Name: איתור של מפעיל איתות, מתחמי Downstream של BMP4 שימוש באתרו PLA, Assay קשירת הסמיכות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-03T17:03:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: למדו לדמיין ולכמת איתות BMP בתאי תרבית באמצעות שיטת PLA. השיטה מאפשרת זיהוי מורכבים פעילים של SMAD ו-SMAD4 בזמן אמת, ומסייעת בחקר דינמיקת איתות בתאים חיים ובאבחון מחלות קשורות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי MRC ואת מענקי BBSRC. אנו מודים אגתה Zieba וקתרינה Pardalis במעבדה של אולף Landegren, אופסלה על העזרה עם הקמת טכניקה ועצות שימושיות. Olink Biosience לעזרה טכנית את המצגת.

1. ציפוי של תאים וטיפול עם BMP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרבות תאים Neuro2a ב GMEM בתוספת 10% FBS, 1x שאינם חיוניים חומצות אמינו (NEAM), 1x pyruvate נתרן 1x-L-גלוטמין. פצל את התאים באמצעות טריפסין (0.05%, EDTA) ו 15.000-20.000 צלחת התאים היטב לכל שקופית 16-באר קאמרית. תרבות HEK293T או Cos7 תאים DMEM בתוספת 10% FBS, 1x-L-גלוטמין ו 1x פניצילין / סטרפטומיצין. לעקר שקופיות polysine ידי שיקוע שלהם אתנול 70% באמצעות עט Immedge לשאוב מבארות 1 2 ס"מ. פצל את התאים באמצעות טריפסין (0.05%, EDTA) ו 20.000-25.000 צלחת התאים לכל טוב בינוני 50 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס humidified, 5% CO 2 באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 24 שעות להחליף את מדיום עם סרום חינם GMEM (בתוספת 0.1% אלבומין, NEAM 1x, 1x pyruvate נתרן 1x-L-גלוטמין) עבור Neuro2a או עם סרום חינם DMEM (בתוספת L-גלוטמין ו 1x פניצילין / סטרפטומיצין) עבור HEK293T / Cos7 ו דגירה התאים עבור 2-3 ח שמור שלוש בארות עם תאים בתנאים culturing נורמלי (כלומר 10% FBS) כדי להשתמש בהם שולטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנקו את התאים dorsomorphin (מעכב של מסלול BMP, 2 מיקרומטר) או BMP4 (25 ng / ml) בפעם הרצוי (למשל עבור h 10 min-1) 5. </li></ol> 2. קיבוע ו Permeabilization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מקבע, PFA 4%. לשקול 4 גרם של PFA להכין פתרון 4% 100 מ"ל PBS. חם הפתרון על 50 מעלות צלזיוס עד ברור. סנן את הפתרון דרך פילטר 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב 4 ° C עד השימוש. השתמש מקבע טרי (לא מאוחסן במשך יותר מ 2 ימים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום מבארות ולשטוף עם 1xPBS. אל פיפטה פתרונות ישירות על התאים כמו זה עלול לגרום ניתוק של התאים. לפני שנמשיך לשלב הבא, אם שקופיות קאמרית משמשים להסרת תאים, אך להשאיר את סיליקון סביב הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl PFA 4% ו דגירה עבור 10min, ב RT, ללא תסיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם PBS דקות 3 5 x בצנצנת Coplin בהתרגשות על RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנקו את התאים עם 0.5% Triton X-100 ב PBS במשך 10 דקות ללא תסיסה ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים Tween 0,05 20% TBS (TBS-T) עבור 3 דקות 5 x בצנצנת Coplin בהתרגשות ב RT. </li></ol> 3. חסימת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש את TBS-T. הוסף טיפה אחת של פתרון Duolink חסימת II (1x) לכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השקופיות בחדר מחומם מראש לחות עבור h 1 ב 37 ° C. </li></ol> 4. ראשי נוגדנים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים לדלל aP-Smad1/5/8 (ארנב polyclonal) בשעה 1:100 ו-Smad4 (עכבר חד שבטיים) בשעה 1:100 ב II Duolink נוגדן diluent (1x). הכן גם aP-Smad1/5/8 ו-Smad4 לבד הריכוזים אותו לשמש שולטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש את פתרון חסימת מן השקופיות. הסר כפתרון חסימת רב ​​ככל האפשר, אבל לטפל נוספת לא לתת התאים היבשים לפני הוספת נוגדנים. הוסף 40 μl של פתרונות נוגדנים הבארות. באחד גם להוסיף diluent נוגדן רק כפקד שליליות נוספות. </li></ol> 5. PLA בדיקות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את שתי חלליות PLA (Duolink II אנטי עכבר מינוס Duolink השנייה נגד ארנב PLUS) 01:05 ב diluent נוגדן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש את הפתרון הנוגדן העיקרי מן השקופיות. שטפו את השקופיות 2 פעמים 5 דקות כל אחד עם הצפת 1x Duolink לשטוף II בצנצנת Coplin בהתרגשות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש את הצפת לשטוף משקופיות ומוסיפים את הפתרון בדיקה PLA (40 μl / טוב). דגירה השקופיות בחדר מחומם מראש לחות עבור h 1 ב 37 ° C. </li></ol> 6. קשירת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המערבולת השנייה Duolink מניות קשירת (5x) ו 01:05 לדלל במים טוהר לערבב גבוהה. בעת חישוב נפח המים, לקחת בחשבון את נפח האנזים אשר יתווספו בדילול סופי של 1:40 בדיוק לפני תוספת של לערבב את הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש את הפתרון בדיקה PLA מן השקופיות. שטפו את השקופיות הצפת לשטוף 1x עבור 2 פעמים 5 דקות כל אחד בצנצנת Coplin בהתרגשות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את האנזים מהמקפיא באמצעות לחסום הקפאה (-20 ° C). מוסיפים את האנזים לפתרון קשירת (שהוכנו 6.1) בשעה 1:40 דילול מערבולת ו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש את הצפת לשטוף משקופיות ומוסיפים את הפתרון קשירת האנזים, זה טוב (40 μl / טוב). דגירה השקופיות בחדר מחומם מראש לחות למשך 30 דקות ב 37 ° C. </li></ol> 7. הגברה הערה: חומרים כימיים רגישים לאור. שמור את השקופיות מוגן מפני אור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את המניות השנייה Duolink הגברה (5x) 01:05 במים טוהר לערבב גבוהה. בעת חישוב נפח המים לקחת בחשבון את עוצמת הקול של פולימראז כי יתווספו בדילול סופי של 1:80 בדיוק לפני תוספת של לערבב כדי הדואר בארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש את הפתרון, קשירת האנזים מן השקופיות. שטפו את השקופיות הצפת לשטוף 1x עם עבור 2 פעמים 2 דקות כל אחד בצנצנת Coplin בהתרגשות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את פולימראז מהמקפיא באמצעות לחסום הקפאה (-20 ° C). מוסיפים את פולימראז לפתרון הגברה (שהוכנו 7.1) בשעה 1:80 דילול מערבולת ו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש את הצפת לשטוף משקופיות ומוסיפים את פתרון הגברה-פולימראז זה טוב (40 μl / טוב). דגירה השקופיות בחדר מחומם מראש לחות עבור 100 דקות ב 37 ° C. </li></ol> 8. הכנה הדמיה הערה: חומרים כימיים רגישים לאור. שמור את השקופיות מוגן מפני אור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש את פתרון הגברה-פולימראז משקופיות ולשטוף עבור 2 פעמים 10min כל 1x Duolink II לשטוף הצפת B בצנצנת Coplin בהתרגשות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים את השקופיות 0.1 x לשטוף הצפת B. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את סיליקון משקופית 16-הבאר לחלוטין. הוסף את ~ 40μl של השנייה Duolink הרכבה בינונית עם DAPI על coverslip ומניחים בעדינות על זה את דגימות לחיצה אותו מעט, כך אין בועות אוויר תחת להחליק את המכסה. תיקון ו לאטום את coverslip בשקופית באמצעות לק. חכו לפחות 15 דקות לפני שתמשיך הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח דגימות במיקרוסקופ confocal או פלואורסצנטי. השג תמונות דיגיטליות. </li></ol> 9. קביעת כמות הערה: חומרים כימיים רגישים לאור. שמור את השקופיות מוגן מפני אור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש Duolink ImageTool לספור את האותות על התמונות כדי לקבל מדידה של רמת איתות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השווה את המדידות ולעשות גרף. </li></ol> 10. נציג תוצאות התוצאה של הניסוי PLA באתרו מראה כתמים ניאון כמו בדידים. מיקומה של האות תלוי חלבונים ספציפיים למד. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/2631/2631fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> איור 1. PLA באתרו על תאים Neuro2a לאחר גירוי BMP4. תאים שטופלו 2 מיקרומטר dorsomorphin (מעכב של מסלול BMP) (א) או 25 ng / ml BMP4 (ב) במשך 60 דקות או מטופל (CE). נוגדנים נגד P-Smad1/5/8 ו Smad4 שימשו כדי לאתר את מתחמי פעיל A ו-B נוגדנים העיקרי aP-Smad1/5/8 לבד (C) ו-Smad4 לבד (ד) או מחדל של הראשוני נוגדנים (E) שימשו שולטת. כחול: DAPI: אדום: אותות PLA. התמונות התקבלו עם מיקרוסקופ SP5 confocal לייקה. (F) האותות PLA נמנו עם התוכנה Duolink ImageTool ואת המספר הממוצע של כתמי בגרעין לכל תא מוצגת על הגרף. (ז) בתאים Neuro2a היו מטפלים או מטופלים עם Dorsomorphin (2 מיקרומטר) או BMP4 (25 ng / ml) עבור 60 דקות. התאים היו lysed ואת החלבונים היו נתונים SDS-PAGE ונותחו על ידי immunoblotting עם aP-Smad1/5/8 ו-PCNA כמו טעינה מלאה. (*) הלא ספציפית הלהקה. שים לב נוגדן aP-Smad1/5/8 לא ניתן להבחין בין 3 חלבונים שונים נוכח מורכבות עם Smad4.

