Name: התנהגות הנדידה של תאים שנוצר תרבויות רוממות Ganglionic (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-21T11:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: למדו לחקור התנהגות נדידה של תאים מבליטת הגנגליון בתרביות תלת-ממדיות באמצעות צילום time-lapse. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר תנועות תאים בודדים בתגובה לחלבונים מקליפת המוח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי DoD גרנט PT074620 (SLJ) ו-NIH גרנט R01NS245014 (SLJ).

1. מגיב הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירי Matrigel קפוא על קרח רטוב, ומשאיר מספיק זמן לפני הניסוי (אין להאיץ את התהליך על ידי חימום פעיל). Matrigel משמש להקים סביבת 3D הדומה תאי מטריקס תורמת הנדידה של התאים. הוא מספק תאים עם שני מצע מכני encasing. Matrigel מאוחסן קפוא ב -20 ° C. לפני השימוש, זה צריך להיות הביאה בהדרגה עד לטמפרטורה של 0-4 מעלות צלזיוס, כלומר מופשר על קרח רטוב או במקרר. Matrigel בלתי הפיך סטים כדי ליצור ג'ל בטמפרטורה של הדגירה (37 ° C). לכן לא מומלץ לזרז את הפשרת ידי טבילה את המיכל במים חמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שברים חלבון מוכנים ידי התמקדות isoelectric (IEF) של תמצית החלבון הכולל של קליפת המוח של יום הלידה 0 (P0) החמוס. לאחר ההפרדה, שברים הם dialyzed לילה נגד pH7.2 20mm טריס-HCl כדי לנקות את קטעים המרכיבים חיץ התמקדות, אשר עשוי להיות רעיל הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אספקת חלבון המערכת. חלבונים מופק בקליפת המוח הם adsorbed על חרוזים לטקס פלורסנט אשר ואז לאט לאט לשחרר את החלבונים עד environment.We מצאו כי התכונה הקרינה מסייעת בטיפול החזותי של microspheres ומאפשר זיהוי קל של גלישת אפילו מינימלי מהאתר של חרוז ההפקדה, כאשר צפו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10μl של חרוזי ניאון 100-200μl של פתרון חלבון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 30 דקות בחושך ב RT על שייקר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין החרוזים מטה בצנטריפוגה ספסל עבור 1 שעות בבית מהירות מרבית </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות במערבולת באמצעות 10μl של מדיום חדש </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 30μl של Matrigel על ההשעיה, ומערבבים היטב, ומניחים על קרח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Buffers התקשורת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן סינון לעקר מלאכותי הנוזל השדרתי (aCSF; NaCl 124mM, NaHCO 3 26mM, לאא 2 PO 4 1.2 מ"מ, KCl 3.2mM, MgSO 4 1.2 מ"מ, CaCl 2 2.4mM, גלוקוז 10mm). סלאש, להקפיא את aCSF מראש, כך שזה מוכן בזמן דיסקציה רקמות. כדי לעשות את זה, במקום בקבוק פלסטיק מלא aCSF סטרילי בתוך מקפיא -80 מעלות צלזיוס. צג הקפאת כל כך הרבה פעמים, אז מתי שכבת הקרח מצטבר על הצד הפנימי של הקיר, לשבור אותו לערבב עם הנוזל. חזור על הפעולה עד הבקבוק מכיל בעיקר ברד קפוא. מאגר מוכן בדרך זו לא רק תומך הישרדות רקמות, אלא גם להחזיק בטמפרטורה נמוכה יותר, היא מכנית פחות מזיק לרקמות מאשר קוביות קרח עבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני Neurobasal עם N-2 ו-B-27 תוספי הוסיף על פי הצעות של היצרן, כמו גם 1mg/100ml gentamycin, 2 מ"מ L-גלוטמין, וגלוקוז 0.6%. לעקר על ידי סינון דרך קרום 0.22μm. להתחמם על 37 מעלות צלזיוס עד לשימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות צלחות <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיתה תרבות פלסטיק שש צלחות מוכנים היטב על ידי מנקדים כל טוב במרכזו עם כמות קטנה (כ 2μl) של Matrigel קר באמצעות קצה 20μl פיפטה, ומיקום coverslip autoclaved עגול זכוכית 18mm על כל טיפה. גם הצלחות וגם coverslips