Name: Cytometry זרימה טיהור תאים עכבר meiotic (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-15T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: למד שיטה לטיהור תאים מיוטיים מבלוטת האשך בעכבר באמצעות FACS וצביעת DNA פלואורסצנטית. השיטה מאפשרת ניתוח פרופילים גנטיים וציטוגנטיים בתאי מיוזה בבידוד גבוה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרויקט זה מומן בחלקו על ידי כספי ממדינת פלורידה סקריפס ומספרי הפרס R01GM085079 ו R21HD061304 מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית לבין המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם, בהתאמה. זהו כתב היד מספר 20917 של מכון המחקר סקריפס.

פרוטוקול זה ניתן להפריד בין שני שלבים עיקריים: (1) ניתוק ו Hoechst 33342 מכתים של תאים עכבר testis ואחריו, במידת הצורך, (2) FACS מיון של שברים meiotic הרלוונטיים, כולל כל שלבי המיוזה, מתאי נבט אל בסיבוב spermatids. לאחר שנאספו, אוכלוסיות אלה meiotic מועשר יכול לשמש עבור מגוון רחב של ניתוח. פרוטוקול זה מתאר את ניתוק של אחד testis מבוגר; כרכים ניתן להתאים בהתאם לנערים או האשכים נוספים. 1. Testis דיסוציאציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום אחד testis decapsulated בצינור 15 מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מ"ל של הפתרון של גיי מאזן מלח (GBSS) המכיל 120 U / ml של collagenase מסוג I. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של DNAse אני (פתרון 1mg/ml המניות גליצרול 50%) ולנער אותו נמרצות ביד עד שתראה tubules האשכים מתחילים לנתק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתסיס אופקית מקסימלית של 120 סל"ד במשך 15 דקות על 33 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג דקות 1 אנכית בטמפרטורת החדר וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.2-1.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2.5 מ"ל של GBSS המכיל סוג collagenase אני, 50 μl של פתרון טריפסין 50mg/ml מניות resuspended בתמיסת HCl 1 מ"מ, ו 10 μl של DNAse אני (1mg/ml), וכן להפוך את הצינור מספר פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתסיס אופקית מקסימלית של 120 סל"ד במשך 15 דקות על 33 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש pipet פלסטיק חד פעמיות פסטר עם פתח רחב, פיפטה בעדינות מעלה ומטה במשך 3 גושים min.No צריך להיות גלוי בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 30 μl של טריפסין, 10 μl של DNAse אני, 40 μl של Hoechst 33342 resuspended ב DMSO (10 מ"ג / מ"ל), וגם להפוך את הצינור מספר פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתסיס אופקית מקסימלית של 120 סל"ד במשך 15 דקות על 33 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 400 μl של עוברי עגלים בסרום (FCS) ומערבבים על ידי היפוך להשבית טריפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים הסופי מתבצע על ידי הוספת 50 μl של Hoechst 33342 resuspended ב DMSO (10 מ"ג / מ"ל), וכן 10 μl של DNAse אני (1 מ"ג / מ"ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתסיס אופקית מקסימלית של 120 סל"ד במשך 15 דקות על 33 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המדגם testis ניתק לאחר מכן עבר דרך שני GBSS 40 מיקרומטר מראש הרטובות מסננים חד פעמיות על שפופרת 50 מ"ל חרוטי, ולאחר מכן 5 μl של יודיד propidium (PI) פתרון נוסף מדגם מעורבת pipetting בעדינות על ידי מספר פעמים עם פסטר הפנויה פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדוגמה מועבר מזרק 5 מ"ל פלסטיק באמצעות מחט 18-מד. האחרון הוא הוחלף על ידי מחט 22-מד למסירה המדגם. מזרק מאוחסן על קרח מוגן מפני האור עד מוכן לעיבוד FACS. </li></ol> 2. FACS התקנה טיהור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיון בוצעה על סדרן בקטון דיקינסון, תא IIu Aria. התנאים המתוארים ולכן צריך לשמש כנקודת מוצא במיוחד בעת