איתור של מפעיל איתות, מתחמי Downstream של BMP4 שימוש באתרו PLA, Assay קשירת הסמיכות
3 במרץ 2011
כאן אנו מראים כיצד להשתמש קשירת הסמיכות Assay (PLA), עם שילוב של נוגדנים לדמיין המוךפו"גנטי שהולך עצם חלבון (BMP) איתות תאים קבוע. טכניקה זו אפשרה לנו לעקוב אחר הצטברות הגרעין של BMP אנדוגני מופעל מפעיל, מתחמי ולכמת רמות שלהם לאורך זמן תחת גירוי BMP4.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להדגים ולכמת את השליח (signaling) של BMP בתאי תרבית רקמה. BMPs נקשרים לקולטנים על פני השטח של התא ומבצעים פוספורילציה לשלושה אפקטורי smad: smad one, smad five ו-SMAD eight. אלו יוצרים קומפלקסים עם smad four ונעברים לגרעין התא, שם הם מנהלים את התעתוק.
כאן אנו משתמשים ב-PLA כדי להדמיאן קומפלקסים הנוצרים בין אפקטורי SMA אנדוגניים לבין smad four בתרביות תאים, עם או בלי גירוי BMP. התהליך מתחיל בשימוש מקבילי בשני נוגדי ראשון, שאחד מהם מזהה את כל שלושת אפקטורי smma המפוספורים, והשני מזהה את smad four. נוגדים משניים הנקראים מתמטי PLA, שכל אחד מהם מצומד לגדיל DNA קצר וייחודי, נקשרים לנוגדי הראשון; כאשר מתמטי ה-PLA נמצאים בקרבה רבה זה לזה, גדילי ה-DNA מגיבים באמצעות הוספה עוקבת של שני אוליגונוקלאוטידי DNA יוצרי מעגל.
אלה מחוברים יחדיו באמצעות ליגציה אנזימטית ויוצרים מעגל שעובר הגברה באמצעות שכפול מעגלי מתגלגל (rolling circle replication) לאחר תגובת ההגברה. היברידיזציה של גששים (probes) אוליגונוקלאוטידיים משלימים מסומנים מדגישה את נקודות הפלואורסצנציה של התוצר הקשור להגברה של כל תוצר DNA מעגלי. תוצרי ה-DNA נראים בקלות.
בבחינה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה, הנקודות תואמות לקומפלקסים שבין effector, seds ו-smad four, המעידים על איתות BMP פעיל בתא. היתרונות העיקריים של PLA על פני שיטות קיימות הם קלות השימוש, רגישות גבוהה והיעדר רקע, וניתן להשתמש בו לכימות איתות BMP פעיל in situ. נתיב ה-BMP חיוני להתפתחותם של איברים ורקמות שונים ולתהליכים הכוללים פרוליפרציה ודיפרנציאציה של תאי גזע.
ניתן להשתמש ב-PLA כדי לבחון שאלות מפתח הנוגעות לדינמיקה, לרמות ולמיקום התת-תאי של סיגנליזציית BMP, אך ניתן להשתמש בו גם לצורכי אבחון. מכיוון שמסלול זה עומד בבסיסן של מספר מחלות, ניתן להשתמש ב-BLA כדי לחקור רכיבי העברת אותות אחרים של BMP או של מסלולים אחרים, וניתן להתאימו לעבודה על חתכי רקמה או על עוברים שלמים. כדי להתחיל את בדיקת ה-proximity ligation assay in situ, הכינו את תרביות התאים: תאי Neuro two A גודלים ב-GMEM מועשר ב-10% FBS, פי 1 חומצות אמינו לא חיוניות, פי 1 פירובט ופי 1 L glutamine.
פצל את התאים באמצעות trypsin והעבר לכל באער 15,000 עד 20,000 תאים. בתוך שקופית עם 16 תאים (chamber slide), דגור את התאים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius בתוך אינקובטור לח עם 5%carbon dioxide למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות.