צריכים להיות מטופלים אחרת תרבות. </li></ol></li></ol> 2. רקמות הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבלת רקמת המוח <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הרדמה עמוקה החיה עם Euthasol, להסיר את המוח למקם אותו קר כקרח aCSF </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את ההמיספרות עם אזמל פרוסה coronally ב 500μm באמצעות מכשיר של בחירה, איסוף פרוסות לתוך צלחת קטנה ובה קר כקרח aCSF </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Explants ביצוע (שימוש במיקרוסקופ לנתח) <ol class="a" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את פרוסות המכיל את יואילו הוד מעלתם ganglionic (GE) ואזורים קיצוץ של קליפת המוח אשר עשויה תלתל על GE ו להפריע צעדים נוספים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על האריס Uni-Core נשא באזור קרוב לפני השטח חדרית של GE, לחזור בו גרעין המכילה בעיקר אזור חדרית, ולגרש את זה עם הבוכנה לתוך מדיום קר כקרח (תמונה 1). שלוש עד ארבע explants של 0.5 בקוטר מ"מ יכול להתבצע מן GE חד פרוסה P0 במוח החולדה. שים לב הן מכרסמים חמוסים, GES המדיאלי ו לרוחב הם התמזגו בגיל זה. אם הליבה נשארת פרוסה או תקוע לתחתית הפלסטיק של המנה, לגייס אותו באמצעות התזת aCSF עם קצה פיפטה ולהעביר עם טפטפת לתוך תבשיל המכיל בינוני Neurobasal קר. שמור את המנה על קרח רטוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת קבוצה של explants מן המדיום תוך ירידה גדולה של קר כקרח Matrigel (כ 0.25-0.5ml) להציב צלחת נפרדת, מקפיד להיות explants שקוע לחלוטין והימנעות בועות. שמור את המנה על קרח רטוב. גודל אצווה תלוי במהירות של זרימת הזרם. </li></ol></li></ol> 3. הגדרת התרבות (שימוש במיקרוסקופ לנתח) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור תמיד Matrigel ו Matrigel המכילים תערובות על הקרח, כדי למנוע ריפוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Remix ההשעיה מקום חרוז 1-2μl או פחות ההשעיה חרוז Matrigel קר כקרח במרכז coverslip כוס ממוקם בעבר צלחת תרבות היטב באמצעות קצה פיפטה 20μl. תן לזה קצת להגדיר, למנוע התייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת קצה 20μl פיפטה להרים 2 explants מירידה Matrigel ולמקם אותם באזור הרצוי של ההפקדה חרוז (לפחות 1 מ"מ מהקצה הפיקדון) באופן סימטרי משני צדי. תן לו לקבוע לא יותר 5min בטמפרטורת החדר. העיתוי הנכון של צעדים B ו-C הוא קריטי. אם הזמן קצר מדי זה יוביל gelling ורכיבים חלקית של הגדרת התרבות יעברו כאשר הם מכוסים שכבה הסופי של Matrigel, אם הזמן ארוך מדי זה עלול לגרום לייבוש יתר של הג'ל ויצירת מחסומים פיזיים הפגיעה תנועה חופשית של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את החרוזים ואת explant בשכבה שטוחה של כ 30μl של Matrigel, להאריך אותו מעבר explants (Fig.2). תן לו לקבוע בחממה כ -15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2ml של המדיום Neurobasal עם תוספי מזון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס CO 5% O 2 / 95 2% פעילות ניטור נודדות מדי יום. </li></ol> 4. חיים הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה של 3-4 ימים, עיין צלחות תרבות לבחור coverslips של עניין. Explants צריך ליצור ענן אחיד רדיאלית של תאים. החלף coverslips נבחר לתוך צלחת תרבות טריים אשר ישמשו בתחום ההדמיה לחיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו coverslips יושבים צלחת החדש במשך הלילה. לפני הצבת צלחת על המיקרוסקופ הדמיה, במנדף תרבית תאים, השתמש מרית סטרילי כדי להזיז את coverslip על מנת לשחרר את כל microbubbles שאוספות בין coverslip ואת צלחת תרבית תאים. התערבות של בועות יהרוס את התמונות. הזז את coverslips למרכז הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע