דור של צמחים Composite ב Medicago truncatula המשמש מבחני Nodulation

שלום, שמי אוליבר יו ממרכז מדעי הצמחים של וגן. היום נראה לכם כיצד להפיק צמחים טרנסגניים באמצעות Agrobacterium tumefaciens. טכניקה זו הובאה למרכז וגן על ידי ד"ר כריס טיילור, שנמצא כיום באוניברסיטת אוהיו סטייט.

מספר מחברי הקבוצה שלי בעבר שיפרו את הטכניקות הללו לאורך השנים, וכיום חברי הקבוצה הנוכחיים שלי, Dr.Stone ו-Mao, הכינו את הסרטון הזה כדי להדגים כיצד מפיקים Harry Root Composite Plans. Agrobacterium ZOS דומים מאוד ל-agrobacterium tumor fis בכך שהם מחדירים DNA זר לצמחים, אך ZOS יכולים להשרות יצירה מוגברת של שורשים ברקמות מסוג wild type, ובכך ליצור צמחים קומפוזיטיים כמו זה. לכן, בצמחים אלו, חלק מהשורשים הם טרנסגניים בעוד שהנביטות הן עדיין wild tap.

לפיכך, טכנולוגיה זו לא תייצר זרעים טרנסגניים. עם זאת, קיימים שלושה יתרונות מרכזיים לצמחים בעלי שורשים עביבים ההופכים טכנולוגיה זו לשימושית מאוד. ראשית, מיני צמחים רבים, ובמיוחד מיני דו-פסיות, ניתנים לטרנספורמציה באמצעות אגרובקטריה.

שנית, אין צורך להקים תרבית רקמות לפני הטרנספורמציה. ניתן להשתמש בחלקים רבים של הצמחים, כגון נבטים, נשירים ו-co, כדי לייצר צמחים campy באופן ישיר. ולבסוף, ניתן להשיג רקמת שורש טרנסגנית בתוך מספר שבועות.

עבור העברה גנטית של פולי סויה ומדיקה (medic), ניתן לקבל שורשים טרנסגניים תוך שלשה שבועות בלבד, מהר יותר מהעברה בשיטת OPIS. באופן כללי, טכנולוגיית השורשים המטופלים (root cyte) היא כלי שימושי מאוד לחקר תפקודי גנים ופנוטיפים הקשורים לשורשים. שלום, שמי הוא אונג.

שלום, שמי הוא, וזה הצלם שלי ביל. היום נציג את הפרוטוקול של Harry root Composite Plant. כן, אנו משתמשים בפרוטוקול זה במספר פרויקטים שלנו.

כבר התחלנו, כן. עבור הדגמה זו, נשתמש ב-meta cargo Tula כדוגמה. אלו הן תרמילים בוגרים של meta cargo.

הניחו את התרמילים על תיבת טחינה וטחנו אותם בתנועה ארוכה ונחושה. הפרידו את הזרעים מהתרמילים על ידי ניעור עדין והעבירו את הזרעים למבחנת צנטריפוגה של 50 milliliter. לאחר מכן, הוסיפו חמישה milliliters של חומצה גופרית רכז.

צריבה בזהירות רבה. התהליך אורך כ-10 דקות. יש לבצע וורטקס (Vortex) לשפופרת פעמיים עד שלוש פעמים.

במהלך הטיפול בחומצה, צבע מעטפת הזרעים ישתנה לצהוב. הסירו את חומצה הגופרית מהמבחנה ושטפו את הזרעים לפחות חמש פעמים במים סטריליים. השריגו את הזרעים במים דה-יוניים בטמפרטורת החדר למשך שש שעות, ולאחר מכן שמרו אותם בטמפרטורה של 4 °C למשך יומיים.

כדי לסנכרן את הנבטה. פזרו 20 עד 30 זרעים על נייר סינון לח בתוך צלחת פטרי. לאחר חמישה עד שישה ימים, העבירו את קישורי הזרעים לאדמה ולאחר מכן גדלו אותם בחממה במשך ארבעה שבועות.

עבור טרנספורמציה של צמחים מורכבים, אנו משתמשים בדרך כלל בזן האגרובקטריום Zony K 5 99. ניתן להעביר את וקטור המעבר (shuttle vector) או את הוקטור הבינארי ל-K 5 99 בהתאם לפרוטוקול הטרנספורמציה הסטנדרטי של agrobacterium tumor facit. יש להקרין את האגרובקטריום ולגדלו בטמפרטורה של 30 °C למשך 16 עד 24 שעות. לאחר תקופת הגדילה, יש לאסוף את התאים על ידי העברת תמיסת התרבית למבחנה לצנטריפוגה בנפח של 50 ml.

