איתור של מפעיל איתות, מתחמי Downstream של BMP4 שימוש באתרו PLA, Assay קשירת הסמיכות
March 3rd, 2011
כאן אנו מראים כיצד להשתמש קשירת הסמיכות Assay (PLA), עם שילוב של נוגדנים לדמיין המוךפו"גנטי שהולך עצם חלבון (BMP) איתות תאים קבוע. טכניקה זו אפשרה לנו לעקוב אחר הצטברות הגרעין של BMP אנדוגני מופעל מפעיל, מתחמי ולכמת רמות שלהם לאורך זמן תחת גירוי BMP4.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לדמיין ולכמת איתות BMP בתאי תרבית רקמה. BMPs נקשרים לקולטנים במשטח התא ו-PHOSPHOLATE שלושה, אפקטורים smad, smad one, smad five ו-SMAD שמונה. אלה יוצרים קומפלקסים עם smad four ועוברים לגרעין שם הם מתזמרים את השעתוק.
כאן אנו משתמשים ב-PLA כדי לדמיין קומפלקסים הנוצרים בין אפקטורים אנדוגניים של SMA ו-smad four בתאי תרבית רקמה עם או בלי גירוי BMP. זה מתחיל בשימוש מקביל בשני נוגדנים ראשוניים, אחד מהם מזהה את כל שלושת האפקטורים הזרחניים, SMMA, והשני מזהה ארבעה נוגדנים משניים הנקראים בדיקות PLA שלכל אחד מהם מחובר גדיל DNA קצר ייחודי, הנקשרים לנוגדנים הראשוניים שבהם בדיקות ה-PLA נמצאות בסמיכות. גדילי ה-DNA מתקשרים באמצעות הוספה עוקבת של שני מעגלים היוצרים אוליגונוקלאוטידים של DNA.
אלה מחוברים יחד על ידי קשירה אנזימטית ויוצרים מעגל שמוגבר באמצעות שכפול מעגל מתגלגל לאחר תגובת ההגברה. הכלאה של בדיקות אוליגונוקלאוטידים משלימות מסומנות מדגישה את כתמי הפלואורסצנט של המוצר הקשורים להגברה של כל מחזור. תוצרי DNA נראים בקלות.
כאשר מסתכלים עליהם במיקרוסקופ פלואורסצנטי, הכתמים תואמים קומפלקסים בין אפקטור, seds ו-smad four, המסמלים איתות BMP פעיל בתא. היתרונות העיקריים של PLA על פני השיטות הקיימות הם שהוא קל לשימוש, רגיש מאוד וללא רקע, וניתן להשתמש בו כדי לכמת איתות BMP פעיל באתרו. מסלול ה-BMP חיוני להתפתחות של מספר איברים ורקמות ולתהליכים הכוללים התפשטות והתמיינות של תאי גזע.
ניתן להשתמש ב-PLA כדי לענות על שאלות מפתח הנוגעות לדינמיקת איתות BMP, רמות ולוקליזציה תת-תאית, אך ניתן להשתמש בו גם לאבחון. מכיוון שמסלול זה עומד בבסיס מספר מחלות, ניתן להשתמש ב-BLA כדי לחקור רכיבי העברת אותות אחרים של BMP או מסלולים אחרים וניתן להתאים אותו לעבודה על קטעי רקמה או עוברים שלמים. כדי להתחיל את בדיקת קשירת הקרבה באתר, הכינו את תרביות התאים, תאי נוירו-שני A מתורבתים ב-GMEM בתוספת 10% FBS, פעם אחת חומצות אמינו לא חיוניות, פעם אחת פירובט ופעם אחת L גלוטמין.
פצלו את התאים באמצעות טריפסין וצלחת 15,000 עד 20,000 תאים לבאר. במגלשה של 16 בארות דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור פחמן דו חמצני לח של 5% למשך 24 שעות. אחרי 24 שעות.
החליפו את מצע התרבית בתוסף GMEM ללא סרום ודגרו במשך שעתיים-שלוש נוספות לבקרה. שמור שלוש בארות עם תאים בתרבית ובתנאים רגילים לאחר הדגירה השנייה. לעכב את מסלול ה-BMP על ידי טיפול בתאים עם שני מורפיום דורסה מיקרו-מולרית או לגרום לאיתות על ידי טיפול בתאים ב-BMP ארבע למשך 10 עד 60 דקות.