אידוי, למלא את החלל בין בארות מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר בזהירות את הצלחת ממכסה המנוע התרבות התאים במיקרוסקופ לא להעביר את coverslips ממרכז הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת ערכת הדמיה באמצעות תוכנת הדמיה. בשל אופייה 3D של הגדרת התרבות התאים גם להזיז אנכית, ולכן חשוב לאסוף Z-המטוסים המקיף עומק מלא ענן ההגירה. היקף XY האזור צילמו צריך להיות גם קבוצה גדולה מספיק כדי לכסות אזורים צפוי להיות מאוכלס על ידי תאים נודדים במהלך ההקלטה, כדי להכיל את הפיקדון חרוז כדי להקליט אוריינטציה זוויתי של explant לבין תאים נודדים יחסית מקור החלבון. כמו כן רואים כי המטוסים צילמו יותר Z, או את האזור מכוסה יותר, יותר זמן זה לוקח להקליט מחזור בנקודת זמן מסוימת, מכריח מרווחי הזמן בין דגימות עוד הפסד של רזולוציה הזמני של מעקב התא. במקרה שלנו, באמצעות המטרה 10x, את ערכת אופטימלי היה הקלטה אריח 3x3 עבור כל אחד 10 Z-המטוסים מרווחים כל 20μm, במרווחים של 30 דקות. מצאנו 30 דקות במרווחים הארוך ביותר המאפשרת זיהוי חד משמעי של תאים בנקודות זמן רצופים, שהוא קריטי עבור מעקב אמין של תנועותיהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליזום לשגות הדמיה הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זמן הרצוי, להסיר את הצלחת לתקן התרבויות 4% פוספט שנאגרו paraformaldehyde. זה יכול לשמש לניתוח מורפולוגי נוסף immunocytochemical. </li></ol> 5. ניתוח של התנועה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרת סדרת זמן מוקלט של תמונות לפורמט הנוח ביותר לעיבוד נוסף, TIFF להיות אחד נייד ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב אחר תנועה של תאים בודדים לאורך זמן על ידי קואורדינטות XY הקלטה. ניתן לעשות זאת באמצעות תוכנה להורדה חופשית כמו ImageJ (NIH) עם מעקב ידני plug-in, או כל יישום מסחריים אחרים כגון ImagePro, Volicity או AutoQuant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש את הרצועות באמצעות Excel או in-house תוכנה שפותחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל תא מעקב לחשב פרמטרים קינטיים כגון המהירות הממוצעת, עקמומיות של נתיב, השתנות כיוונית לאורך זמן, מסתעפת, סטייה לכיוון מקור של חלבונים, חישובים וכו 'יכול להיעשות MS Excel גיליון אלקטרוני או כל שווה ערך. הניסיון שלנו מראה זאת כי זה הרבה יותר פרודוקטיביים לפתח בתוך הבית סקריפטים (באמצעות R, Matlab, Python, Perl או אחרות, בעיקר שפות קוד פתוח), מאחר שהם מאפשרים התאמה אישית גמישים יותר הכללת שיטות אנליטיות מתוחכמות יותר מאלה זמין התקנה בסיסית של Excel. </li></ol> 6. נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. תרשים של origi אנטומיn של explants. זהו ציור של פרוסת העטרה של מוח החולדה hemisected. עיגולים אפורים לציין את האזור שממנו explants נלקחו. <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. דיאגרמה של ההתקנה תרבות. הפיקדון חרוז הוא מקור חלבונים; explants ממוקמים משני צדי וכל האלמנטים מכוסים Matrigel. <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. מגרשים מסלולים מקבילים תא בצבע ידי הרביעים (חיצים לעבר נקודת הפיקדון חרוז). מסלולים התא בצד ימין הם נודדים כלפי חלק ד ', המופיע למשוך תאים, התאים בצד שמאל הן נודדות לעבר חלק, המופיע להדוף תאים נודדים. <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. א ') סדרה של תמונות שנבחרו timepoints מראה ענן גדל והולך של תאים נודדים מתוך explant. התא, למשל, מצוין על ידי חץ, היא מעקב באמצעות זמן כמפורט להלן (פס בהיקף 200μm). Explant זה היה דמיינו עם הדמיה לחיות 38 ח המוצג כאן הן תמונות של תאים עוזב את explant מתחילת ההקלטה תמונות התמונה הסופית. B) התא המצוין חלק בזמנים המצוין. תא מראה הסתעפות חוזרות (בר סולם 50μm).