<ol><li>Miyazono, K., Kamiya, Y., Morikawa, M. B. one <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((morphogenetic+protein+receptors+and+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">morphogenetic protein receptors and signal transduction.</a> J Biochem. 147, 35-51 (2010).</li>
<li>Gustafsdottir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+ligation+assays+for+sensitive+and+specific+protein+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses.</a> Anal Biochem. 345, 2-9 (2005).</li>
<li>Soderberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nat Methods. 3, 995-1000 (2006).</li>
<li>Soderberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45, 227-232 (2008).</li>
<li>Yu, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsomorphin+inhibits+BMP+signals+required+for+embryogenesis+and+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism.</a> Nat Chem Biol. 4, 33-41 (2008).</li>
<li>Baan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+proximity+ligation+detection+of+c-Jun%2FAP-1+dimers+reveals+increased+levels+of+c-Jun%2FFra1+complexes+in+aggressive+breast+cancer+cell+lines+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">In situ proximity ligation detection of c-Jun/AP-1 dimers reveals increased levels of c-Jun/Fra1 complexes in aggressive breast cancer cell lines in vitro and in vivo.</a> Mol Cell Proteomics. 9, 1982-1990 Forthcoming.</li>
<li>Massinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interaction+of+DYX1C1+with+estrogen+receptors+suggests+involvement+of+hormonal+pathways+in+dyslexia%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Functional interaction of DYX1C1 with estrogen receptors suggests involvement of hormonal pathways in dyslexia.</a> Hum Mol Genet. 18, 2802-2812 (2009).</li>
<li>Thymiakou, E., Zannis, V. I., Kardassis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+functional+interactions+between+liver+X+receptor%2Fretinoid+X+receptor+and+Sp1+modulate+the+transcriptional+induction+of+the+human+ATP+binding+cassette+transporter+A1+gene+by+oxysterols+and+retinoids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Physical and functional interactions between liver X receptor/retinoid X receptor and Sp1 modulate the transcriptional induction of the human ATP binding cassette transporter A1 gene by oxysterols and retinoids.</a> Biochemistry. 46, 11473-11483 (2007).</li>
</ol>