השימוש במכשירים חשמליים שונים. השתמשנו בתנאים שתוארו קודם לכן 7,8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאז IIu Aria אין לייזר UV, התאמנו את פרוטוקול לאיתור מכתים Hoescht באמצעות לייזר סגול 405nm בנוסף השתמשנו לייזר כחול 488nm לגילוי פיזור קדימה בצד. יתר על כן, מסננים כמה שונו על מנת להגביל כמה leakiness לייזר אדום וכתוצאה מכך חדות משופרת העלילה מפוזרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייזר סגול הוגדר לעבור עם להקת 450/40nm לגילוי Hoescht כחול הפליטה לעבור הלהקה 585/42nm עבור פליטת האדום Hoescht. עובר זמן רב 502nm שימש נפרד כחול פלואורסצנטי אדום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרבובית 100 מיקרומטר היה בשימוש עם תדר טיפה הכונן של 28,000 טיפות / שנייה. שיעור סף המדגם היה כ 4000 אירועים / שנייה. אפשרות בקרת טמפרטורה שימש כדי לשמור על מדגם וצינורות לאיסוף 4 ° C משך כל מיון. בנוסף, תכונת תסיסה מדגם שימש בסל"ד 200 כדי למנוע את הדוגמה sedimenting ברחבי כזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדרך כלל, 2-3 האשכים עובדו לכל סוג 6 שעות המאפשר את איסוף 0.5-2.0x10 6 תאים לכל אוכלוסיית (ראה סעיף נציג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המדגם מיון aliquots של כ 750μl להימכר המזרק. בינתיים, במהלך הפסקות אלה הצינורות אוסף הוחזקו על 4 ° C, מוגן מפני האור, מעורב בעדינות לפני מעין חידוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדגימות נאספו מיון לתוך צינור איסוף 12x75mm borosilicated זכוכית המכיל 250μl DMEM FCS בתוספת 10%. </li></ol> 3. נציג תוצאות: פרופיל טיפוסי FACS מוצג באיור 1. כל השלבים העיקריים של המיוזה מזוהים מצוינים במקרא. אם Hoechst 33342 הכתם אינו אופטימלי, פרופיל העולמית יופיעו הרבה יותר קומפקטי פחות מוגדר. בעיה נפוצה לגבי הוספת DNAse לא מספיק, אשר יניעו clumping תאים מהירה. תוספת נוספת DNAse בכל הצעדים נגדו כתב אישום בדרך כלל פותר בעיה זו. הקפאת הawing של המניות DNAse (המאוחסן ב -20 ° C) צריכה להיות מינימלית, כמו זו גורמת לאובדן מהיר של פעילות האנזים. Spo11 הוא endonuclease meiotic שמנתב פעמיים גדיל הפסקות באתרים של נקודות חמות רקומבינציה meiotic 12. איור 2 מציג פרופיל אופייני של Spo11-null testis שבו גדיל כפול לשבור לא נוצרים, וכתוצאה מכך המיוזה הנפל 12, כמו גם טרום puberous פרופיל של עכבר 13 ימים הישן, אשר חושף הטבע אסינכרוני של הגל הראשון של המיוזה. תקן מנתח cytogenetic באמצעות שילוב של חלבון מורכב synaptonemal 3 (SCP3) ו phosphorylated נוגדנים H2AX היסטון הבמה הסמנים הספציפיים המיוזה יש להשתמש תחילה אישר את הטוהר ואת אופיו של התאים meiotic מיון, כמתואר elswhere 11. <img src="/files/ftp_upload/2602/2602fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. Wild-type FACS פרופילים המיוזה. א) פיזור העלילה נציג מוצג. התאים מגודרת מוצגים. שים לב כמות גדולה של פסולת נוכח testis מבוגר המכילים בעיקר ממברנות ריקים זנבות spermatid. ב) עלילה נציג לצרכן מראה את כמות מוגבלת מאוד של תאים לצרכן חיובי בהווה במדגם. שער טיפוסי מוצג. ג) נציג wild-type Hoechst 33342 פרופיל FACS מוצג. האוכלוסיות השונות תא meiotic שניתן מטוהרים בשיטה זו למחקר נוסף מצוינים: spermatogonia (SP), טרום leptotene (PL), leptotene-zygotene (L / Z), מוקדם Pachytene (EP), הבינוני Pachytene ( MP), בשלהי Pachytene (LP), diplotene (ד '), סביב spermatids (RS). <img src="/files/ftp_upload/2602/2602fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. Spo11-null ו wild-type 13 יום פרופילים FACS meiotic. א) פרופיל טיפוסי Spo11-null מוצג עם כישלון meiotic ברור, שם לא בשלב בעבר leptotene / zygotene מוקדם pachytene ניתן לאתרם. ב) פרופיל של עכבר wild-type 13 יום בן זכר מראה את ריכוז גבוה של תאים leptotene / zygotene. זהו הגל הראשון של המיוזה היא סינכרונית למדי, בבהירות דמיינו שימוש במתודולוגיה זו.