<ol><li>Caviness, V. S. Jr, Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cortical+development%3A+a+view+from+mutations+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cortical development: a view from mutations in mice.</a> Annu. Rev. Neurosci. 1, 297-326 (1978).</li>
<li>Gelman, D. M., Martini, F. J., Nóbrega-Pereira, S., Pierani, A., Kessaris, N., Marín, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+preoptic+area+is+a+novel+source+of+cortical+GABAergic+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The embryonic preoptic area is a novel source of cortical GABAergic interneurons.</a> J. Neurosci. 29, 9380-9389 (2009).</li>
<li>Hasling, T. A., Gierdalski, M., Jablonska, B., Juliano, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+radialization+factor+in+normal+cortical+plate+restores+disorganized+radial+glia+and+disrupted+migration+in+a+model+of+cortical+dysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A radialization factor in normal cortical plate restores disorganized radial glia and disrupted migration in a model of cortical dysplasia.</a> Eur. J. Neurosci. 17, 467-780 (2003).</li>
<li>Hirschberg, A., Deng, S., Korostylev, A., Paldy, E., Costa, M. R., Worzfeld, T., Vodrazka, P., Wizenmann, A., Götz, M., Offermanns, S., Kuner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+deletion+mutants+reveal+a+role+for+semaphorin+receptors+of+the+plexin-B+family+in+mechanisms+underlying+corticogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene deletion mutants reveal a role for semaphorin receptors of the plexin-B family in mechanisms underlying corticogenesis.</a> Mol. Cell Biol. 30, 764-780 (2010).</li>
<li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riding+the+glial+monorail%3A+a+common+mechanism+for+glial-guided+neuronal+migration+in+different+regions+of+the+developing+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Riding the glial monorail: a common mechanism for glial-guided neuronal migration in different regions of the developing mammalian brain.</a> Trends Neurosci. 13, 179-184 (1990).</li>
<li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Central nervous system neuronal migration.</a> Annu. Rev. Neurosci. 22, 511-539 (1999).</li>
<li>Liodis, P., Denaxa, M., Grigoriou, M., Akufo-Addo, C., Yanagawa, Y., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lhx6+activity+is+required+for+the+normal+migration+and+specification+of+cortical+interneuron+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes.</a> J. Neurosci. 27, 3078-3089 (2007).</li>
<li>Métin, C., Alvarez, C., Moudoux, D., Vitalis, T., Pieau, C., Molnár, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+pattern+of+tangential+neuronal+migration+during+forebrain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Conserved pattern of tangential neuronal migration during forebrain development.</a> Development. 134, 2815-2827 (2007).</li>
<li>Martini, F. J., Valiente, M., López Bendito, G., Szabó, G., Moya, F., Valdeolmillos, M., Marín, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biased+selection+of+leading+process+branches+mediates+chemotaxis+during+tangential+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration.</a> Development. , 136-1341 (2009).</li>
<li>Nóbrega-Pereira, S., Kessaris, N., Du, T., Kimura, S., Anderson, S. A., Marín, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postmitotic+Nkx2-1+controls+the+migration+of+telencephalic+interneurons+by+direct+repression+of+guidance+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Postmitotic Nkx2-1 controls the migration of telencephalic interneurons by direct repression of guidance receptors.</a> Neuron. 59, 733-745 (2008).</li>
<li>Pearlman, A. L., Faust, P. L., Hatten, M. E., Brunstrom, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+directions+for+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">New directions for neuronal migration.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 8, 45-54 (1998).</li>
<li>Poluch, S., Jablonska, B., Juliano, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+interneuron+migration+in+a+ferret+model+of+cortical+dysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Alteration of interneuron migration in a ferret model of cortical dysplasia.</a> Cereb Cortex. 18, 78-92 (2008).</li>
<li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+neural+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">Principles of neural cell migration.</a> Experientia. 46, 882-891 (1990).</li>
<li>Riddle, D. R., Katz, L. C., Lo, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+delivery+of+neurotrophins+into+the+central+nervous+system+using+fluorescent+latex+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Focal delivery of neurotrophins into the central nervous system using fluorescent latex microspheres.</a> Biotechniques. 23, 928-937 (1997).</li>
<li>Wichterle, H., Alvarez-Dolado, M., Erskine, L., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permissive+corridor+and+diffusible+gradients+direct+medial+ganglionic+eminence+cell+migration+to+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Permissive corridor and diffusible gradients direct medial ganglionic eminence cell migration to the neocortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 727-732 (2003).</li>
<li>Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+cortical+interneuron+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Origins of cortical interneuron subtypes.</a> J. Neurosci. 24, 2612-2622 (2004).</li>
</ol>