החליפו את מצע התרבית ב-GMEM ללא סרום מועשר והדגירו למשך שעתיים עד שלוש שעות נוספות עבור הביקורות. השאירו שלוש בארות עם תאים בתרבית ובתנאים רגילים לאחר ההדגרה השנייה. עכבו את מסלול ה-BMP על ידי טיפול בתאים ב-2 µM dorsamorphine או גרו את האותות על ידי טיפול בתאים ב-BMP 4 למשך 10 עד 60 דקות.
לאחר גירוי התאים, שאבו את המצע מהבארות ושטפו בעדינות את התאים ב-PBS כדי למנוע התנתקות של תאים. אין להעביר את ה-PBS בפיפט ישירות על התאים. לאחר מכן, שאבו את ה-PBS והסירו את התאים (chambers), אך השאירו את הסיליקון מסביב לבארות.
הוסיפו 50 µL של 4% paraformaldehyde מסונן ושהוכן טרי לבארות, והדגירו למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ללא ערבוב. לאחר הקיבוע, שטפו את התאים עם PBS למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב בתוך Copin jar. חזרו על השטיפה פעמיים, לסך הכל שלושה שטיפות.
בשלב הבא, בצעו פרמיאביליזציה לתאים באמצעות 0.5% Triton X 100 ב-PBS בתוך צנצנת צביעה (copin jar), והדגירו אותם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ללא ערבוב. לאחר מכן, שטפו את התאים עם 0.05% Tween 20 ו-TBS שלוש פעמים, למשך חמש דקות לכל שטיפה, עם ערבוב בצנצנת צביעה. התחילו את הליך החסימה (blocking) על ידי טפיחה על הפסית להסרת תמיסת השטיפה האחרונה.
יש להקפיד שהתאים לא יתייבשו. יש להוסיף טיפה אחת של DUO link לתמיסת החסימה בכל באר. דגרו את התאים בתמיסת החסימה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius בתוך תא לחות שחומם מראש, העשוי מקופסת טיפים ריקה עם מים מזוקקים.
להכנת תמיסות הנוגדנים הראשוניים, יש לדלל את ה-anti phospho smad 1 5 8 ואת ה-anti SMAD four one ביחס של 1:100 ב-duo link two antibody diluent. השתמש בכל נוגדן לבדו ובשילוב ביניהם. כעת, הקישו על השקף כדי להסיר ממנו את תמיסת החסימה והוסיפו 40 µL מתמיסות הנוגדנים לבארים המתאימות; ניתן לכלול ביקורת שלילית עם diluent בלבד.
בצע שלב זה במהירות כדי למנוע מהתאים להתייבש. כעת, דגרו את השקופיות בטמפרטורה של 37 °C בתא לחות שחומם מראש למשך שעה אחת. במהלך הדגירה, דללו את שני גששי ה-PLA בדילואנט.
עבור כל תערובת תגובה, ערבבו 8 µL מכל גשושית ו-24 µL של מדלול, כך שהגשושיות מדללות ביחס של 1:5 בתוך התמיסה. לאחר אינקובציה של שעה אחת, התירו את תמיסת הנוגדן הראשוני ושטפו את השקופיות פעמיים עם Duo link to Wash Buffer a למשך חמש דקות בכל פעם בטמפרטורת החדר, תוך써 ערבוב בתוך כלי צימוד. עם סיום השטיפות, התירו את שאריות Wash Buffer A מהשקופיות והוסיפו 40 µL של תמיסת גשושית PLA לכל אחת.
כעת דגרו את השקופיות בטמפרטורה של 37 °C בתא לחות שחומם מראש. במשך שעה אחת, הכינו את תמיסת המלאח (ligation mix) מתוך מלאי ה-duo link ligation stock. ראשית, ערבבו את ה-duo link ligation stock במכשיר וורטקס ודללו אותו לריכוז של 1x במים בטוהר גבוה.
יש לקחת בחשבון כי אנזים ה-Ligase מתווסף בדילול של 1:40 לתמיסה זו, וכי נדרשים 40 µL מהתערובת לכל באר. לאחר האינקובציה, יש להסיר את תמיסת ה-PLA probe מהשקופיות ולשטוף אותן פעמיים עם Wash Buffer. למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב בתוך צנצנת צימוד (coupling jar) במהלך השטיפה האחרונה, הוצא את ה-Duo link Ligase לבלוק הקפאה ולאחר מכן הוסף אותו לתמיססת הליגציה עד לדילול סופי של 1:40 ובצע Vortex.