לאחר גירוי התאים, שאפו את המדיום מהבארות ושטפו בעדינות את התאים עם PBS כדי למנוע ניתוק תאים. אין לזרוק את ה-PBS ישירות על התאים. לאחר מכן שאפו את ה- PBS והסירו את התאים, אך השאירו את הסיליקון סביב הבארות.
מוסיפים לבארות 50 מיקרוליטר של פורמלדהיד טרי מוכן ומסונן 4%para פורמלדהיד ודוגרים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ללא תסיסה. לאחר הקיבוע יש לשטוף את התאים עם PBS למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה בצנצנת קופין. חזור על הכביסה פעמיים בסך הכל שלוש כביסות.
לאחר מכן, חדיר את התאים עם 0.5% טריטון X 100 ב- PBS בצנצנת קופין ודגר אותם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ללא תסיסה. לאחר מכן שטפו את התאים עם 0.05% tween 20 ו- TB S3 פעמים למשך חמש דקות לכל שטיפה עם תסיסה בצנצנת צימוד. התחל את הליך החסימה על ידי הקשה על השקופית כדי להסיר את תמיסת הכביסה הסופית.
הקפדה לא לאפשר לתאים להתייבש. הוסף טיפה אחת של קישור DUO לפתרון חסימה לכל אחד. ובכן דגרו את התאים בתמיסה חוסמת למשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס בתא לח שחומם מראש המורכב מקופסת קצה פיפטה ריקה עם מים מזוקקים.
כדי להכין את תמיסות הנוגדנים העיקריות יש לדלל אנטי פוספו סמד 1 5 8 ואנטי SMAD 4 אחד עד 100 בצמד שני מדללי נוגדנים. השתמש בכל נוגדן בנפרד ובשילוב. כעת הקש על השקופית כדי להסיר את תמיסת החסימה מהמגלשה ולהוסיף 40 מיקרוליטר של תמיסות הנוגדנים לבארות המתאימות וניתן לכלול בקרה שלילית עם מדלל בלבד.
בצע שלב זה במהירות כדי שהתאים לא יתייבשו. כעת דגרו את המגלשות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתא לח שחומם מראש למשך שעה. במהלך הדגירה, יש לדלל את שתי בדיקות ה-PLA בדילול.
עבור כל תגובה מערבבים שמונה מיקרוליטר מכל בדיקה ו -24 מיקרוליטר מדלל כך שהבדיקות מדוללות אחד עד חמישה בתמיסה. לאחר הדגירה של שעה, הקש על תמיסת הנוגדנים העיקרית ושטוף את השקופיות פעמיים עם קישור Duo ל-Wash Buffer a למשך חמש דקות כל אחת בטמפרטורת החדר עם תסיסה בצנצנת צימוד. בסיום השטיפות, הקש על מאגר הכביסה הנותר A מהמגלשות והוסף 40 מיקרוליטר מתמיסת בדיקת PLA לכל אחד.
ובכן, עכשיו דגרו את המגלשות ב-37 מעלות צלזיוס בתא לח שחומם מראש. במשך שעה, הצמד מקשר למלאי קשירה ומכין נפח לתערובת הקשירה. על ידי מערבולת ראשונה קישור הצמד למלאי קשירה ודילול שלו לפעמים אחת במים בטוהר גבוה.
קחו בחשבון שאנזים ליגאז מתווסף אחד ל -40 בתמיסה זו ויש צורך ב -40 מיקרוליטר מהתערובת לכל באר. לאחר הדגירה, הקש על תמיסת בדיקת ה-PLA מהמגלשות ושטוף אותן פעמיים עם Wash Buffer. A למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה בצנצנת צימוד במהלך הכביסה האחרונה, קח Duo link Ligase outs בבלוק קפוא ולאחר מכן הוסף אותו לתמיסת הקשירה לדילול סופי של אחד עד 40 ומערבולת.
כעת הקש על הנפח הסופי של Wash Buffer A מהשקפים והוסף 40 מיקרוליטר של הקשירה. מערבבים עם אנזים לכל אחד תוך כדי l. דגרו את השקופיות בתא לחות שחומם מראש למשך 30 דקות.