שימוש בבעלי חיים: כל הנהלים הקשורים בבעלי חיים בוצעו בהתאם USUHS והנחיות NIH מוסדיים אושרה על ידי IACUC USUHS.

כאן אנו מציגים מערכת פשוטה ללמוד ולנתח את התנהגות הנדידה של תאים עצביים בתגובה לאותות כימיים. ב מבחני חוץ גופית הגירה שימשו כדי לזהות מולקולות תאיים המשפיעים על תנועה של תאים. הפרדיגמה שלנו מבטיחה כי כל תא יחיד למד יש 3 מימדי (3D) בסביבה שבה לתקשר. זהו יתרון משמעותי על פני תרבויות שבה תאים נודדים מתוך explants נאלצים לנוע על המשטח השטוח של coverslip poly-D-ליזין מצופה, נטול ובכך של אינטראקציות עם תאי המטריצה ​​(למשל הירשברג ואח&#39; &#39;10:. 8. Metin et al. &#39;07). עם זאת ביחס בקנה מידה גדול יותר של תאים נודדים מעקב, הוא נשאר 2 מימדי, כמו תאים מוגבלים במאונך לשטח שבין coverslip הזכוכית בתחתית ואת המשטח העליון של Matrigel, שהוא דק יחסית חופש האופקי ההגירה. התקנה כזו מאפשרת ניתוח קל של התנועה, אשר נותר בעיקרו 2 מימדי. פרדיגמות 3D דומים המורכב explants GE או מחדש אגרגטים של תאים GE מוטבע קולגן או Matrigel, היו מועסקים בעבר באמצעות אגרגטים של תאים לבטא חלבון איתות מסוים כמקור לאותות כימיים (למשל Liodis ואח&#39; &#39;07;. מרטיני et .. א &#39;09:. Nóbrega-Pereira et al &#39;08, &#39;03 Wichterle et al).. השיטה המוצגת כאן משתמשת במערכת שחרור איטי בצורה של חרוזים לטקס עם חלבונים דבק כדי לאפשר רמת מתמשכת בסביבה המקומית, שהוא גבוה יותר מאשר חלבונים הוסיף ישירות בינוני, מה שהופך את המערכת מתאימה במיוחד כאשר כמות זמין חלבון מוגבלת או כאשר תערובת מורכבת של חלבונים נבדק. הבחירה של חרוזים אינה מוגבלת לטקס מוצרים מבוססי, והוא כולל גם חומרים אחרים, למשל חרוזים agarose, כל אחד עם מאפיינים שונים. כדי להגביר עוד יותר את הצפיפות של assay, השתמשנו בשני explants apposed להפקיד החרוזים משני צדי המתרס. כדי להבטיח אזור מסוים המוצא, השתמשנו explants רוממות ganglionic כמקור של תאים. הערכנו הבדלים מנות המדיאלי ו לרוחב של מקורבו ganglionic, אבל לא רואה שום הבדלים. עלינו להדגיש כי מחקר זה משתמש חמוסים, במינים זה יואילו הוד מעלתם ganglionic המדיאלי ו לרוחב הפתיל מוקדם יותר מאשר אצל מכרסמים (Poluch ואח&#39; &#39;08.). באותו זמן התרבויות נוצרו (P0) יואילו הוד מעלתם ganglionic המדיאלי ו לרוחב היו התמזגו, למרות תאים רבים לאכלוס הניאוקורטקס עדיין נמצאים שנוצר נודדות. עם זאת, אם מקור אחיד של תאים באמת עדיף, השעיה תא יכול להיות מוכן מרקמת גזור מעורב ישירות עם Matrigel, או לחילופין הסתחרר למטה גלולה כתוצאה אגרוף לעשות &quot;explants&quot;. השימוש לעיכול רקמת האנזימטית להכין את ההשעיה התא הוא מיואש, אפילו עקבות של פעילות שיורית proteolytic יכול לנזל Matrigel במהלך הניסוי. כמו כן, בדיקת נאותות צריך להיות מיושם על העיתוי של הגדרת התרבות. למרות Matrigel דורש תקופה של התחממות אל לפלמר, אפילו תקופה ממושכת מעט החשיפה של טיפות קטנות של Matrigel (משמש בפרוטוקול זה) לאוויר גורמת ייבוש תוצאות פגז כי הוא בלתי חדיר לתאי נודדות אשר לא ניתן למחוק על ידי כיסוי הבאים עם Matrigel טריים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </td><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> בינוני Neurobasal (1X), נוזל </td><td> Invitrogen </td><td> 21103-049 </td><td></td></tr><tr><td> N-2 מוסף (100x), נוזל </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td></td></tr><tr><td> B-27 מוסף (50X) </td><td> Invitrogen </td><td> 0080085-SA </td><td></td></tr><tr><td> BD ממברנה Matrigel מרתף מטריקס </td><td> BD Biosciences </td><td> 354234 </td><td></td></tr><tr><td> האריס Uni-Core, גודל 0.5mm </td><td> מיקרוסקופית אלקטרונים למדעים </td><td> 69036-05 </td><td> פאנץ לשעמם </td></tr><tr><td> גרין Retrobeads IX </td><td> Lumafluor, Inc </td><td></td><td> לאטקס microspheres </td></tr></tbody></table>

התנהגות הנדידה של תאים שנוצר תרבויות רוממות ganglionic

Migratory Behavior of Cells Generated in Ganglionic Eminence Cultures

הגירה של תאים הוא תהליך משותף שמוביל לפיתוח ההבשלה של מערכת החולייתנים העצבים המרכזית (Hatten, 99). קליפת המוח מורכבת משני סוגי נוירונים בסיסיים: הגירוי ואת מעכבות. תאים אלה מתעוררות באזורים שונים ולנדוד לתוך קליפת בנתיבים שונים (פרלמן et al., 98). Interneurons מעכבות להעביר בעקיפין, ממקורות קורטיקליים, רובם מאזורים שונים של יואילו הוד מעלתם ganglionic (גלמן ואח&#39;, &#39;09;. שו ואח&#39;, &#39;04.). התנועה שלהם מחייב שליטה מדויקת spatiotemporal שהוטלו על ידי רמזים סביבתיים, כדי לאפשר הקמת cytoarchitecture קישוריות נאותה בקליפת המוח (Caviness &amp; Rakic, 78; Hatten, 90; Rakic, 90). כדי לחקור את התנהגות הנדידה של תאים שנוצר באזורי שגשוג של יואילו הוד מעלתם ganglionic (GE) ב חמוסים היילוד במבחנה השתמשנו הסדר 3 התרבות ממדי Matrigel BD מטריקס. הגדרת התרבות מורכבת משני explants GE ו מקור חלבונים נבדק מופק בקליפת המוח ואת adsorbed על פלורסנט Retrobeads לטקס התשיעי ממוקם בין explants (Hasling ואח&#39;, &#39;03;. Riddle et al, 97.). לאחר 2-3 ימים של תרבות, התאים מתחילים להופיע בקצה explant מראה נטייה לעזוב את רקמת בכיוון רדיאלי. הדמיה חיה מותר תצפית דפוסי הנדידה ללא צורך תיוג או סימון התאים. כאשר נחשף שברים של החלבון לחלץ המתקבל קליפת החמוס isochronic, התאים GE מוצג התנהגויות שונות כמו להישפט על ידי ניתוח כמותי הקינטית של תאים בודדים נעים.