כעת יש להסיר את נפח השאריות של Wash Buffer A מהשקופיות ולהוסיף 40 µL מתערובת הליגציה. ערבבו עם האנזים בכל פעם בנפרד. דגרו את השקופיות בתא לחות שחומם מראש למשך 30 דקות.
הפשיר את מלאי ההגברה של DUO link בטמפרטורה של 37 °C והכן את שלב ההגברה במהלך הדגירה על ידי דילול של מלאי ההגברה של DUO Link במים בדרגת טוהר גבוהה לדילול של 1x. שמור על הרכיבים הרחק מאור מכיוון שהם רגישים לאור. עם סיום שלב הליגציה, הרף את התמיסה ושטוף את השקופיות פעמיים עם Wash Buffer A למשך שתי דקות כל פעם בטמפרטורת החדר תוך כדי ערבוב בכלי שטיפה. במהלך השטיפה האחרונה, הוסף duo link polymerase לתמיססת ההגברה לדילול סופי של 1:280 וערבב במערבל Vortex. לאחר הרפף של בופר השטיפה, הוסף 40 µL מתערובת ההגברה לכל באר והדגר את השקופיות בתא לחות חשוך שחומם מראש למשך 100 דקות בטמפרטורה של 37 °C.
בסיום דגירת ההגברה, שפכו את תמיסת הפולימראז מהשקופיות ושטפו אותן בבuffer Wash B פעמיים למשך 10 דקות לכל שטיפה, כאשר השקופיות במצב אנכי בתוך צנצנת צימוד; השתדלו להרחיק את השקופיות מהאור במהלך שלב זה כיוון שהריאגנטים רגישים לאור. לאחר שני השטיפות, טבלו את השקופיות ב-0.1 פעמים Wash buffer B. כעת הסירו לחלוטין את הסיליקון מהשקופית בעלת 16 הבארות, ולאחר מכן הוסיפו כ-40 µL מה-duo.
הוסף מדיום קיבוע עם dappy לזכוכית כיסוי והנח אותה בעדינות מעל הדגימות, תוך לחיצה קלה כדי למנוע היווצרות בועות אוויר תחת זכוכית הכיסוי; קבע ואטום את זכוכית הכיסוי על גבי הפסית באמצעות לכה לציפורניים, והמתן לפחות 15 דקות לפני הדימוג. אלו הן תמונות קונפוקאליות של תאים שטופלו ב-2 µM dorsa morphine, מעכב של מסלול ה-BMP, או טופלו ב-25 ng/mL BMP four למשך 60 דקות.
נוגדנים נגד Phospho Smad 1 58 ו-Smad four שימשו לזיהוי קומפלקסי smad הפעילים ונראים כנקודות אדומות. גרעיני התאים נצבעו בכחול באמצעות dpi. אותי ה-PLA נספרו באמצעות תוכנת DUO link image tool, והמספר הממוצע של נקודות בגרעין לכל תא מוצג בגרף.
לא נצפתה צביעה כאשר כל אחד מהנוגדנים הראשוניים שימש לבדו, מה שמעיד על היעדר רקע של גששי ה-PLA וליגציה עוקבת של האוליגונוקלאוטידים. באופן דומה, לא זוהו נקודות בבקרה שלילית נוספת ללא שני הנוגדנים הראשוניים. ב-SDS page immuno blotting של תאי neuro two A נחשפו phospho related SMAD 1 5 8 בתאים לא מטופלים ובתאים שטופלו ב-BMP.
עם זאת, רמות ה-phospho smad פחתו באופן ניכר בתאים שטופלו ב-dorsal morphine. הנוגדן נגד PCNA משמש כבקרת טעינה (loading control). לאחר צפייה בסרטון זה, תגבירו את הבנתכם לגבי אופן ביצוע השלבים וההגדרות שאנו מציעים כדי להגיע לתוצאות בתוך פחות משש שעות לאחר קיבוע התאים.