ההפקה של המאמר וידאו זה היה בחסות OLINK שעושה מגיב המשמשים את ההליך קשירת הקרבה assay.

ויזואליזציה של קומפלקסים חלבונים באתרו הוא ביקוש רב, במיוחד ללימודי איתות שבו אינטראקציה חלבון חלבון שינוי הם האמצעים כי התאים לשימוש שולח איתות מפני השטח שלהם לגרעין. זה לא היה ניתן לחזות ולכמת קומפלקסים בין שני חלבונים אנדוגניים באתרו עם immunofluorescence לפני. Co-לוקליזציה של נוגדנים מוצגים ברזולוציה נמוכה ולא ניתן להשתמש בהם כדי לחזות אינטראקציה אמיתית. PLA היא טכניקה חדשה כי החוקרים התחילו להשתמש במערכות שונות בהצלחה רבה 6, 7. כאן, אנו מדגימים כיצד להשתמש PLA לא רק לדמיין אלא גם לכמת מתחמי אנדוגני בין effectors Smad מופעל הזרם לאורך זמן של גירוי BMP. השתמשנו שונים כולל תאים בתרבית רקמה Neuro2a ו הסתמכה על נוגדנים מסחרי וגדל מינים שונים (עכבר ו-Smad4 ארנב aP-Smad1/5/8) כדי להשיג את זה (איור 1). שיטה זו אפשרה לנו, בפעם הראשונה, כדי לראות את ההפעלה של BMP-מתחמי מפעיל לאורך זמן ולא רק את נוכחותם של Smad1/5/8 פוספורילציה, אשר לא יכול להיות כל העוסקים מתחמי פעיל עם Smad4. ספרנו את האותות (תאנה 1F) והשווה את המדידה עם כימות המתקבל immunoblot של תאים באותו 8 (דמות 1G). הגענו למסקנה כי מספר המקומות מספקים מדידה השוואתית מדויקת של איתות רמות לאורך זמן. השיטה יושמה גם על שורות תאים אחרים (HEK293T ו Cos7) עם תוצאות דומות (מידע לא מוצג). העיקרון של הטכנולוגיה מבוססת על שתי בדיקות ייחודי המסופק עם ערכת Duolink. כל בדיקה PLA מכיל נוגדנים משני המחובר oligonucleotide סינתטי ייחודי, אשר משמש ככתב. קרבתו של בדיקות ה-DNA מאפשר קשירת על המיקום המדויק שבו אלו בדיקות מחוברים בסמיכות. המרחק של oligonucleotides, המאפשר הכלאה דנ&quot;א קשירת קטן (40nm &lt;) ולכן, חלבונים רק כי אינטראקציה יכולה להרשות קשירת. הדנ&quot;א ligated אז יכול להיות מוגבר מזוהה עם הכלאה של oligonucleotides שכותרתו רצף מוגבר. הגברה הוא ספציפי כמו זה תלוי DNA-DNA עקרונות ההכלאה וגם מספק רגישות גבוהה כמו ה-DNA ligated מוגבר פי כמה וכתוצאה מכך שיפור של האירוע קשירת הראשונית. דנ&quot;א מוגבר הוא זוהה על ידי הכלאה עם oligonucleotides שכותרתו ומייצרת מקום גלוי גדול למדי. כמו כתמים ניתן לספור, את האות PLA מספק לא רק את המידע המרחבי המדויק (את המיקום של האירועים אינטראקציה), אלא גם דרך לכימות אובייקטיבי של האירועים הללו 2-4. טכניקות אחרות, כי הם מועסקים לצורך זיהוי של אינטראקציות חלבון כוללים שיתוף immunoprecipitation, immunofluoresence ו תהודה פלורסנט העברת אנרגיה (סריג). Co-immunoprecipitation מבחני נמצאים בשימוש נרחב המאפשר בידוד של קומפלקסים חלבונים. השיטה מלווה immunoblotting כלומר חלבונים חייב לבוא לידי ביטוי ברמות גבוהות יחסית כדי להיות מזוהה. בעיות רקע גבוה או שאינו ספציפי המחייב של חלבונים מסוימים החרוזים הם לפעמים קשה להתגבר immunoprecipitation שיתוף. בנוסף, שיתוף immunoprecipitation מבחני לאפשר זיהוי של חלבונים יכולה להיות חלק ממכלול חלבון אך אינה יכולה להבחין אלה נמצאים בסמיכות פיזית מאוד באינטראקציה אחד עם השני. יתר על כן, שיתוף immunoprecipitations לא יכול לספק quantitation ברזולוציה תא יחיד או מידע על לוקליזציה של קומפלקסים חלבונים בתא. איתור של דו קיום של קומפלקסים חלבונים בתא או תא תא על ידי immunofluoresence מבוססת על חפיפה של אותות מתפזרת ולכן, יש ברזולוציה מרחבית נמוכה, לא יכול לספק מידע מדויק על אינטראקציות חלבון. כימות האות immunofluoresence יכול להיעשות על ידי הערכה ויזואלית רק אם ההבדל הוא פי כמה וכמה, ולא ניתן למדידה מדויקת או כמו כתמים PLA. סריג מאפשר הדמיה של קומפלקסים חלבונים בתאים חיים מתגבר הצורך נוגדנים חשיפת epitope. עם זאת, סריג בדרך כלל תלוי overexpression של חלבונים התמזגו מלאכותיים, אשר לא תשקף את קומפלקסים חלבונים אנדוגניים כפי PLA. התנאים חסימת את פרוטוקול PLA הם קריטיים כמו צבירה נוגדנים עלולה להתרחש ולהגדיל את הרקע. התנאים חסימת אלטרנטיבית ניתן למצוא גיליונות מוצר נוגדן. בקרות מתאימות עם השמטה הנוגדן הראשוני והמשני לספק מידע על מה אולי השתבש והם צריכים להיכלל תמיד. חשוב מסך נוגדנים שונים שייתן את הרקע לפחות כאשר הם משמשים לבד את האות הטוב ביותר כאשר הם ביחד. קיבוע של cells הוא קריטי כמו מעל לתקן עלול לגרום קומפלקסים חלבונים באופן מלא לפגל ו לבזות, ואילו קיבעון מספיק עלול להוביל לאובדן של קומפלקסים חלבונים במהלך השלבים של ההליך. זה יכול להיות נשלט על ידי הפחתת הריכוז של מקבע כדי 3% או על ידי הגבלת זמן קיבעון. עם זאת, קיבעון תלוי גם בשאלה האם נוגדנים העיקרית לזהות חלבונים מפוגל או לא. כמו טכניקה PLA רגיש מאוד, טיפול מיוחד נדרש כדי לשמור על פי הדגירה ותנאי המיקרו שווה בין מדגמים שונים. דוגמאות לא צריך להשאיר לייבוש על מקרה לפני השלב הסופי. ייבוש של הדגימות יכול להוביל רקע מוגבר. הסרה מלאה של פתרון חסימת חיוני גם כדי למנוע רקע. מאגרים לשטוף צריך תמיד להביא לטמפרטורת החדר לפני השימוש, כמו טמפרטורה נמוכה מאטה את תגובות אנזימטיות. עבור פתרון בעיות נוסף עיין במדריך של קיט. כדאי להשתמש כתמים לברר את לוקליזציה המשנה הסלולר של האות PLA (למשל DAPI, אקטין וכו &#39;). כאן השתמשנו DAPI (במדיום הרכבה) להכתים את הגרעינים. PLA תואם השימוש immunofluorescence עם נוגדנים כדי לקבוע את סוג התא או תא סלולרי (לא מוצג כאן). כימות מדויק יכול להיעשות על ידי ספירת אותות שימוש בתוכנות מסוימות (כלי Duolink תמונה, Olink Biosience). לסיכום אנו הדגימו כיצד להשתמש ב-PLA באתרו, באמצעות ערכת Duolink לזהות BMP איתות בתאי קבוע והציגו יתרונות: קל לשימוש, רגיש מאוד, לא רקע, יכולת ייחודית לכמת BMP פעיל איתות באתרם. המגבלה של החלת בטכניקה זו כדי ללמוד אינטראקציות חלבון שונה תלוי בזמינות ובאיכות של נוגדנים העיקרי לזהות את החלבונים תחת חקירה.