זמן לשגות הדמיה של התרבות רקמת 3D מאפשר ללמוד התנהגות הנדידה של תאים בודדים שמקורם רוממות ganglionic בתגובה תמצית חלבון מופרדים מן קליפת המוח.

התנהגות הנדידה של תאים שנוצר תרבויות רוממות Ganglionic

נדידת תאים היא תהליך נפוץ המוביל להתפתחות ולהבשלות של מערכת העצבים המרכזית בחולייתנים (Hatten, '99). המוח...

בנוהל זה, מוקם תרבית in vitro כדי לבחון כיצד נדידת תאים מהבליטה הגנגליונית (ganglionic eminence) אל קליפת המוח מושפעת מfractions שונים של תמצית חלבון קורטיקלית. ראשית, מיקרוספירות לטקס מדגגות עם fractions בודדים כדי להכין מקורות של חלבונים השתחררים באיטיות. מוח של נסורת מבודל ונחתך בחתכים קורונליים לפרוסות עבות.דגימות רקמה (explants) נחתכות מתוך ה-ganglion eminences. תרביות תלת-ממדיות מוקמות כאשר המיקרו-ספירות והדגימות מוטמעות במטריצה חוץ-תאית. לאחר תקופת אינקובציה, מבוצע תיעוד תמונות ב-time-lapse תחת מיקרוסקופ שדה בהיר (brightfield microscope).היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שימוש בתא כימותקטי, הוא שניתן להביט בתנועות של תאים בודדים ולכמתן. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בתחומים של התפתחות מערכת העצבים, כגון כימותקטיקה ובקרה קינטית של תנועתיות.בדרך כלל, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו יתקשו בתחילה, שכן קשה לטפל ברקמות המושתלות (explants) הקטנות עם ה-matra gel. כדי להתחיל, הפשיתו בהדרגה את ה-matra gel הקפוא על קרח רטוב, כדי להבטיח שהטמפרטורה תישאר נמוכה מספיק למניעת התגבשות מוקדמת של המטריקס בזמן הפשרת ה-matri gel. בצעו סינון סטרילי ולאחר מכן הקפאה מהירה (slush freeze) של 500 milliliters של נוזל מוחי ביскусי או A CSF, על ידי הנחת בקבוק פלסטיק במקפיא של 80- מעלות.כאשר נוצרת שכבה דקה של קרח על הדפנות, שברו אותה על ידי ניעור של הבקבוק, ולאחר מכן אפשרו לשכבה נוספת להיווצר תוך כדי חזרה על הפעולה עד ליצירת סלרי (slurry) אחיד. לאחר מכן, הכינו מצע neuro basal בהתאם להוראות היצרן ועקרו אותו באמצעות סינון. השתמשו בממברנת סינון של 0.22 µm, דגרו בטמפרטורה של 37 °C עד למוכנות לשימוש, כדי לספוג את פראקציית החלבון אל תוך המיקרוספירות או החרוזיקים של לטקס פלואורסצנטי לצורך דיפוזיה אל תוך המטריג'ל; הוסיפו 10 µL של חרוזיקים לתוך מבחנות EPR המכילות בנפרד 100 עד 200 µL מכל אחת מחמש פראקציות חלבון שונות.דגרו בחושך למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר. לאחר דגירה של 30 דקות, השקיעו את הביטים באמצעות צנטריפוגה שולחנית במהירות מרבית למשך שעה אחת. לאחר הרדמה עמוקה של בעל החיים באמצעות uol, הוציאו בניתוח את המוח כולו ושקעו אותו ב-A CSF קר קרח שהוכן מראש.הפרידו לחלוטין את שתי ההמיספרות באמצעות סקלפל ובצעו חיתוכים קורונליים בעובי 500 micrometers. השתמשו בקוצץ רקמות (tissue chopper) או במכשיר דומה כדי לאסוף את הפרוסות לצלחית פטרי קטנה המכילה A CSF קר מאוד ומונחת על קרח רטוב. בעזרת מיקרוסקופ דיסקציה, זהו את הפרוסות המכילות את ה-ganglionic eminences (או ge), וגזרו אזורי קורטקס שעלולים להפריע לשלבים הבאים.החדירו מחסנית דגימה (bore) של Harris unicorn לאזור הסמוך לפני השטח הוונטריקולרי של ה-GE. שלפו גליל המכיל בעיקר את האזור הוונטריקולרי והוציאו אותו באמצעות בוכנה לתוך תמינת neurobasal medium קרה בקרח. העבירו קבוצה של שתלים מהתווך לתוך טיפה של 0.5 מיליליטר של mat gel קר בקרח, שהוצבה בצלחת נפרדת.