ב-37 מעלות צלזיוס הפשירו את מלאי ההגברה של DUO Link והתכוננו לשלב ההגברה במהלך הדגירה על ידי דילול מלאי ההגברה של DUO Link במים בטוהר גבוה לפעמים אחת הרחק את הריאגנטים מאור מכיוון שהם רגישים לאור. לאחר השלמת שלב הקשירה, הקש על התמיסה ושטוף את השקופיות פעמיים עם Wash Buffer A למשך שתי דקות כל אחת בטמפרטורת החדר עם תסיסה בצנצנת צימוד במהלך הכביסה האחרונה הוסף פולימראז קישור duo לתמיסת ההגברה לדילול סופי של 1 2 80 ומערבולת. לאחר הקשה על מאגר הכביסה, הוסיפו 40 מיקרוליטר מההגברה המעורבת לכל באר ודגרו את השקופיות בתא לחות חשוך שחומם מראש למשך 100 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס.
לאחר השלמת הדגירה של ההגברה, הקש על תמיסת הפולימראז מהמגלשות ושטוף אותם במאגר כביסה B פעמיים למשך 10 דקות לכל שטיפה עם צמחייה בצנצנת צימוד, הרחיקו את המגלשות מחוץ לאור במהלך שלב זה מכיוון שהריאגנטים רגישים לאור. עקוב אחר שתי הכביסות עם טבילה פנימה 0.1 פעמים מאגר כביסה B.כעת הסר לחלוטין את הסיליקון מה-16. ובכן, החלק אז בערך 40 מיקרוליטר מהצמד.
קשר למדיום הרכבה עם דאפי להחלקת כיסוי והנח אותו בעדינות מעל הדגימות, לחץ עליו מעט כך שלא יהיו בועות אוויר מתחת להחלקת הכיסוי, קבע ואטום את החלקת הכיסוי על המגלשה באמצעות לק, אפשר לפחות 15 דקות לפני ההדמיה. אלו הן תמונות קונפוקליות של תאים שטופלו בשני מורפין דורסה מיקרומולרי, מעכב של מסלול ה-BMP או טופלו ב-25 ננוגרם למיליליטר. BMP ארבע למשך 60 דקות.
נוגדנים נגד פוספו סמד 1 58 וסמד 4 שימשו לאיתור קומפלקסים פעילים של סמד ונתפסים כנקודות אדומות. גרעין התא החזיק בכחול על ידי dpi. אותות ה-PLA נספרו באמצעות תוכנת כלי התמונה DUO link והמספר הממוצע של כתמים בגרעין לתא מוצג בגרף.
לא נראה צביעה כאשר משתמשים באחד מהנוגדנים הראשוניים לבד, מה שמצביע על כך שאין ממצא רקע של בדיקות ה-PLA וקשירה לאחר מכן של האוליגונוקלאוטידים. כמו כן, לא מתגלים כתמים בבקרה שלילית אחרת הפולטת את שני הנוגדנים הראשוניים. בתאי נוירו-שניים A דף SDS ספיגה חיסונית מגלה SMAD 1 5 8 הקשור לפוספו בתאים לא מטופלים ומטופלים ב-BMP.
עם זאת, רמות הפוספו סמד מופחתות באופן ניכר בתאים שטופלו במורפיום גבי. הנוגדן נגד PCNA מספק בקרת טעינה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע את השלבים ואת ההגדרה שאנו מציעים כדי להשיג תוצאות תוך פחות משש שעות לאחר קיבוע התאים.
לסיכום, השלבים הם חסימת דגירה ראשונית של נוגדנים, דגירה של בדיקת PLA, הגברת קשירה, הרכבת הדמיה.
סקירה
מחקר זה מדגים את השימוש ב-Proximity Ligation Assay (PLA) כדי להמחיש את האיתות של Bone Morphogenetic Protein (BMP) בתאים קבועים. הטכניקה מאפשרת כימות של מתחמי אפקטורים מופעלים של BMP לאורך זמן תחת גירוי BMP4.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- נוירולוגיה
- ביולוגיה של התא
- העברת אותות
רקע
- BMPs חיוניים להתפתחות איברים ורקמות.
- הם מווסתים תהליכים כמו התרבות והתמיינות של תאי גזע.
- הבנת הדינמיקה של האיתות של BMP חיונית לטיפול במחלות קשורות.
- PLA מציעה שיטה רגישה לחקר מסלולי איתות אלה.
מטרת המחקר
- להמחיש את האיתות של BMP בתרביות תאים.
- לכמת את היווצרות מתחמי האפקטורים בתגובה לגירוי BMP.
- להעריך את היתרונות של PLA על פני שיטות מסורתיות.
שיטות ששימשו
- תרבית תאים של תאי Neuro 2A בתנאים ספציפיים.