<ol><li>Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+composition+of+fractions+of+mouse+testis+cells+following+velocity+sedimentation+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation.</a> Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).</li>
<li>Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugal+elutriation%3A+separation+of+spermatogenic+cells+on+the+basis+of+sedimentation+velocity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity.</a> J. Cell. Physiol. 86, 177-189 (1975).</li>
<li>Purification, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((culture%2C+and+fractionation+of+spermatogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">culture, and fractionation of spermatogenic cells.</a> Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).</li>
<li>Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcett, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+sedimentation+velocity.+A+morphological+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization.</a> Dev. Biol. 49, 119-131 (1976).</li>
<li>Meistrich, M. L., Trostle, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+mouse+testis+cells+by+equilibrium+density+centrifugation+in+renografin+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Separation of mouse testis cells by equilibrium density centrifugation in renografin gradients.</a> Exp. Cell Res. 92, 231-244 (1975).</li>
<li>Namekawa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postmeiotic+sex+chromatin+in+the+male+germline+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice.</a> Curr. Biol. 16, 660-667 (2006).</li>
<li>Lassalle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+Population%27+cells+in+adult+mouse+testis+express+Bcrp1+gene+and+are+enriched+in+spermatogonia+and+germinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Side Population' cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells.</a> Development. 131, 479-487 (2004).</li>
<li>Bastos, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry A. 65, 40-49 (2005).</li>
<li>Chowdhury, R., Bois, P. R., Feingold, E., Sherman, S. L., Cheung, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+variation+in+human+meiotic+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of variation in human meiotic recombination.</a> PLoS Genet. 5, e1000648-e1000648 (2009).</li>
<li>Roig, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+TRIP13%2FPCH2+is+required+for+recombination+and+normal+higher-order+chromosome+structure+during+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Mouse TRIP13/PCH2 is required for recombination and normal higher-order chromosome structure during meiosis.</a> PLoS Genet. 6, (2010).</li>
<li>Getun, I. V., Wu, Z. K., Khalil, A. M., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+occupancy+landscape+and+dynamics+at+mouse+recombination+hotspots%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Nucleosome occupancy landscape and dynamics at mouse recombination hotspots.</a> EMBO Rep. 11, 555-560 (2010).</li>
<li>Romanienko, P. J., Camerini-Otero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+Spo11+gene+is+required+for+meiotic+chromosome+synapsis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The mouse Spo11 gene is required for meiotic chromosome synapsis.</a> Mol. Cell. 6, 975-987 (2000).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

פרוטוקול המוצג לעיל מאפשר בו זמנית לטהר מעכברים זכר בוגר את כל טווח של תאים בשלב meiotic עם הטוהר גבוהה מאוד, ומאפשר לחוקרים ללמוד את הדינמיקה של התהליך הבסיסי הזה. תאים מטוהרים יכול לשמש עבור יישומים רבים, החל 9,10 מיצוי RNA, מיפוי הנוקלאוזום 11, גילוי מולקולה רקומביננטי, מנתח חלבון, ועוד רבים. עם זאת, שיטות זיהוי צריך להיות מותאם לכמות התאים meiotic מטוהרים. יתר על כן, עם שחזור הגבוהה של שיטה זו, ניתן מיני בריכה מרובים עצמאית של שבר אותו ביצע בימים שונים כד...

