Calbindin (ירוק) לבין תאים אפופטוטיים חיובית מכתים TUNEL (אדום). תאים פורקינג' אינם מופיעים בשורה אחת, אלא מקובצים היוצרים מבנה דמוי folium.

<ol><li>Hogue, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fetal+ependymal+cells+in+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Human fetal ependymal cells in tissue cultures.</a> Anat Rec. 99, 523-529 (1947).</li>
<li>Hogue, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+studies+of+human+fetal+brain+cells+in+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Etudes+Neonatales%22%5BJournal%5D)">Review of studies of human fetal brain cells in tissue cultures.</a> Etudes Neonatales. 1, 1-13 (1952).</li>
<li>Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+protocol+for+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Staining protocol for organotypic hippocampal slice cultures.</a> Nat Protoc. 1, 2452-2456 (2006).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Beat, H., Gähwiler, S. M. T., McKinney, R. A., Debanne, D., Robertson, R. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBeat%2C+H+%22Organotypic+Slice+Cultures+of+Neural+Tissue+in+Culturing+Nerve+Cells%22">Organotypic Slice Cultures of Neural Tissue in Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. 461-498 (1998).</li>
</ol>

לעבוד כל בעלי החיים שנערך נעשה בהתאם למדיניות שקבע IACUC. ממכון סאלק הוא מתקן מוכר AAALAC.

שיטה זו מתארת ​​את אחד יישומים אפשריים רבים של תרבויות organotypic עצבי והיא אפשרה לנו ללמוד את ההשפעה של גירויים אפופטוטיים בסוג בר פרוסות cerebellar מוטציה. החלק הקריטי ביותר של ניסוי זה הוא להיות מסוגל לייצר בעקביות בריא תרבויות פרוסה cerebellar. הגורמים העיקריים הם לנתיחה וטכניקה לחתוך את היכולת לבצע את הפרוטוקול בזמן שפחות, אבל באותו הזמן נזהר לא לפגוע פרוסות. גורם נוסף חשוב הוא הכנה הרכב של התקשורת תרבות, תרבויות אלה רגישים מאוד, ולכן היינו צריכים לבדוק כמה מתכונים המותגים ואת התקשורת. גם קבוצות שונות של סרום או כל רכיב אחר של התקשורת להשפיע על הכדאיות של הפרוסות. קיבלנו את התוצאות הטובות ביותר עם סרום הסוס ממגרש Invitrogen # 480116. לאחר פרוסות cerebellar נוצרות אחד יכול ללמוד פיתוח cerebellar, electrophysiology, הישרדות התא לבד או בתגובה לגירויים אפופטוטיים, excitotoxicity או מחסור בחמצן. מחקרים השוואתיים באמצעות סוג בר פרוסות cerebellar מוטציה כבר תובנה מאוד בהיבטים רבים של פיתוח פונקציה cerebellar ו.

<table><tbody><tr><td>MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11090</td><td></td></tr><tr><td>סרום סוסים</td><td>Invitrogen</td><td>16050</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Invitrogen</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>גלוטמין</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומייצין</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>דבק מהיר (Superglue)</td><td>Krazy Glue</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פלטות תרבית תאים 6 בארות / 24 בארות</td><td>Corning</td><td>3506/ 3527</td><td></td></tr><tr><td>הכנסות (inserts) לפלטת תרבית 30mm (נקבוביות 0.4-&amp;mu;m)</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן Hamster anti-mouse CD95 (Jo2) מופק NA/LE</td><td>BD Biosciences</td><td>554254</td><td></td></tr><tr><td>ערכה לזיהוי מוות תאי &lt;em&gt;In situ&lt;/em&gt;, TMR red</td><td>Roche Group</td><td>12 156 792 910</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן Rabbit anti-Calbindin D-28k</td><td>Swant</td><td>CB-38a</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן משני Alexa 488-goat anti-rabbit IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>תווך קיבוע Vectashield עם DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דיסקציה</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ויברטום (Vibratome)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקאלי</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