סובב את הדגימה בצנטריפוגה ב-5,000 G למשך 30 דקות. השהה מחדש את המשקע בתמיסת הזנה נטולת חנקן. ודא שדילול תאי ה-agrobacterium הוא ל-0.3 ב-OD 600.

ריכוז זה חשוב להשגת טרנספורמציה מקסימלית. אנו משתמשים בקיר סלע כמטריצה תומכת. שימוש בחומר זה חשוב להשגת תדר טרנספורמציה גבוה.

גזרו את דופן הסלע לגודל המתאים. פקק. חוררו חור בחלק העליון בקוטר של כמעל סנטימטר וחצי עד שני סנטימטרים. בעזרת טיפ של פיפטה, הוסיפו חמישה מיליליטרים של תמיסת Resuspended Agrobacterium Zony לכל פקק.

בחרו קטע גבעול עם שתי עד שלוש ניצנים היליאריים ובצעו חיתוך אלכסוני. הכניסו את קטעי הצמח לחור בדופן הסלע. הניחו את הצמחים החתוכים בתא גידול או על שולחן מעבדה למשך שלושה שבועות.

הוסיפו חמישה מיליליטר של תמיסת הזנה לכל תבנית מדי 10 ימים. לאחר שלושה שבועות, השורשים יתחדשו מהצד החתוך. השרו את הצמח במים.

הסירה בזהירות את דופן הסלע הרכה והקפד לא לפגוע בשורשים. ודא כי כל דופן הסלע הוסרה. ניתן להעביר את צמחי השורש השעיר המורכבים לחול או לפרליט. עבור ניסויי סימביוזה, גדל את ה-rhizobium במצע yeast extract manito למשך שבעה ימים ב-30 °C.

אספו את תאי ה-zoia Resus. סספנדו את המשקע בתמיסת הזנה נטולת חנקן. דללו את התמיסה עד ל-0.08 ב-OD 600.

הוסיפו 10 milliliters של תמיסת ZOA לכל תרבית צמחים משולבת, והמתינו שבועיים עד שלושה שבועות נוספים כדי לאפשר את היווצרות הפקעות. הסירו את החול מהצמחים המשולבים על ידי עקירה ושטיפה שלהם. השתמשו בביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק כדי לבדוק את השורש הטרנסגני.

עבור ביצוע פעולה זו תשתמשו במיקרוסקופ פלואורסצנטי. לכל מבני השורשים השעירים שלנו יש קסטת GFP קונסטיטיבית לסריקת קווים טרנסגניים. תמונה זו מציגה צמחים מורכבים בעלי שורשים שעירים טרנסגניים ל-GFP שנצפו במיקרוסקופ פלואורסצנטי.

ניתן להבחין בקלות בין השורשים הטרנסגניים, בעלי הפלואורסצנציה הירוקה והבהירה יותר, לבין השורשים שאינם טרנסגניים. בקשרי שורשים (Nodules) נוצרים בשורש השעיר של הצמחים המרוכבים. להלן הפרוטוקול המלא.

שוב, יצירת צמחים מורכבים בעלי שורשים שיעריים היא שיטה מהירה ופשוטה להשגת כמויות גדולות של רקמה טרנסגנית, במיוחד עבור מיני diop. למרות ששיטה זו אינה מאפשרת קבלת זרעים טרנסגניים, היא יכולה להפיק חומר טרנסגני תוך שבועות ספורים. היא מתאימה במיוחד לצמחים שבהם קיימים קשיי הקמה של תרביית רקמה והטרנספורמציה.

במהלך השנים, השתמשנו בטכנולוגיה זו כדי לחקור תפקודי גנים, תפקודי פרומוטורים, microRNAs, התפתחות שורשים ושורשים צדדיים, תגובה למגננה ולעקה אנטיביוטית, קשרינג ותהליכים סימביוטיים אחרים. חקרנו תגובה הורמונלית, פרופיל מטבולי, פרופיל גנים ואנליזה פרוטאומיקה באמצעות צמחים מורכבים של שורשים עליונים. אנו מקווים שסרטון זה יעזור לכם להתאים מערכת זו למין המועדף עליכם.

אתם מוזמנים ליצור איתנו קשר לשאלות הקשורות לטכנולוגיה זו, ובהצלחה.