<table><tbody><tr><td>Collagenase Type-1</td><td>Worthington Biochemical</td><td>CLSS1</td><td>המס עד לריכוז 12,000U/ml ב-GBSS, אחסון ב-4&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Worthington Biochemical</td><td>TRL3</td><td>המס ב-1mM HCl עד לריכוז 50mg/ml, אחסון ב-4&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342</td><td>Acros Organics</td><td>230001000</td><td>תמיסה רוויה (10mg/ml ב-DMSO, אחסון ב-4&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DNEP</td><td>המס במים/50% glycerol עד לריכוז 1mg/ml, אחסון ב-20-&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Gey&amp;rsquo;s Balance Salt Solution </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9779</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה להעברה בגודל 6&quot;</td><td>Fisher Scientific</td><td>137119D</td><td></td></tr></tbody></table>

cytometry זרימה טיהור תאים עכבר meiotic

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

אופי הטרוגני של סוגי תאים ב testis ואת היעדרם של מודלים תרבות meiotic תא היו מכשולים משמעותיים כדי ללמוד את התוכניות התמיינות ייחודית כי הם לידי ביטוי במהלך המיוזה. שתי השיטות העיקריות פותחו כדי לטהר, בדרגות שונות, שברים meiotic שונים למבוגרים והן בבעלי חיים מפותחים: elutriation או Staput (שקיעה) באמצעות BSA ו / או percoll הדרגתיים. שתי שיטות אלה מסתמכים על גודל התא וצפיפות להפריד תאים meiotic 1-5. בסך הכל, למעט אוכלוסיות תאים ספורים 6, פרוטוקולים אלה אינם מצליחים להניב טוהר מספקת של אוכלוסיות רבות תא meiotic הדרושים ניתוחים מולקולריים מפורט. יתר על כן, עם שיטות כאלה בדרך כלל סוג אחד של תאים meiotic יכול להיות מטוהרים בזמן נתון, אשר מוסיפה רמה נוספת של מורכבות לגבי שחזור והומוגניות כאשר משווים דגימות תאים meiotic. כאן אנו מתארים שיטה מעודן המאפשר אחד כדי לחזות בקלות, לזהות ולטהר תאים meiotic, החל בתאי הנבט כדי spermatids עגול, באמצעות FACS בשילוב עם מכתים 33342 Hoechst 7,8. שיטה זו מספקת תמונה כוללת של תהליך meiotic כולו מאפשר מאוד לטהר את התאים קיימא משלב ביותר של המיוזה. תאים אלה מטוהרים אז יכול להיות ניתח בפירוט את השינויים המולקולריים שמלווים התקדמות דרך המיוזה, שינויים בביטוי הגנים למשל 9,10 ואת הדינמיקה של תפוסה הנוקלאוזום על נקודות חמות של רקומבינציה meiotic 11.

שיטה יעילה להשגת מטוהרים שברים meiotic קיימא מהעכבר testis מתואר, המשלבת תא מעודן דיסוציאציה פרוטוקול עם מיון פלורסנט התא הפעיל (FACS). שיטה זו מנצלת את ההבדלים בתוכן דנ&quot;א צפיפות גרעינית של שברים meiotic בדידים.