תרבויות cerebellar organotypic: אתגרים אפופטוטיים וזיהוי

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

תרבויות Organotypic של רקמה עצבית הוצגו לראשונה בשנת 1947 על ידי הוג 1,2 ו היוו פריצת דרך בתחום מדעי המוח. מאז, הטכניקה פותחה עוד יותר, וכיום ישנם דרכים רבות להכין תרבויות organotypic. השיטה המוצגת כאן הותאמה מזו המתוארת על ידי Stoppini et al. להכנת פרוסות ומן Gogolla et al. עבור ההליך מכתים 3,4. תכונה ייחודית של הטכניקה הזו הוא שהיא מאפשרת לך ללמוד בחלקים שונים של המוח כגון ההיפוקמפוס במוח הקטן או במבנה המקורי שלהם, מתן יתרון גדול על פני תרבויות ניתק שבו כל ארגון הסלולר רשתות נוירונים הם שיבשו. במקרה של המוח הקטן זה עוד יותר יתרון משום שהוא מאפשר את המחקר בתאי פורקינג&#39;, קשה מאוד להשיג כתרבות העיקרית ניתק. שיטה זו יכולה לשמש כדי לחקור תכונות התפתחותי מסוים של המוח הקטן במבחנה, כמו גם עבור ניסויים אלקטרו תרופתי מסוג שני בר עכברים שעברו מוטציה. השיטה המתוארת כאן נועד לחקור את ההשפעה של גירויים אפופטוטיים כגון ליגנד פאס במוח הקטן המתפתח, באמצעות מכתים TUNEL למדוד מוות של תאים אפופטוטיים. אם מכתים TUNEL משולב עם סמנים סוג תא מסוים, כגון Calbindin עבור תאים פורקינג&#39;, אפשר להעריך מוות של תאים באופן תא אוכלוסייה ספציפיים. מכתים Calbindin גם משרתת את המטרה של הערכת האיכות של תרבויות cerebellar.

שיטה זו מתארת ​​את הדור של תרבויות cerebellar organotypic ואת ההשפעה של גירויים מסוימים אפופטוטיים על הכדאיות של סוגי תאים שונים cerebellar.