לסיכום, השלבים הם חסימה, דגירה של נוגדן ראשוני, דגירה של probed PLA, הגברה באמצעות ליגציה, קיבוע והדמיה.
סקירה כללית
מחקר זה מדגים את השימוש במבחן ליגציה בקרבה (PLA) להדמיה של איתות Bone Morphogenetic Protein (BMP) בתאים מקובעים. הטכניקה מאפשרת כימות של קומפלקסים אפקטוריים שהופעלו על ידי BMP לאורך זמן תחת גירוי של BMP4.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- העברת אותות
רקע
- BMPs חיוניים להתפתחות איברים ורקמות.
- הם מווסתים תהליכים כגון פרוליפרציה ודיפרנציאציה של תאי גזע.
- הבנת הדינמיקה של סיגנל BMP חיונית לטיפול במחלות קשורות.
- PLA מציעה שיטה רגישה לחקר מסלולי סיגנלינג אלו.
מטרת המחקר
- להצגת סיגנל BMP בתאי תרבית רקמה.
- לכימות היווצרות של קומפלקסים אפקטורליים כמענה לגירוי BMP.
- להערכת היתרונות של PLA לעומת שיטות מסורתיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תרבית תאים של תאי Neuro 2A תחת תנאים ספציפיים.
- שימוש בנוגדנים ראשוניים לזיהוי אפקטורים של SMAD זכפוסלפילציה ו-SMAD4.
- יישום גששים של PLA עבור קישור קרבה (proximity ligation).
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית להדמיית קומפלקסים שנוצרו במהלך סיגנליזציית BMP.
תוצאות עיקריות
- ויזואליזציה מוצלחת של קומפלקסים של אותיות BMP בתאים.
- כימות של רמות אותיות BMP פעילות לאורך זמן.
- הדגמה של הרגישות וקלות השימוש של PLA.
- יישומים פוטנציאליים לאבחון מחלות הקשורות לאותיות BMP.
מסקנות
- PLA היא שיטה יעילה לחקר דינמיקת האיתות של BMP.
- ניתן להתאים את הטכניקה לתנאים ניסיוניים שונים.
- תובנות שיירכשו עשויות לתרום להבנת מחלות הקשורות ל-BMP.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסגרת ניהולית
זיהוי של קומפלקסי אפקטור של אות BMP אנדוגניים באמצעות PLA in situ מספק קריאה כמותית ורגישה של הפעלת המסלול בתאים מקובעים. דבר זה מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטיים של היפותזות טיפוליות המכוונות ל-BMP על ידי הבחנה בין פוספורילציה לבין היווצרות קומפלקס פונקציונלי. הבדיקה תומכת בתיקוף המטרה ובפיתוח בדיקות בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי אספקת כימות בעל רזולוציה מרחבית וללא רעש רקע של אירועי העברה של אותות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזת השליח של BMP על ידי מדידת היווצרות קומפלקס phospho-Smad1/5/8–Smad4 אנדוגני כמדד תפקודי להפעלת המסלול.
- ערך תפעולי: מספק כימות של קומפלקסי אפקטור ברגישות גבוהה ורקע נמוך, ובכך מפחית תוצאות חיוביות שגויות הנובעות משיטות זיהוי המבוססות על פוספורילציה בלבד.
- ערך חיזוי: תומך במידת הוודאות של המטרה על ידי הבחנה בין פוספורילציה של Smad לבין translocation גרעינית אל תוך קומפלקסים פעילים תעתוקית.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: יוצר נקודות פלואורסצנטיות נפרדות שניתן לספור, המתאימות לדימות אוטומטי ולניתוח כמותי לצורך אישור פגיעות (hit confirmation) במסעות סריקה.
- שחזוריות: מספק פלט אות סטנדרטי מבוסס הגברה, הממזער את השונות בין מפעילים שונים ובין הרצות ניסוייות.
- סקילביליות (יכולת הרחבה): תואם לפורמטים של מספר בארות וניתן להתאמה לפלטפורמות דימות בעלות תוכן גבוה (high-content imaging) למחקרי מודולציה של מסלולים לאורך זמן.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מקשר בין הדינמיקה של סיגנל BMP לתהליכים פתופיזיולוגיים בהתפתחות, בוויסות תאי גזע ובהומאוסטזיס של רקמות הרלוונטיים לאינדיקציות דגנרטיביות ואונקולוגיות.