Cytometry זרימה טיהור תאים עכבר meiotic

הטבע ההטרוגני של סוגי התאים באשכים והיעדרה של מודלים לתרבית תאים מייוטיים היוו מכשולים משמעותיים למחקר של ה...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לטהר בבת אחת ובדרגת טהרה גבוהה מגוון רחב של תאים מיטוטיים מאשכים של עכברים בוגרים, וזאת כדי לחקור את התהליכים הדינמיים המתרחשים במהלך מחזור תא ייחודי זה. מטרה זו מושגת על ידי דיסוציאציה יעילה של תאי האשכים באמצעות סדרה של עיכולים אנזימטיים עם collagenase ו-trypsin בנוכחות dna, כדי להשיג תרחיף תאים בודדים מהאשכים כשלב שני.את התוךית הנבדקת צובעים בצבע ה-DNA הפלואורסצנטי לתאים חיים Hulk's 3 33 42, המאפשר להבחין בין סוגים שונים של תאים מיאוטיים בהתבסס על תכולת ה-DNA וצפיפותו. לאחר מכן, התאים המיאוטיים מנותחים באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS) במטרה לזהות ולטהר את כל הפרקציות הדרושות לניתוחים נוספים, כגון ניתוח ציטוגנטי או ניתוח ביטוי גנים. התוצאות המתקבלות מראות טיהור יעיל של אוכלוסיות תאים מיאוטיים שקשה להשיג ברמת טוהר גבוהה, בהסתמך על מחקרי מערך ביטוי וציטוגנטיקה מקיפים.היתרון המרכזי של פרוטוקול זה, המבוסס על עובדות, על פני שיטות קיימות כגון סדימנטציה בצנטריפוגה, ליטרציה או שקיעה בכבידה, הוא שהוא מאפשר לאסוף מספר רב של פראקציות מיטוטית ברמת טוהר גבוהה מאוד. אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יצטרכו לשלב מערכות מיומנויות שונות מאוד כדי לבצע דיסוציאציה יעילה של הרקמה והעמדה, ולאחריהן מיון תאים אופטימלי; הדבר דורש אינטראקציות טובות בין האדם המכין את התאים לבין מפעיל ה-flow cytometry, וכן הבנה טובה של יסודות הפרוטוקול החיוניים להצלחתו. את פרוטוקול דיסוציאציית התאים תדגים ד"ר I Gatun, פוסט-דוקטורנטית בכירה במעבדתנו ששיפרה את הפרוטוקול באופן ניכר.BVN Tores. מפעיל הציטומטריית הזרימה שלנו יעביר אתכם הגדרות אופטימליות למיון תאים יעיל. בפרוטוקול זה יודגם פירוק של שתי אשכים מעכברי בוגרים, אך ניתן להתאים את הנפחים בהתאם עבור עכברים צעירים או עבור אשכים נוספים.להתחלה, העבירו 3 mL של תמיסת מלח מאוזנת (GBSS) המכילה 120 units/mL של collagenase type one אל המבחנה. דיסוציאציה יעילה ומלאה היא קריטית לצביעה נכונה ולמיון תאים תקין. הוספה של כמות מספקת של collagenase type one והצבת המבחנה במצב אופקי במהלך הערבוב הן פעולות חיוניות לדיסוציאציה יעילה של הרקמה. העבירו אשכול אשכים אחד למבחנה של 15 mL.הוסף 10 µL של DNase I לאשכים ונער את המבחנה בעוצמה ביד עד שניתן לראות את תחילת הדיסוציאציה של השפופרות האשכיים. לאחר מכן, הנח והדק את המבחנה במצב אופקי על שייקר מסתובב וערבב את המבחנה במהירות מקסימלית של 120 RPM למשך 15 דקות בטמפרטורה של 33 °C. לאחר 15 דקות, בצע דקנטציה במשך דקה אחת במצב אנכי בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השתמש בפיפטה חד-פעמית כדי להסיר את הנוזל העליון (supernatant). הוסף לדגימה 3 mL של תמיסת מלח מאוזנת (balanced salt solution) המכילה collagenase type I וכן 10 µL של DNase I.שוב, נערו את המבחנה מספר פעמים ביד. ערבבו את המבחנה באופן אופקי במהירות מקסימלית של 120 RPM למשך 15 דקות בטמפרטורה של 33 °C כפי שבוצע קודם לכן, שפכו בזהירות למשך דקה אחת באופן אנכי בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן השליכו את הנוזל העליון. כעת, הוסיפו 2.5 milliliters של GBSS המכיל collagenase.הוסיפו 50 µL של trypsin ו-10 µL של dase. הפכו את המבחנה מספר פעמים, ערבבו אופקית במהירות מקסימלית של 120 RPM למשך 15 דקות בטמפרטורה של 33 °C. לאחר 15 דקות של ערבוב, השתמשו בפיפטת פלסטיק חד-פעמית עם פיה רחבה כדי לבצע פיפטינג עדין של הדגימה למעלה ולמטה במשך שלוש דקות.בשלב זה לא אמורים להיראות גושים. לאחר מכן, יש להוסיף 30 µL של trypsin, 10 µL של DNAs one ו-40 µL של Hulks 3 33 42 המומסים מחדש ב-DMSO. הפוך את המבחנה מספר פעמים.יש לערבב באופק במהירות מקסימלית של 120 RPM למשך 15 דקות בטמפרטורה של 33 degrees Celsius. עם סיום ערבוב הדגימה, יש להוסיף 400 microliters של fetal calf serum ולערבב על ידי היפוך המבחנה כדי לנטרל את ה-trypsin. לצורך הצביעה הסופית, יש להוסיף 50 microliters של hoax 3 33 42 ו-10 microliters של DNAs.