<table><tbody><tr><td>GMEM</td><td>Invitrogen</td><td>21710025</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>21063029</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל רבוב (FBS)</td><td>AutogenBioclear</td><td>7.01</td><td></td></tr><tr><td>חומצות אמינו שאינן חיוניות</td><td>Invitrogen</td><td>11149068</td><td></td></tr><tr><td>סודיום פירובט</td><td>Invitrogen</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין / סטריפטומייסין</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Invitrogen</td><td>25030-054</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין, 0.05% (1X) עם EDTA 4Na, נוזל</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות תאיים בעלות 16 תאים</td><td>Lab-Tek</td><td>178599</td><td></td></tr><tr><td>פוליסין</td><td>VWR international</td><td>631-0107</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית כיסוי</td><td>VWR international</td><td>631-0138</td><td></td></tr><tr><td>a-pSmad1/5/8</td><td>טכנולוגיית אותיות תאיות</td><td>9511</td><td></td></tr><tr><td>a-Smad4 (B8) </td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-7966</td><td></td></tr><tr><td>דורסומורפין (Dorsomorphin)</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>171260-10MG</td><td></td></tr><tr><td>BMP-4 רקומביננטי מעכבר</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>5020-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>קיבוע ב-PFA (פראלדההיד)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Promega Corp.</td><td>H5151</td><td></td></tr><tr><td>&lt;קישור ל-&quot;http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380&quot;&gt;ריאגנטים לגילוי Duolink II (כתום)&lt;/a&gt;</td><td>Olink Bioscience</td><td>92007-0100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;קישור ל-&quot;מוצרי DuoLink&quot;&gt;גשש Duolink II PLA נגד עכבר MINUS&lt;/a&gt;</td><td>Olink Bioscience</td><td>92004-0100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;קישור ל-&quot;מוצרי DuoLink&quot;&gt;Duolink II PLA probe anti-Rabbit PLUS&lt;/a&gt;</td><td>Olink Bioscience</td><td>92002-0100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;קישור ל-&quot;מוצרי DuoLink&quot;&gt;תוכנית הרכבה Duolink II עם DAPI&lt;/a&gt;</td><td>Olink Bioscience</td><td>82040-0005</td><td></td></tr><tr><td>&lt;קישור ל-&quot;מוצרי DuoLink&quot;&gt;בחומי שטיפה של Duolink II פלואורסצנציה&lt;/a&gt;</td><td>Olink Bioscience</td><td>82049</td><td></td></tr></tbody></table>