תרבויות cerebellar Organotypic: אתגרים אפופטוטיים וזיהוי

תרביות אורגנוטיפיות של רקמה עצבית הוצגו לראשונה על ידי Hogue בשנת 1947 1,2 והיוו פריצת דרך משמעותית בתחום מדעי המוח. ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לבחון את השפעת הגירוי האפופטוטי fast ligand במוחון מתפתח של עכברים מסוג בר (wild type) ועכברים מוטנטים. מטרה זו מושגת תחילה על ידי דיסקציה של המוח של עכברי wild type ועכברי knockout בין הימים השמינית והשנית-עשרה לאחר הלידה. השלב השני הוא חיתוך המוחות לפרוסות בעובי 400 micrometer ובידוד המוחון מכל פרוסה.השלב השלישי הוא גידול של פרוסות ה cerebellun למשך חמישה ימים כדי לוודא שהן בריאות לפני השראת מוות תאי באמצעות fast ligand. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא ניתוח ההשפעה של fast ligand באוכלוסיות תאי cerebellun שונות של עכברי wild type ועכברי knockout, בהתבסס על צביעה אימונופלואורסצנטית עבור המרקר האפופטוטי tunnel, בשילוב עם מרקרים ספציפיים לסוג התא כמו calbindin עבור תאי bikini. היתרון המרכזי של תרביות חיים של ה cerebellun הוא שהן מאפשרות את שימור המבנה האזורי של ה cerebellun, בניגוד לתרביות ראשוניות מפוזזות שבהן הרשתות הנוירונליות והארגון המרחבי משובשים.כך נושא זה יאפשר לענות על מספר שאלות מפתח במדעי העצבים, במיוחד מכיוון שקיימים העכבר מסוג הפרא (wild type) והעכבר המוטנטי. לכן ניתן לחקור התפתחות השוואית, פיזיולוגיה, וכן אלקטרופיזיולוגיה ופרמקולוגיה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי תפקוד ה-fast ligand בהישרדות תאים או במערכת המוח הקטן (cerebellar), ניתן להשתמש בה גם לבחינת ההשפעות של fast ligand בקליפת המוח ובמרכז ההיפוקמפוס.בדרך כלל, אנשים שאינם מיומנים בשיטה זו יתקלו בקשיים, מכיוון שכדי להשיג ליזיס בריא של הדגימות מהמוחון, קריטי להעביר אותן לתרבית במהירות המרבית מבלי לפגוע בשלמותן. לכן, חשוב לרכוש מיומנויות נשחור ופריסה טובות לפני הניסיון לבצע את התהליך כולו, במידת האפשר.יש לבצע את השלבים של הפרוצדורה הבאה במנדף לתרביות רקמה לפני הניתוח. הכינו מצע A CSF לניתוח המוח ולהכנת הפרוסות, וכן מצע לתרביות פרוסות בהתאם לפרוטוקול הכתוב, ואחסנו אותם בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס ביום הניתוח. הכינו פלטות לתרביות רקמה עבור תרביות של פרוסות השחמון.הוסיפו מיליליטר אחד של מצע גידול לפרוסות לכל באער של פלטת שש באערים. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה סטרילית כדי להניח את התבניות להכנסה לפלטת הגידול בכל באער. ודאו שאין בועות אוויר כלואות מתחת לתבנית.הנח את צלחת התרבית בתוך אינקובטור לתרביות רקמה המכוון ל-37 °C ו-5% carbon dioxide למשך שעתיים לפחות כדי להכשיר את המצע. לאחר מכן, הזרם בועות של גז carbogen אל תוך מצע CSF קר מאוד. רוויית המצע ב-carbogen משנה את ה-pH של התמיסה וגורמת לשינוי צבע מאדום לכתום.שפכו כמות קטנה של מדיום A CSF מאוורר וקר מאוד לתוך צלחת פטרי סטרילית ולתוך פלטת שש בארות. הניחו אותן על קרח יחד עם הפלטה של ה-vibrato שמשמשת לפריסות של המוח. צלחת הפטרי המכילה מדיום A CSF מאוורר וקר מאוד תשמש להוצאת המוח מגור עכבר בגיל P8 עד P12 לאחר הניתוח.השתמשו בלהב תער כדי לבצע חיתוך סגיטלי באחד ההמיספרים כדי לספק משטח שטוח להצמדה לפלטת הוויברם (vibram plate). ניתן לחתוך גם את החלק הרוסטרלי של הקורטקס. ייבשו את פלטת הוויברם המקוררת בעזרת נייר סופג.לאחר מכן, יש להוסיף מעט דבק מהיר (super glue) לבמה ולפרוס אותו בתבנית זיגזג באמצעות קצה שפופרת הדבק. כדי ליצור שכבת דבק דקה, השתמש במרית כדי להעביר את המוח לבמת הוויברטום, כאשר הצד השטוח בא 접ת לדבק המהיר. ברגע שהמוח מודבק לפלטת הוויברטום, הוסף מספיק מדיום A CSF כדי לכסות את המוח, והנח קרח מתחת לפלטה כדי לשמור עליה קרה.חתוך את המוח לפרוסות בעובי 400 micrometer. לאחר מכן, השתמש בפיפטת פלסטיק רחבה בקצה החתוך כדי להעביר את הפרוסות לפלטת שש בורות המכילה A CSF media על קרח, בעבודה תחת מיקרוסקופ דיסקציה.השתמשו בשתי מזרקי אינסולין עם מחטים בעלות קוטר קטן של 28 gauge כדי להפריד את ה-cerebellum משאר המוח. אם על קצוותיהן של חלק מהפרוסות יש דבק מהיר (super glue), השתמשו בשתי מחטי המזרקים כדי להסיר את הדבק מהפרוסה. השתמשו בפ pipette פלסטיק מסוג pasta עם קצה חתוך ומורחב כדי להעביר את הפרוסות לחלק העליון של המסננים.הוספת פרוסה אחת עד שלוש לכל תבנית מבטיחה שהפרוסות פרושות לחלוטין וששום נוזל אינו מכסה אותן. במידת הצורך, שאבו עודפי מצע בעזרת פיפטה. דגרו בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide למשך 48 שעות. לאחר 48 שעות, החליפו מחצית מנפח המצע במצע טרי, תוךما לוודא שאין בועות אוויר כלואות תחת התבנית.