שוב, ערבבו את המבחנה באופן אופקי במהירות מקסימלית של 120 RPM למשך 15 דקות בטמפרטורה של 33 °C. העבירו את דגימת האשכים המפוצלת דרך שני מסננים חד-פעמיים של 40 micron שהורטבו מראש ב-GBSS אל תוך מבחנה קונית של 50 milliliter. הוסיפו חמישה µL של תמיסת propidium iodide לדגימה וערבבו בעדינות באמצעות פיפוט מספר פעמים עם פיפט פסטור חד-פעמי.בשלב הבא, העבירו את הדגימה למזרק פלסטי של 5 mL באמצעות מחט בכיול 18g. לאחר מכן, החליפו את המחט בכיול 18g במחט בכיול 22g לצורך הזרקת הדגימה. לבסוף, אחסנו את המזרק על קרח והגנו עליו מאור עד שהדגימה תהיה מוכנה לעיבוד ב-fax.עבור ניסוי זה, מיון תאים מבוצע באזור Backin Dixon. שנית, תנאי מיון התאים הותאמו לאלו ששימשו בעבר עבור ציטומטר זרימה המצויד בלייזר ארגון ultraviolet ב-360 nanometer ובלייזר ארגון ב-488 nanometer. בסופו של דבר, הגדרות ציטומטר הזרימה ידרשו אופטימיזציה על ידי מפעיל מיון התאים.מאחר ובמכשיר ה-Becton Dixon Aria two U אין לייזר UV, הפרוטוקול לגילוי צביעת HoEchst הותאם לשימוש בלייזר סגול באורך גל של 405 nanometer. HoEchst עורר על ידי הלייזר הסגול של 405 nanometer, ולייזר כחול של 488 nanometer משמש הן לעירור PI והן לגילוי פיזור קדימה (forward scatter) ופיזור צידי (side scatter). בנוסף, הפילטרים לגילוי HoEchst שונו כדי להגביל זליגות של לייזר אדום, מה שמוביל לחדות משופרת של תרשימי הפיזור.הלייזר הסגול מוגדר עם פילטר Band pass של 450 40 ננומטר לזיהוי פליטה כחולה של hoaxed ופילטר Band pass של 585 42 ננומטר לפליטה אדומה של hoaxed. פילטר Long pass של 502 ננומטר משמש להפרדה בין פלואורסצנציה כחולה לאדומה. ההבדל בשימוש בשתי סדרות פילטרים שונות מוצג כאן.מסנן ה-5 85 42 nanometer מניב אוכלוסיות תאים דחוסות יותר מאשר מסנן ה-6 30 30 nanometer. לפיכך, על המפעיל להיות מוכן לנסות שילובים שונים במכשיר שלו על מנת להשיג את הפשרה הטובה ביותר. נעשה שימוש בנחיר של 100 micron עם תדר זרימת טיפות של 28, 000 טיפות לשנייה.קצב סף הדגימה הוא כ-4,000 אירועים לשנייה עם קצב זרימה שבין אחת לשלוש כדי לשמור על רזולוציה גבוהה יותר. מיין את הדגימה באליקוטות של כ-750 microliters המופקות מהמזרק. במהלך הפסקות אלו, שמור את שארית הדגימה במזרק על קרח ומוגן מאור. אסוף את הדגימות הממוינות למבחנות איסוף זכוכית מסוג borisy במידות 12 על 75 millimeter המכילות 250 microliters DMEM מועשר ב-10%FCS.כדי לשמור על הדגימה במבחנות האיסוף בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, השתמשו באפשרות בקרת הטמפרטורה לאורך כל משך המיון. בנוסף, השתמשו בתכונת ערבוב הדגימה ב-200 RPM כדי למנוע שקיעה של הדגימה במהלך המיון. בכל פעם שמוסיפים אליקוט מהדגימה הראשית, חשוב להקיש על מבחנות האיסוף כדי לשמור על שלמות התאים שנאספו.פרופילים מייצגים של נתוני זרימה מוצגים כאן, כאשר כל השלבים העיקריים של המיוזה בסוג הפרא מזוהים בתרשים פיזור זה שבו מסומנים התאים שנבחרו (gated cells); קיימת כמות גדולה של פסולת המכילה בעיקר ממברנות ריקות וזנבות של תאי זרע באשכים של הפרטים הבוגרים. תרשים מייצג של Propidium iodide מראה כמות מוגבלת מאוד של תאים חיוביים ל-propidium iodide בדגימה. השער (gate) הטיפוסי מסומן בפרופיל מייצג זה של wild type hoax 3 33 42 fax.אוכלוסיות התאים המיוטיות השונות שניתן לטהר באמצעות שיטה זו לצורך מחקר נוסף הן ספרמטוגוניה, פרה-לפטין, لپטין, זיגוטים, פאכיטן, דיפלוטן וספרמטוקיטים עגולים. שני פרופילי השלבים האחרונים הם מאשכים של עכברים בני 13 ימים מסוג SPO 11 N ומסוג פראי (wild type). SPO 11 הוא האנדונוקלאז המיוטי המכוון שברים של גדיל כפול לאתרים של נקודות חמות של רקומינציה מיוטית, וכפי שנצפה כאן, היעדרו של SPO 11 מוביל לכישלון מיוטי ברור מכיוון שלא ניתן לזהות שלב המאוחר יותר מהלפטין, הזיגוט או הפאכיטן המוקדם.לעומת זאת, הפרופיל של עכבר זכר מסוג wild type בן 13 ימים מראה ריכוז גבוה של תאי zygote המכילים leptin. גל ראשון זה של מיוזה הוא אסינכרוני למדי, כפי שניתן לראות בבירור. בעת ביצוע ניסוי זה באמצעות מתודולוגיה זו, חשוב להשתמש בכמות מספקת של DNAs.המרכז של העיר למיון נטול תקלות. למרות שחוקרים נרתעים בתחילה משימוש בו, הוספת DNA תפחית את צמיגות הדגימה ותשפר את הפרדת התאים והצביעה, ובנוסף תאים שלמים לא ייפגעו. ניתן להשתמש בשיטת FOX להשגת תאים אוטומטיים במגוון רחב של יישומים המשכיים, כגון, למשל, מיצוי D-N-A-R-N-A לבחינת דינמיקת ביטוי גנים, או עבור טכניקת שיקוע חיסוני של כרומטין (chromatin immunoprecipitation) כדי לבסס פרופילים אפיגנטיים שונים.