איתור של מפעיל איתות, מתחמי downstream של bmp4 שימוש באתרו pla, assay קשירת הסמיכות

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

BMPs אחראים מגוון רחב של השפעות ביולוגיות התפתחותיים. קולטנים BMP להפעיל (phosphorylate) Smad1/5/8 effectors, אשר לאחר מכן, בצורה מורכבת עם Smad4 ו translocate לגרעין שם הם מתפקדים גורמי תעתוק ליזום השפעות BMP במורד ספציפי 1. מסורתית חיסונית הקרינה טכניקות עם נוגדנים נגד phospho-Smad פפטידים התערוכה רגישות נמוכה, רקע גבוה להציע כימות ברוטו כפי שהם מסתמכים על עוצמת האות נוגדן במיוחד אם זה רגיש לאור ניאון. בנוסף, phospho-Smads לא יכול כל להיות מורכב עם Smad4 ועסק שעתוק פעיל. באתרו PLA היא טכנולוגיה מסוגל לאתר אינטראקציות חלבון עם סגוליות גבוהה ורגישות 2-4. זו טכנולוגיה חדשה לזוגות נוגדן הכרה עם הגברה של פונדקאית DNA של החלבון. זה יוצר אות מקומי, דיסקרטי בצורה של כתמים לחשוף את המיקום המדויק של האירוע הכרה. מספר אותות ניתן לספור והשוו מתן המדידה. אנו ליישם PLA באתרו, באמצעות ערכת Duolink, עם שילוב של נוגדנים המאפשר זיהוי של effectors איתות BMP ו phospho-Smad1/5/8 Smad4 רק כאשר אלה נמצאים בסמיכות כלומר במתחם, אשר מתרחשת רק עם איתות ההפעלה. זו אפשרה, לראשונה, את להדמיה ומדידה של BMP אנדוגני איתות עם ייחוד רגישות גבוהה בניסוי הזמן כמובן תחת גירוי BMP4.

כאן אנו מראים כיצד להשתמש קשירת הסמיכות Assay (PLA), עם שילוב של נוגדנים לדמיין המוךפו&quot;גנטי שהולך עצם חלבון (BMP) איתות תאים קבוע. טכניקה זו אפשרה לנו לעקוב אחר הצטברות הגרעין של BMP אנדוגני מופעל מפעיל, מתחמי ולכמת רמות שלהם לאורך זמן תחת גירוי BMP4.

איתור של מפעיל איתות, מתחמי Downstream של BMP4 שימוש באתרו PLA, Assay קשירת הסמיכות