המצע המקורי שנותר מכיל גורמים טרופיים נגזרים פרוסים החשובים להישרדות התאים. אתגר האפופטוזה מבוצע לאחר חמישה ימי תרבית. הוסף את הנוגדן האגוניסטי המהיר JO two למצעי תרבית התאים בבארים המיועדות לטיפול.השאירו מחצית מהבארים ללא טיפול כביקורות. לאחר שיחלפו 24 שעות, שאבו את המצע מהבארים. לאחר מכן, קבעו את הפרוסות על ידי הזרקה של מיליליטר אחד של 4%paraldehyde קר במיוחד תחת המאחז (insert) ומיליליטר אחד של PFA מעל המאחז.יש להניח לפרוסות להיקבע ב-PFA במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. שאי את ה-PFA ושטוף קצרה באמצעות פיפטא של שני מיליליטר של PBS קר: מיליליטר אחד מעל למבנית (insert) ומיליליטר אחד מתחת למבנית.בשלב הבא, שאבו את ה-PBS והעבירו בפיפטה מיליליטר אחד של 20% methanol קר ב-PBS מתחת לרכיב המאפשר מעבר (insert) ומיליליטר אחד מעליו. הדגירו למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שאבו את ה-20% methanol מהבאר ושטפו את הפרוסה ואת הבאר באמצעות PBS. כפי שנעשה קודם לכן, העבירו בפיפטה מיליליטר אחד של 0.5% Triton X 100 ב-PBS מעל לרכיב המאפשר מעבר, ומיליליטר נוסף מתחתיו.דגרו למשך 12 שעות לפחות בטמפרטורה של four degrees Celsius כדי להחדיר את החומרים לפרוסות לאחר הפרמיאציה. שאבו את ה-0.5%Triton X 100 ב-PBS והעבירו בפיפטה מיליליטר אחד של 20%BSA ב-PBS על גבי הפרוסה ומיליליטר אחד מתחת לפרוסה. חסמו את הפרוסות למשך ארבע שעות לפחות בטמפרטורת החדר או למשך לילה ב-four degrees Celsius.עם סיום החסימה, השתמשו במספריים נקיים כדי לחתוך בזהירות את פיסת תאית הממברנה המחוברת לפרוסת הדגימה מהמוח הקטן. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה נקייה להעברת פיסת הממברנה לפלטה בעלת 24 בארות המכילה PBS; שאבו את ה-PBS והוסיפו 250 microliters של Reagent TUNEL לכל באר. ודאו שהריאגנט מכסה את כל פני השטח של הפרוסה.דגרו בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך שעה אחת בחשכה. עם תום השעה, שאבו את ריאגנט המנהרה (tunnel reagent) מהבארות והחליפו אותו ב-500 µL של PBS. הגנו על הפלטה מאור ודגרו אותה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות לצורך שטיפה.חזור על תהליך זה פעמיים לאחר השטיפה האחרונה. שאב את ה-PBS והוסף 250 µL של נוגדן calbindin בדילול של 1:1000 ב-PBS, ודגור למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C בחשיכה. למחרת.שאבו את תמיסת הנוגדן הראשוני ושטפו עם PBS 3 פעמים למשך 10 דקות. לאחר מכן, הוסיפו 250 microliters של נוגדן משני המדולל ביחס של 1:500 ב-PBS. כסו את הפלטה בנייר אלומיניום כדי להגן עליה מהור, והדגרימו למשך שלוש שעות לפחות בטמפרטורת החדר לאחר ההדגירה.שטפו את הפרוסות שלוש פעמים למשך 10 דקות עם PBS והשתמשו בתסקיט קיבוע (mounting media) המכיל dappy. קבעו את הפרוסות על גבי זכוכית מיקרוסקופ, סלייד וכיסוי זכוכית. דגמו את הפרוסות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי תוך שימוש באורכי גל עירור של 488 nanometer ו-561 nanometer עבור kale, bendin ו-tunnel בהתאמה.תמונה זו מציגה פלח בריא של הדגיש (cerebellum). לאחר יומיים in vitro, שכבת גופי התאים נראית שקופה והמבנה העלילי של הדגיש נראה בבירור תחת המיקרוסקופ. לאחר שבעה ימים in vitro, המבנה העלילי של פלח הדגיש הבריא עדיין נראה.בנוסף, גופי תאים כהים, ככל הנראה מקרופגים, מכסים בדרך כלל את הפרוסה. התמונה הקונפוקלית המוצגת כאן מייצגת פרוסת מוח דגנים (cerebellum) שעברה טיפול מהיר. תאי הביקיני מופיעים בירוק לאחר צביעה עם נוגדן ראשוני, ולאחריו נוגדן משני המשורשר ל-Alexa 488.התאים האפופטוטיים החיוביים לצביעת tunnel מופיעים באדום, מכיוון שערכת ה-tunnel שבה נעשה שימוש מסומנת ב-TMR. תאי Bikini אדומים אינם מופיעים בשורה אחת, אלא כצבירים היוצרים מבנה דמוי כזה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לעבוד במנדף לתרביות רקמה במידת האפשר, ולמזער את משך הזמן שבו הרקמה המוחית חשופה למזהמים פוטנציאליים כגון חיידקים או פטריות.באמצעות פרוצדורה זו, ניתן להחיל שיטות נוספות על פרוסות אלו, כולל אנליזות ביוכימיות ואלקטרופיזיולוגיות, כדי לספק מידע נוסף על תכולת החלבונים וכן על העירור העצבי. טכניקה זו פותחה במקור כדי לחקור את ההשפעה של מוות תאי מתווך מהיר בתאי פריקין הנושאים מוטציות המשפיעות על המסלול המהיר. תאי פריאל נשארים בחיים לעיתים רחוקות בתרבית ראשונית.לכן, הליך זה היה הגישה הניסויית הטובה ביותר. אני מקווה שלאחר צפייה בסרטון זה, יהיה לכם מושג טוב לגבי האופן שבו ניתן להכין פרוסות של המוח, וכיצד ניתן לחקור את הגירויים האפתתיים ואת השפעתם על סוגי תאים מוחיים שונים.