flow-cytometry-purification-of-mouse-meiotic-cells

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

טיהור הזרימה Cytometry מבוסס<em&gt; ס cerevisiae</em&gt; זיגוטות

פרוטוקול חדש להכנה מכאנית של השעיות אשכים סלולריים מחומר מכרסם, הימנעות אנזימים וחומרי ניקוי, מתואר. השיטה היא מאוד פשוטה, מהירה, לשחזור, והופכת השעיות תא באיכות טובות, אשר מתאימות למיון זרימה ומיצוי RNA.

טכניקה פשוטה ויעילה להכנת השעיות תא אשכים

אנו מתארים אסטרטגיית מיון עבור זרעונים של עכברים באמצעות זרימה ציטומטרית. הזרעונים ממוינים לארבע אוכלוסיות טהורות ביותר, כולל עגולות (שלבי זרע 1-9), התארכות מוקדמת (שלבי זרע 10-12), התארכות מאוחרת (שלבי זרע 13-14) וזרעונים מוארכים (שלבי זרע 15-16). צביעת DNA, גודל וגרגיריות משמשים כפרמטרים לבחירה.

שלב מסוים מיון של Spermatids העכבר על ידי cytometry הזרימה

אנו מדווחים פרוטוקול באמצעות תא קרינת מיון מופעל לבודד תאי דנדריטים plasmacytoid (PDC) עם טוהר גבוה ממח העצם של עכברי זאבת נוטה ללימודי תפקודיים של PDC.