יש להקפיד שהאקספלנט יהיה טבול לחלוטין ולהימנע מהיווצרות בועות. יש להשאיר את הצלחת על קרח רטוב בעבודה תחת מנדף לתרביות רקמה. הכינו את התרבית.סמנו פלטות בארות בדרגה שש על ידי הנחת שתי מיקרוליטרים של Matrigel קר במרכז כל בארה. השתמשו בטיפ פיפטה של 20 מיקרוליטר והניחו כיסוי זכוכית עגול שעבר אוטוקלאב בקוטר 18 מילימטר על כל טיפה. הסירו את העלייה ותלו את החרוזים מחדש ב-10 מיקרוליטרים של מצע Neurobasal באמצעות וורטקס או הוסיפו 30 מיקרוליטרים של Matrigel שהופשר בקרח לתמיחה.ערבב היטב והנח על קרח. בעזרת מיקרוסקופ dissection, העבר 1-2 µL מתלי התחליט של החרוצים באמצעות פיפט של 20 µL והמת חלוף דקה עד שתי דקות, תוך הקפדה שהדגימה לא תתייבש. אסוף שני x explan מטיפת ה-matrigel והנח אותם בסמיכות הרצויה להפקדת החרוצים.סמנו נקודות במרחק של 0.5 עד 1 מילימטר, באופן סימטרי ובצדדים מנוגדים. המתינו למשך לא יותר מחמש דקות בטמפרטורת החדר. כסו את החרוזים ב-X חצאי ביצים בשכבה שטוחה של כ-30 µL של matrigel והניחו באינקובטור לתרביות רקמה בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות; לאחר ההדגרה, הוסיפו 2 mL של מצע neurobasal, והחזירו לאינקובטור למשך שלושה עד ארבעה ימים.במעקב יומי אחר הפעילות הנדידת לאחר הדגירה, בחרו כיסויות עניין עם שתלים שיצרו ענן תאים אחיד רדיאלית. העבירו את הכיסויות שנבחרו לפלטת תרבית חדשה והדגירה למשך לילה. לפני הצילום, השתמשו בשפכדל סטרילי תחת מ पॉपुलर תרביות רקמה כדי להזיז את הכיסויות לצורך שחרור בועות מיקרוסקופיות שייתכן וכלואות תחתיהן.מלאו את הרווחים בין הבארות במים כדי למנוע התייבשות והעבירו בזהירות את הפלטה למיקרוסקופ. הגדירו תכנית דימות באמצעות תוכנת דימות. הקפידו להתחשב באופיו התלת-ממדי של התרבית על ידי איסוף סדרת מישורי z.לאחר קביעת הפרמטרים, התחילו את צילום ה-time-lapse. כאן מוצגת הקלטת time-lapse מייצגת של ganglion, כאשר eminence explan מייצרת תאים נודדים. התאים נודדים רדיאלית החוצה מהרקמה.מידת המשיכה שלהם למקור החלבון משתנה בהתאם לאופי המקור. בסרטון זה, בהגדלה גבוהה יותר, ניתן לעקוב בקלות אחר תאים נפרדים הנעים. כפי שמוסמן בחצי חצים, ניתן לראות תאים רבים המסתנפים.כמה מאלו מסומנים בחצים. מעקב אחר תאים בודדים מספק מידע מיקומי שניתן לניתוח מעמיק יותר. גרפים לדוגמה מראים תגובה דיפרנציאלית בין פראקציות A ו-D, כפי שמעידות מסלולים שונים של תאים העוזבים את ה-explan לאחר השליטה בטכניקה.ניתן לבצע טכניקה זו בארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לשמור את ג'ל המצע (mat gel) על קרח. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן ההכנה של מקור לשחרור איטי של חלבונים, הקמה של תרבית רקמה תלת-ממדית וביצוע דימוי במרווחי זמן (time lapse imaging) במטרה לתצפת ולנתח תנועות של תאים בודדים.

migratory-behavior-of-cells-generated-in-ganglionic-eminence-cultures

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בפרוטוקול זה אנו מדגימים כיצד לבנות תאים מותאמים אישית המאפשרים יישום של שדה חשמלי בזרם ישר כדי לאפשר הדמית זמן לשגות של המוח מבוגר נגזר טרנסלוקציה תא מבשר העצבית במהלך galvanotaxis.

Assay Galvanotaxis לניתוח של קינטיקס נדידת תאים העצביים המבשר בשדה חשמלי נוכחי לשימוש חיצוני ישיר

כאן אנו מתארים תא שוואן (SC) assay הגירה שבSCS מסוגל לפתח לאורך האקסונים של הארכה.

ניתוח התפתחות תאי שוואן Murine לאורך האקסונים של גידול

אנו מציגים vivo לשעבר assay נדידת תאים המאפשר כימות מדויק של פוטנציאל נדידת תאי רכס העצבי enteric בנוכחות של גורמי גדילה שונים.