organotypic-cerebellar-cultures-apoptotic-challenges-and-detection

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

Live-תא הדמיה של אפופטוזיס caspase-3 בתיווך ב-N19 oligodendrocyte תרבויות הנציח התא...

ביקע ניטור caspase-3 פעילות אפופטוזיס של תאים Oligodendroglial הונצח באמצעות Live-תא הדמיה Cleaveable Fluorogenic-צבע מצעים בעקבות שלילת קוטביות אשלגן-Induced ממברנה

אנו מציגים פרוטוקול המאפשר להציג וכמותית לתחת המורפולוגיה של העץ הדנדריטי של תאים בודדים פורקינג' גדלו בתרבויות פרוסות cerebellar organotypic. פרוטוקול זה נועד לקדם מחקרים על המנגנונים של התפתחות הדנדריטים תא פורקינג'.

הניתוח של מורפולוגיה דנדריטים סלולרי פורקינג&#39; בתרבויות Slice Organotypic

סרטון זה מדגים טכניקה להשגת פרוסות אורגנוטיפיות של המוח הקטן ממוחו של גור עכבר וטיפוח הפרוסות במדיה בתוספת חומרים מזינים וגורמי גדילה כדי לחקות את התפתחות המוח הקטן במבחנה. בנוסף, פרוסות צרבלריות ספציפיות מטופלות בתרכובת בדיקה, ויכולת ההגנה העצבית של התרכובת מנותחת באמצעות טכניקת צביעה אימונופלואורסצנטית.

ניתוח הישרדות תאי Purkinje בתרביות פרוסות צרבלריות אורגנוטיפיות

סרטון זה מדגים את השיטה לזיהוי תאי עצב מתרבית מעורבת של תאי עצב גרגיריים צרבלריים ותאי גלייה באמצעות צביעה כפולה עם דיאצטט פלואורסצאין (FDA) ופרופידיום יודיד (PI), כאשר נוירונים חיים מופיעים ירוקים ונוירונים מתים מופיעים באדום.