חלבונים ממשפחת ה-BMP אחראים למגוון רחב של השפעות התפתחותיות וביולוגיות. רצפטורים של BMP מפעילים (מזרחנים) את האפקטורים Smad1/5/8, אשר לאחר מכן...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להדגים ולכמת את השליח (signaling) של BMP בתאי תרבית רקמה. BMPs נקשרים לקולטנים על פני השטח של התא ומבצעים פוספורילציה לשלושה אפקטורי smad: smad one, smad five ו-SMAD eight. אלו יוצרים קומפלקסים עם smad four ונעברים לגרעין התא, שם הם מנהלים את התעתוק.כאן אנו משתמשים ב-PLA כדי להדמיאן קומפלקסים הנוצרים בין אפקטורי SMA אנדוגניים לבין smad four בתרביות תאים, עם או בלי גירוי BMP. התהליך מתחיל בשימוש מקבילי בשני נוגדי ראשון, שאחד מהם מזהה את כל שלושת אפקטורי smma המפוספורים, והשני מזהה את smad four. נוגדים משניים הנקראים מתמטי PLA, שכל אחד מהם מצומד לגדיל DNA קצר וייחודי, נקשרים לנוגדי הראשון; כאשר מתמטי ה-PLA נמצאים בקרבה רבה זה לזה, גדילי ה-DNA מגיבים באמצעות הוספה עוקבת של שני אוליגונוקלאוטידי DNA יוצרי מעגל.אלה מחוברים יחדיו באמצעות ליגציה אנזימטית ויוצרים מעגל שעובר הגברה באמצעות שכפול מעגלי מתגלגל (rolling circle replication) לאחר תגובת ההגברה. היברידיזציה של גששים (probes) אוליגונוקלאוטידיים משלימים מסומנים מדגישה את נקודות הפלואורסצנציה של התוצר הקשור להגברה של כל תוצר DNA מעגלי. תוצרי ה-DNA נראים בקלות.בבחינה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה, הנקודות תואמות לקומפלקסים שבין effector, seds ו-smad four, המעידים על איתות BMP פעיל בתא. היתרונות העיקריים של PLA על פני שיטות קיימות הם קלות השימוש, רגישות גבוהה והיעדר רקע, וניתן להשתמש בו לכימות איתות BMP פעיל in situ. נתיב ה-BMP חיוני להתפתחותם של איברים ורקמות שונים ולתהליכים הכוללים פרוליפרציה ודיפרנציאציה של תאי גזע.ניתן להשתמש ב-PLA כדי לבחון שאלות מפתח הנוגעות לדינמיקה, לרמות ולמיקום התת-תאי של סיגנליזציית BMP, אך ניתן להשתמש בו גם לצורכי אבחון. מכיוון שמסלול זה עומד בבסיסן של מספר מחלות, ניתן להשתמש ב-BLA כדי לחקור רכיבי העברת אותות אחרים של BMP או של מסלולים אחרים, וניתן להתאימו לעבודה על חתכי רקמה או על עוברים שלמים. כדי להתחיל את בדיקת ה-proximity ligation assay in situ, הכינו את תרביות התאים: תאי Neuro two A גודלים ב-GMEM מועשר ב-10% FBS, פי 1 חומצות אמינו לא חיוניות, פי 1 פירובט ופי 1 L glutamine.פצל את התאים באמצעות trypsin והעבר לכל באער 15,000 עד 20,000 תאים. בתוך שקופית עם 16 תאים (chamber slide), דגור את התאים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius בתוך אינקובטור לח עם 5%carbon dioxide למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות.החליפו את מצע התרבית ב-GMEM ללא סרום מועשר והדגירו למשך שעתיים עד שלוש שעות נוספות עבור הביקורות. השאירו שלוש בארות עם תאים בתרבית ובתנאים רגילים לאחר ההדגרה השנייה. עכבו את מסלול ה-BMP על ידי טיפול בתאים ב-2 µM dorsamorphine או גרו את האותות על ידי טיפול בתאים ב-BMP 4 למשך 10 עד 60 דקות.לאחר גירוי התאים, שאבו את המצע מהבארות ושטפו בעדינות את התאים ב-PBS כדי למנוע התנתקות של תאים. אין להעביר את ה-PBS בפיפט ישירות על התאים. לאחר מכן, שאבו את ה-PBS והסירו את התאים (chambers), אך השאירו את הסיליקון מסביב לבארות.הוסיפו 50 µL של 4% paraformaldehyde מסונן ושהוכן טרי לבארות, והדגירו למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ללא ערבוב. לאחר הקיבוע, שטפו את התאים עם PBS למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב בתוך Copin jar. חזרו על השטיפה פעמיים, לסך הכל שלושה שטיפות.בשלב הבא, בצעו פרמיאביליזציה לתאים באמצעות 0.5% Triton X 100 ב-PBS בתוך צנצנת צביעה (copin jar), והדגירו אותם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ללא ערבוב. לאחר מכן, שטפו את התאים עם 0.05% Tween 20 ו-TBS שלוש פעמים, למשך חמש דקות לכל שטיפה, עם ערבוב בצנצנת צביעה. התחילו את הליך החסימה (blocking) על ידי טפיחה על הפסית להסרת תמיסת השטיפה האחרונה.יש להקפיד שהתאים לא יתייבשו. יש להוסיף טיפה אחת של DUO link לתמיסת החסימה בכל באר. דגרו את התאים בתמיסת החסימה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius בתוך תא לחות שחומם מראש, העשוי מקופסת טיפים ריקה עם מים מזוקקים.להכנת תמיסות הנוגדנים הראשוניים, יש לדלל את ה-anti phospho smad 1 5 8 ואת ה-anti SMAD four one ביחס של 1:100 ב-duo link two antibody diluent. השתמש בכל נוגדן לבדו ובשילוב ביניהם. כעת, הקישו על השקף כדי להסיר ממנו את תמיסת החסימה והוסיפו 40 µL מתמיסות הנוגדנים לבארים המתאימות; ניתן לכלול ביקורת שלילית עם diluent בלבד.בצע שלב זה במהירות כדי למנוע מהתאים להתייבש. כעת, דגרו את השקופיות בטמפרטורה של 37 °C בתא לחות שחומם מראש למשך שעה אחת. במהלך הדגירה, דללו את שני גששי ה-PLA בדילואנט.עבור כל תערובת תגובה, ערבבו 8 µL מכל גשושית ו-24 µL של מדלול, כך שהגשושיות מדללות ביחס של 1:5 בתוך התמיסה. לאחר אינקובציה של שעה אחת, התירו את תמיסת הנוגדן הראשוני ושטפו את השקופיות פעמיים עם Duo link to Wash Buffer a למשך חמש דקות בכל פעם בטמפרטורת החדר, תוך써 ערבוב בתוך כלי צימוד. עם סיום השטיפות, התירו את שאריות Wash Buffer A מהשקופיות והוסיפו 40 µL של תמיסת גשושית PLA לכל אחת.כעת דגרו את השקופיות בטמפרטורה של 37 °C בתא לחות שחומם מראש. במשך שעה אחת, הכינו את תמיסת המלאח (ligation mix) מתוך מלאי ה-duo link ligation stock. ראשית, ערבבו את ה-duo link ligation stock במכשיר וורטקס ודללו אותו לריכוז של 1x במים בטוהר גבוה.יש לקחת בחשבון כי אנזים ה-Ligase מתווסף בדילול של 1:40 לתמיסה זו, וכי נדרשים 40 µL מהתערובת לכל באר. לאחר האינקובציה, יש להסיר את תמיסת ה-PLA probe מהשקופיות ולשטוף אותן פעמיים עם Wash Buffer. למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב בתוך צנצנת צימוד (coupling jar) במהלך השטיפה האחרונה, הוצא את ה-Duo link Ligase לבלוק הקפאה ולאחר מכן הוסף אותו לתמיססת הליגציה עד לדילול סופי של 1:40 ובצע Vortex.כעת יש להסיר את נפח השאריות של Wash Buffer A מהשקופיות ולהוסיף 40 µL מתערובת הליגציה. ערבבו עם האנזים בכל פעם בנפרד. דגרו את השקופיות בתא לחות שחומם מראש למשך 30 דקות.הפשיר את מלאי ההגברה של DUO link בטמפרטורה של 37 °C והכן את שלב ההגברה במהלך הדגירה על ידי דילול של מלאי ההגברה של DUO Link במים בדרגת טוהר גבוהה לדילול של 1x. שמור על הרכיבים הרחק מאור מכיוון שהם רגישים לאור. עם סיום שלב הליגציה, הרף את התמיסה ושטוף את השקופיות פעמיים עם Wash Buffer A למשך שתי דקות כל פעם בטמפרטורת החדר תוך כדי ערבוב בכלי שטיפה. במהלך השטיפה האחרונה, הוסף duo link polymerase לתמיססת ההגברה לדילול סופי של 1:280 וערבב במערבל Vortex. לאחר הרפף של בופר השטיפה, הוסף 40 µL מתערובת ההגברה לכל באר והדגר את השקופיות בתא לחות חשוך שחומם מראש למשך 100 דקות בטמפרטורה של 37 °C.בסיום דגירת ההגברה, שפכו את תמיסת הפולימראז מהשקופיות ושטפו אותן בבuffer Wash B פעמיים למשך 10 דקות לכל שטיפה, כאשר השקופיות במצב אנכי בתוך צנצנת צימוד; השתדלו להרחיק את השקופיות מהאור במהלך שלב זה כיוון שהריאגנטים רגישים לאור. לאחר שני השטיפות, טבלו את השקופיות ב-0.1 פעמים Wash buffer B. כעת הסירו לחלוטין את הסיליקון מהשקופית בעלת 16 הבארות, ולאחר מכן הוסיפו כ-40 µL מה-duo.הוסף מדיום קיבוע עם dappy לזכוכית כיסוי והנח אותה בעדינות מעל הדגימות, תוך לחיצה קלה כדי למנוע היווצרות בועות אוויר תחת זכוכית הכיסוי; קבע ואטום את זכוכית הכיסוי על גבי הפסית באמצעות לכה לציפורניים, והמתן לפחות 15 דקות לפני הדימוג. אלו הן תמונות קונפוקאליות של תאים שטופלו ב-2 µM dorsa morphine, מעכב של מסלול ה-BMP, או טופלו ב-25 ng/mL BMP four למשך 60 דקות.נוגדנים נגד Phospho Smad 1 58 ו-Smad four שימשו לזיהוי קומפלקסי smad הפעילים ונראים כנקודות אדומות. גרעיני התאים נצבעו בכחול באמצעות dpi. אותי ה-PLA נספרו באמצעות תוכנת DUO link image tool, והמספר הממוצע של נקודות בגרעין לכל תא מוצג בגרף.לא נצפתה צביעה כאשר כל אחד מהנוגדנים הראשוניים שימש לבדו, מה שמעיד על היעדר רקע של גששי ה-PLA וליגציה עוקבת של האוליגונוקלאוטידים. באופן דומה, לא זוהו נקודות בבקרה שלילית נוספת ללא שני הנוגדנים הראשוניים. ב-SDS page immuno blotting של תאי neuro two A נחשפו phospho related SMAD 1 5 8 בתאים לא מטופלים ובתאים שטופלו ב-BMP.עם זאת, רמות ה-phospho smad פחתו באופן ניכר בתאים שטופלו ב-dorsal morphine. הנוגדן נגד PCNA משמש כבקרת טעינה (loading control). לאחר צפייה בסרטון זה, תגבירו את הבנתכם לגבי אופן ביצוע השלבים וההגדרות שאנו מציעים כדי להגיע לתוצאות בתוך פחות משש שעות לאחר קיבוע התאים.לסיכום, השלבים הם חסימה, דגירה של נוגדן ראשוני, דגירה של probed PLA, הגברה באמצעות ליגציה, קיבוע והדמיה.