- המשכיות תרגומית: מאפשר השוואה של פעילות המסלול בין מודלים in vitro לבין רקמות ראשוניות, ובכך תומך בהתאמת ביומרקרים באישוש פרה-קליני.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מבהיר האם פוספורילציה של Smad שנצפתה מתרגמת להיווצרות של קומפלקס אפקטור פונקציונלי, ובכך מפחית נשירה הנובעת ממעורבות חלקית של המסלול.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
הבדיקה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות על מטרות, דרך זיהוי מובילים ועד לאישור פרה-קליני, על ידי אספקת קריאה כמותית ובעלת רזולוציה מרחבית של יכולת העברת האותות של BMP.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות על ידי מדידה של היווצרות קומפלקסים אפקטורים אנדוגניים של Smad כקריאה ישירה של סיגנלינג המושרה על ידי BMP4.
- סריקה: מאפשר מוכנות של הבדיקה באמצעות היווצרות נקודות (spots) סטנדרטיות התלויות בהגברה, המאפשרות כימות של מודולציה של המסלול המושרה על ידי תרכובות ברגישות גבוהה.
- אנליטיקה: מספק ספירות כמותיות של נקודות גרעיניות לכל תא, המקלות על השוואת דינמיקת הסיגנלינג לאורך נקודות זמן, מינונים, והפרעות גנטיות או פרמקולוגיות.
- מחקר תרגומי: מקשר בין מדידות סיגנלינג של BMP in vitro לרלוונטיות פתופיזיולוגית באמצעות לוקליזציה תת-תאית וזיהוי ספציפי לקומפלקס, ובכך תומך במודלים פרה-קליניים המותאמים לסמני ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר לזיהוי קרבה (proximity detection), הניתנת להתאמה למסלולי סיגנלינג אחרים (למשל, TGF-β, Wnt) באמצעות החלפת זוג הנוגדנים, ובכך ממקסם את ההשקעה בריאגנטים ובזרימת העבודה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות BMP על ידי הפרדה בין קומפלקסים של איתות פעיל לבין אירועי פוספורילציה שאינם פעילים.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזוריות וסטנדרטיזציה באמצעות הגברה אנזימטית ושלבי ליגציה מוגדרים של אוליגונוקלאוטידים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות (go/no-go) על ידי הפחתת עמימות מכניסטית במודולציה של מסלול BMP בשלבים מוקדמים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של תרכובות המודולות BMP על בסיס יצירת קומפלקסים פונקציונליים ולא על בסיס סממני פוספורילציה חלופיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באימונופלורסצנציה, תיקוף נוגדנים ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית לצורך זיהוי וכמותיות של נקודות (spots).
- תלוי בגישה לרכיבי ערכת Duolink PLA, כולל פרוbes של PLA, אנזימי ליגציה והגברה, ובמיקרוסקופ פלואורסצנטי עם סטים מתאימים של מסננים.
- מחייב סטנדרטיזציה של תנאי הקיבוע, הפרמיאביליזציה והחסימה בין מעבדות כדי להבטיח נגישות עקבית של הפרוbes ויחסי אות-רעש עקביים.
- התאמה לרקמות ראשוניות או עוברים שלמים מחייבת אופטימיזציה של הפרמיאביליזציה וחדירות הנוגדנים תוך שימור הלוקליזציה התת-תאית של קומפלקסים של אותות.
- מגבלות מעשיות כוללות תלות בזוגות נוגדנים מאושרים ובעלי איכות גבוהה, וסכנה לעכבה סטרית במדורים תת-תאיתים צפופים המשפיעה על קרבת הפרוbes.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:00
Title
2:56
Plating of Cells and Treatment with BMP
4:12
Fixation and Permeabilization
10:56
In Situ Proximity Ligation Assay Results from Neuro2a Cells Treated with BMP4
6:49
The Proximity Ligation Assay (PLA)
5:26
Blocking and Primary Antibodies Application
9:54
Preparation for Imaging
12:18
Conclusion