הערכת הכדאיות העצבית בתרבית נוירונים במוח הקטן באמצעות צביעה כפולה

השכבה החיצונית של המוח הקטנה הגרגר היא האתר של ההגברה המעבר הגדולה ביותר במוח המתפתח. כאן, אנו מציגים פרוטוקול למקד שינוי גנטי לשכבה זו בשיאו של שגשוג באמצעות vivo electroporation והתרבות של פרוסות המוח הקטן לשעבר מעובר חומוס עוברי יום 14.

אקס תרבות Vivo של פרוסות המוח הקטן אפרוח וממוקד מרחבית Electroporation של מבשרי תא גרגיר

פרוטוקול זה מתאר כיצד למדוד במדויק הכדאיות העצבית באמצעות fluorescein diacetate (FDA) ו Propidium Iodide (PI) מכתים פעמיים בתרבית נוירונים גרגר cerebellar, התרבות העצבית הראשית המשמשת במודל חוץ גופית בתחום מדעי המוח ומחקר neuropharmacology.

הערכת הכדאיות העצבית באמצעות פלואורסצין Diacetate-Propidium יודיד מכתים פעמיים Cerebellar גרגר Neuron תרבות

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה עבור בידוד ואת culturing נוירונים גרגר מוחי העכבר הראשי (CGNs) מן הגורים בת 6-7 יום, התמרה חושית יעילה של CGNs להפסד ורווח של תפקוד לימודי, דגמי NMDA-induced excitotoxicity עצביים, מוות של תאים נמוך-אשלגן-induced נזק לדנ א, לחץ חימצוני באמצעות המודל באותה תרבות.

מידול מוות עצביים והתנוונות בנוירונים גרגר אסטרוציטומה העיקרי העכבר

כאן אנו מציגים שיטה להכין organotypic פרוסה תרבויות מן המוח הקטן העכבר מיאלין, צביעת על-ידי אימונוהיסטוכימיה מתאים לחקור מנגנונים של myelination ו- remyelination במערכת העצבים המרכזית.

Immunostaining של Myelinating Organotypic פרוסה אסטרוציטומה תרבויות והכנה

ניהול ניסויים בלתי מתורבת כדי לשקף את התנאים הvivo ככל האפשר, אינו משימה קלה. השימוש בתרביות תאים ראשונית הוא צעד חשוב להבנת הביולוגיה התאית באורגניזם שלם. הפרוטוקול שסופקו מתאר כיצד לצמוח בהצלחה תרבות עובריים העכבר מתחלקים נוירונים.

התרבות הראשית של הנוירונים מבודדים מתוך עכבר ממוח עובריים

תרביות פרוסות אורגאותיות הן כלי רב-עוצמה לחקר תהליכים נוירוהתפתחותיים או ניווניות. כאן, אנו מתארים פרוטוקול כי מודלים המוות הנוירולוגי של תאים Purkinje בתוך העכבר המוח פרוסה בתרבויות. שיטה זו עשויה להועיל מחקר בגילוי של תרופות נוירוהגנה.

הישרדות התאים purkinje בתרביות פרוסה בלבלר

תאי Purkinje במוח הקטן (PC) רגישים במיוחד לליקויים בתגובת הנזק לדנ"א. פרוטוקול מוצג להערכה חזותית של הדינמיקה של תגובת PC לנזק לדנ"א, הכוללת צביעת שרשראות פולי קשורות לחלבון (ADP-ריבוז) בתוך תרביות אורגנוטיפיות במוח הקטן.

הדמיה של תגובת נזק לדנ"א בתאי Purkinje באמצעות תרביות אורגנוטיפיות במוח הקטן

חקור את השפעת fast ligand על תרביות cerebellar אורגנוטיפיות מעכברים מסוג wild type ומוטנטים. שיטה זו מאפשרת ניתוח אפופטוזה בתאי מוח באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית ומספקת תובנות לביולוגיה של תאי עצב.

תרבויות cerebellar Organotypic: אתגרים אפופטוטיים וזיהוי

גלה סרטונים נוספים