detection-signaling-effector-complexes-downstream-bmp4-using-situ-pla

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מתאר את בדיקת קשירת הקרבה כדי לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון באתרן בתאי נמטודה. הקרבה של החלבונים המעניינים יוצרת את תבנית הדנ"א המעגלית בעזרת גשושית PLA המחוברת לנוגדן משני. הגשושית מוגברת עוד יותר באמצעות תמיסת ההגברה, המייצרת DNA חד גדילי ארוך ואחריו הכלאה של הגשושית הגלאי, המאפשרת לוקליזציה של אינטראקציות חלבון-חלבון בתאים.

בדיקת קשירת קרבה ללימוד אינטראקציות חלבון-חלבון באתרו

סרטון זה מדגים את ההדמיה של אינטראקציות חלבון-חלבון בצומת העצבי-שרירי Drosophila (NMJ) באמצעות בדיקת קשירת קרבה (PLA). לאחר בידוד דפנות הגוף, חלבונים המקיימים אינטראקציה נבדקים עם נוגדנים ראשוניים ונוגדנים משניים מצומדים PLA. הקרבה של החלבונים האינטראקטיביים מקלה על קשירת בדיקות עם אוליגונוקלאוטידים מחברים, ויוצרים DNA מעגלי, אשר מוגבר לאחר מכן על ידי הגברת מעגל מתגלגל. בדיקות פלואורסצנטיות נקשרות ל-DNA המוגבר, ומאפשרות הדמיה של אינטראקציות חלבון-חלבון ב-NMJ.