מיון תא מופעל קרינה עבור טיהור של תאי דנדריטים Plasmacytoid ממח עצם העכבר

עבודה זו מתארת ​​את סטנדרטיזציה של שיטה להשיג אוכלוסיות תאים נבט מטופלים מרקמת האשכים של מינים שונים של יונקים. זהו פרוטוקול פשוט המשלב דיסוציאציה פשוטה מכנית, מכתים עם Hoechst-33342 ו propidium iodide, ו FACS מיון, עם יישומים רחב במחקרים השוואתיים של ביולוגיה הרבייה הגברית.

גישה סטנדרטית עבור multispecies טיהור תאים יונקים זכר יונקים על ידי דיסוציאציה רקמות מכנית זרימת cytometry

מאמר זה מדגים שיטה חזקה לכמת המיטוכונדריה או lysosomes בתאים חיים. השילוב של צבעי ספציפיים ליזוזום או המיטוכונדריה עם נוגדנים fluorescently מצומדת סמני פני השטח מאפשר כימות של אלה organelles אוכלוסיות מעורבות לתאים, כמו ראשי תאים שנקטפו דגימות רקמה, באמצעות cytometry זרימה ססגוניות.

כימות מבוססי Cytometry זרימה ססגוניות של המיטוכונדריה, Lysosomes בתאי T

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור העשרת החומר העשיר pachytene, עגול spermatocytes, ו להאריך spermatocytes מתוך האשכים עכבר למבוגרים באמצעות סרום מתמשך פרה אלבומין הדרגתי עם מעבדה סטנדרטית ציוד.

העשרה של פכיטנא ספרציטים וספרטידים מאשכים עכבר באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטית

כאן אנו מציגים שיטה פשוטה ויעילה לבודד תאי חיידקים מיוטיים ופוסט-מיוטיים חיים מערכי עכבר בוגרים. באמצעות ציטוקסיות נמוכה, צבע מחייב DNA סגול-נרגש ומיון תאים המופעלים על-ידי פלואורסצנה, ניתן לבודד אוכלוסיות תאי זרע מועשרים מאוד עבור יישומים רבים במורד הזרם.

בידוד של תאי זרע מורין באמצעות צבע מחייב DNA סגול-נרגש תא חרוש

שיטה זו מתארת את הטיהור על ידי ציטומטריית זרימה של MEP ו- MKP מעצמות הירך של העכברים, השוקה ועצמות האגן.

בידוד אבות מקרוציטים עכבר

כאן אנו מתארים שיטה ציטומטרית חדשנית לזרימה לבידוד פרוספקטיבי של אריתרואיד יחידה יוצרת התפרצות מוקדמת (BFU-e) ואריתרואיד יחידה יוצרת מושבה (CFU-e) ישירות ממח עצם וטחול טריים של עכבר. פרוטוקול זה, שפותח על סמך נתוני תעתיק חד-תאיים, הוא הראשון לבודד את כל אבות האריתרואידים של הרקמה בטוהר גבוה.

זיהוי ובידוד של יחידה יוצרת פרץ ויחידה יוצרת מושבה אבות אריתרואידים מרקמת עכבר על ידי ציטומטריה של זרימה

כדי להשיג פריציטים קורטיקליים במוח העכבר העומדים בדרישות scRNA-seq, אנו מציגים פרוטוקול FACS מותאם באופן קריטי המבוסס על בחירת CD13⁺/CD31⁻. השיפורים המרכזיים שלנו משפרים משמעותית את חיוניות התא ואת שלמות ה-RNA, ומאפשרים פרופיל טרנסקריפטומי אמין.

בידוד פריציטים מרקמת קורטיקת העכבר באמצעות FACS לצורך ריצוף תא יחיד

למד שיטה לטיהור תאים מיוטיים מבלוטת האשך בעכבר באמצעות FACS וצביעת DNA פלואורסצנטית. השיטה מאפשרת ניתוח פרופילים גנטיים וציטוגנטיים בתאי מיוזה בבידוד גבוה.

Cytometry זרימה טיהור תאים עכבר meiotic

גלה סרטונים נוספים