- שימוש בנוגדנים ראשוניים לזיהוי אפקטורים SMAD מפוספטים ו-SMAD4.
- יישום של בדיקי PLA לקישור קרבה.
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית להמחשת מתחמים שנוצרו במהלך האיתות של BMP.
תוצאות עיקריות
- המחשה מוצלחת של מתחמי האיתות של BMP בתאים.
- כימות רמות האיתות הפעיל של BMP לאורך זמן.
- הוכחת הרגישות והקלות השימוש של PLA.
- יישומים פוטנציאליים לאבחון מחלות הקשורות לאיתות BMP.
מסקנות
- PLA היא שיטה יעילה לחקר דינמיקת האיתות של BMP.
- ניתן להתאים את הטכניקה לתנאים ניסיוניים שונים.
- התובנות שהושגו יכולות לתרום להבנת מחלות הקשורות ל-BMP.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Detection of endogenous BMP signaling effector complexes using in situ PLA provides a sensitive, quantitative readout of pathway activation in fixed cells. This enables mechanistic de-risking of BMP-targeted therapeutic hypotheses by distinguishing between phosphorylation and functional complex formation. The assay supports target validation and assay development in early discovery by delivering spatially resolved, background-free quantification of signal transduction events.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of BMP signaling hypothesis by measuring endogenous phospho-Smad1/5/8–Smad4 complex formation as a functional readout of pathway activation.
- Operational Value: Provides high-sensitivity, low-background quantification of effector complexes, reducing false positives from phosphorylation-only detection methods.
- Predictive Value: Supports target confidence by distinguishing between Smad phosphorylation and nuclear translocation into transcriptionally active complexes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates discrete, countable fluorescent spots amenable to automated imaging and quantitative analysis for hit confirmation in screening campaigns.
- Reproducibility: Delivers standardized, amplification-based signal output that minimizes variability across operators and experimental runs.
- Scalability: Compatible with multi-well formats and adaptable to high-content imaging platforms for longitudinal pathway modulation studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Links BMP signaling dynamics to pathophysiological processes in development, stem cell regulation, and tissue homeostasis relevant to degenerative and oncological indications.
- Translational Continuity: Enables comparison of pathway activity across in vitro models and primary tissues, supporting biomarker alignment in preclinical validation.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed Smad phosphorylation translates into functional effector complex formation, reducing attrition due to incomplete pathway engagement.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing a quantitative, spatially resolved readout of BMP signal transduction competence.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring the formation of endogenous Smad effector complexes as a direct readout of BMP4-induced signaling.
- Screening: Enables assay readiness through standardized, amplification-dependent spot formation that allows compound-induced pathway modulation to be quantified with high sensitivity.
- Analytics: Delivers quantitative nuclear spot counts per cell that facilitate comparison of signaling dynamics across time points, doses, and genetic or pharmacological perturbations.
- Translational Research: Connects in vitro BMP signaling measurements to pathophysiological relevance through subcellular localization and complex-specific detection, supporting biomarker-aligned preclinical models.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable proximity detection platform adaptable to other signaling pathways (e.g., TGF-β, Wnt) via antibody pair substitution, maximizing reagent and workflow investment.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in BMP target validation by resolving active signaling complexes from inert phosphorylation events.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization through enzymatic amplification and defined oligonucleotide ligation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by reducing mechanistic ambiguity in early-stage BMP pathway modulation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of BMP-modulating compounds based on functional complex formation rather than surrogate phosphorylation markers.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence, antibody validation, and fluorescence microscopy for spot detection and quantification.
- Dependent on access to Duolink PLA kit components, including PLA probes, ligation, and amplification enzymes, and a fluorescence microscope with appropriate filter sets.
- Necessitates standardization of fixation, permeabilization, and blocking conditions across laboratories to ensure consistent probe accessibility and signal-to-noise ratios.
- Adaptation to primary tissues or whole embryos requires optimization of permeabilization and antibody penetration while preserving subcellular localization of signaling complexes.
- Practical limitations include dependency on high-quality, validated antibody pairs and potential steric hindrance in densely packed subcellular compartments affecting probe proximity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
2:56
Plating of Cells and Treatment with BMP
4:12
Fixation and Permeabilization
10:56
In Situ Proximity Ligation Assay Results from Neuro2a Cells Treated with BMP4
6:49
The Proximity Ligation Assay (PLA)
5:26
Blocking and Primary Antibodies Application
9:54
Preparation for Imaging
12:18
Conclusion