איתור אינטראקציות חלבון-חלבון בזחלי דרוזופילה באמצעות בדיקת קשירת קרבה

פרוטוקול זה מדגים כיצד סמיכות קשירת Assay יכול לשמש כדי לזהות באינטראקציות חלבון-חלבון אתרו בצומת העצבית-שרירית זחל תסיסנית. בעזרת טכניקה זו, שאו טאי גדול והו-לי דיסקים מוצגים בצורה מורכבת באזור postsynaptic, עמותה זוהתה בעבר באמצעות שיתוף immunoprecipitation.

זיהוי של באתר מכלולי חלבון-חלבון ב דרוזופילה הזחל Neuromuscular צומת שימוש סמיכות קשירת Assay

כאן, אנו מתארים הליך לחזות ולכמת עם רגישות גבוהה האינטראקציות אנדוגני בין הרטיקולום ואת המיטוכונדריה endoplasmic בתאים קבוע. הפרוטוקול כולל אופטימיזציה assay קשירת הקרבה באתרו מיקוד אינוסיטול 1,4,5-אדנוזין קולטן / גלוקוז מוסדר חלבון 75 / ערוץ אניון תלוי מתח / cyclophilin D מורכבים על ממשק הקרום קשור המיטוכונדריה.

לחקר endoplasmic reticulum ואת המיטוכונדריה אינטראקציות על ידי<em&gt; באתרו</em&gt; Assay קשירת הסמיכות בתאים קבועים

הנה, הוא הוכיח כיצד באתרו Proximity Ligation Assay (PLA) ניתן להשתמש כדי לזהות ולחזות אינטראקציות חלבונים ישיר חלבון בין כספומט p53 בתרביות תאים ההשעיה חשופים ללחץ genotoxic.

איתור ויזואליזציה של DNA הנזק- Induced חלבון קומפלקסים ההשעיה תא תרבויות באמצעות Assay קשירת הקרבה

כתב יד זה מתאר את הפרוטוקול לטיהור ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה זיקה (BiCAP). שיטה חדשנית זו מקלה על ספציפיות בידוד ואפיון פרוטיאומיה מבנית במורד הזרם של כל שני חלבונים אינטראקציה, בעוד למעט האו ם-ומורכבת חלבונים בודדים, כמו גם מתחמי הקים עם שותפים איגוד מתחרות.

ויבתר חלבון רב מתחמי איתות על ידי טיהור זיקה קומפלמנטציה ריאקציה דו-מולקולרית (BiCAP)

כאן, אנו מראים כיצד להשתמש Assay מצדו קרבה (PLA) כדי להמחיש את MST1/MST2 heterodimerization בתאים קבוע עם רגישות גבוהה.

זיהוי של Heterodimerization של חלבון איזופורמים שימוש בחיי עיר הקרבה מצדו Assay

Cognate J-דומיין חלבונים לשתף פעולה עם המלווה Hsp70 לסייע במגוון של תהליכים ביולוגיים החל קיפול חלבון להשפלה. כאן, אנו מתארים את הקירבה באתרו בתוך הסמיכות, אשר מאפשר את הניטור של המלווה האלה בmachineries בלתי מלווה בחיידקים, שמרים ובתאי אדם.

במעקב באתרו של הרכבות מולקולרית הוקמה באמצעות מכלולים בחיידקים, שמרים, ותאים אנושיים

פרוטוקול זה מדגים את השימוש בסדר הקירבה הצמוד כדי לבדוק את האינטראקציות של חלבון חלבון באתרו בתוך C. אלגיה germline.

באיתור באתרו של האסיפה המורכבת של ריבונאופאנפרוטאין ב -C. אלגיה germline באמצעות שיטת הסמיכות

כאן, אנו מקימים פרוטוקול כדי לדמיין ולנתח בו זמנית מתחמי SMAD מרובים באמצעות בדיקת קשירת קרבה (PLA) בתאי אנדותל החשופים לתנאי לחץ גזיר נוזלים פתולוגיים ופיזיולוגיים.

הדמיה וכימות של TGFβ/BMP/SMAD איתות בתנאי לחץ שונים של גיסת נוזלים באמצעות קרבה-קשירה-אסאי

כאשר שינוי גורם גדילה ß חלבונים מבשר המשפחה באים לידי ביטוי חוץ רחמי בעוברים קסנופוס laevis, הם עמעם, לקבל מבקעים ומופרשים לתוך blastocoele, אשר מתחיל בפיצוץ מאוחר לשלב gastrula מוקדם. אנו מתארים שיטה לשאיפה של מוצרי מחשוף מחלל הפיצוץ לניתוח אימונובלוט.

ניתוח של שינוי גורם גדילה ß מוצרי מחשוף משפחתי מופרש לתוך Blastocoele של קסנופוס laevis עוברים

למדו לדמיין ולכמת איתות BMP בתאי תרבית באמצעות שיטת PLA. השיטה מאפשרת זיהוי מורכבים פעילים של SMAD ו-SMAD4 בזמן אמת, ומסייעת בחקר דינמיקת איתות בתאים חיים ובאבחון מחלות קשורות.

איתור של מפעיל איתות, מתחמי Downstream של BMP4 שימוש באתרו PLA, Assay קשירת הסמיכות

גלה סרטונים נוספים