Assay נדידת תאים כמותיות לMurine אבות עצביים enteric

מודלים תרבית תאים מספקים שליטה מפורטת על תנאים סביבתיים ובכך מספקים פלטפורמה רבת עוצמה על מנת להבהיר היבטים רבים של ביולוגיה של תא עצבי. אנו מתארים שיטה מהירה, זולה, ואמינה לבודד, לנתק, ותרבות תאי עצב תחושתי מעובר חומוס. פרטים של הכנת המצע וimmunocytochemistry גם מסופקים.

בידוד והתרבות של ניתק עצב סנסורי מאפרוח עוברים

אבות interneuron קליפת המוח GABAergic לפזר, לפתח וsynaptically להשתלב קליפת מארח לאחר השתלה. ניתן transduced תאים אלה בקלות לפני ההשתלה ללימודי in vivo של מבשרי GABAergic מהונדסים גנטי. כאן, אנו מציגים טכניקות תיוג נגיפיות למקד תת-קבוצות interneuron ספציפיות באמצעות קווי Cre קיימים וכתבי Cre-תלויים.

תאי תיוג ותיווך ויראלי השתלה של המדיאלי ganglionic רוממות (MGE) ל<em&gt; In vivo</em&gt; לימודים

מעבר אפיתל למזנכימלי (EMT) מאפשר לסרטן להפוך לפולשני. כדי לחקור EMT, מתואר מודל מבחנה מבוסס תאי גזע עצביים (NSC) נטול סרום ואנזימים. מערכת סטנדרטית זו מאפשרת הערכה כמותית ואיכותית של נדידת תאים, ביטוי גנים וחלבונים. המודל מתאים לגילוי תרופות.

Enzyme- ואת הסרום ללא דגם תרבית תאי גזע עצבי לחקירות EMT המתאימים גילוי תרופות

כאן אנו מציגים מערכת התרבות הvivo לשעבר מעורב מעורבת לחקר התא glioma האדם (hGC) הגירה בזמן אמת. מודל זה מספק את היכולת להתבונן באינטראקציות בין השמאל לבין האקטונים המייאלואידית והלא-מיאלואידית בתוך תא מחולק.

ניטור בזמן אמת של הגירה של תא האדם Glioma על גבי גנגליון שורש-אוליגודנדרוציטים שיתוף תרבויות

אנו מציגים שלושה פשוטים מחוץ לגוף הרחב, שיטת ההגירה למרחקים ארוכים, שיטת ההגירה של תרבות השיתוף, והטיפול בטיפול בכימותרפיה-הערכת באופן קולקטיבי את התפקודים של תאי גזע אנושיים שמקורם בתאים אנדותקיים וה אינטראקציה עם האינטרנוירונים הבינכולינרגיות.

הגירה, כימותרפיה-אטרקציה, ושיתוף התרבות Assays בשביל הגזע האנושי תאים הנגזרת האנדותל והנוירונים

גנגוליה (CG) היא חלק ממערכת העצבים הפאראסימפתטית. תרבויות נוירואליות של אפרוח CG הנוירונים הוכחו להיות מודלים תא יעיל במחקר של אינטראקציות שרירים עצביים. אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור הניתוח, דיסוציאציה ותרבות מבחנה של CG נוירונים מ עוברי האפרוח.

בידוד ותרבות של צ'יק סילייון גנגליון נוירונים

כאן, אנו מציגים מבחני תרבות משותפת קלים לשימוש כדי לנתח נדידת גליובלסטומה (GBM) על נוירונים בדוגמת. פיתחנו מאקרו בתוכנת FiJi לכימות קל של נדידת תאי GBM על נוירונים, והבחנו כי נוירונים לשנות קיבולת פולשנית של תא GBM.

תרבות משותפת של תאים דמויי גזע גליובלסטומה על נוירונים בדוגמת ללמוד הגירה ואינטראקציות הסלולר

פרוטוקול רב-תכליתי זה מתאר את הבידוד של תאי פסגה עצבית קדם-מיגרטיבית (NCCs) באמצעות כריתה של קפלים עצביים גולגולתיים מעוברי אפרוחים. עם הציפוי והדגירה, NCCs נודדים מגיחים מתוך קצוות עצביים, מה שמאפשר הערכה של מורפולוגיה של תאים ונדידה בסביבה דו-ממדית פשוטה.

הכנה וניתוח מורפולוגי של תרביות תאי צמרת עצביים גולגולתיים של אפרוחים

למדו לחקור התנהגות נדידה של תאים מבליטת הגנגליון בתרביות תלת-ממדיות באמצעות צילום time-lapse. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר תנועות תאים בודדים בתגובה לחלבונים מקליפת המוח.

התנהגות הנדידה של תאים שנוצר תרבויות רוממות Ganglionic

גלה סרטונים נוספים