Name: דור של צמחים Composite ב Medicago truncatula המשמש מבחני Nodulation (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 37 s
Description: למד לייצר צמחי שורש שעיר composite ב-Medicago truncatula לחקר אינטראקציות צמח-ריזוביום ותהליכי נודולציה. שיטה זו מאפשרת ייצור מהיר של רקמת שורש טרנסגנית ללא צורך בתרבת רקמות מסורתית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר כריס טיילור (אוהיו סטייט) מציגה טכנולוגיה שורש שעיר למעבדה שלנו, בני הזוג. Senthil סבראמאניאן (דרום דקוטה סטייט), ג&#39;אנג חואן (Ludong אוניברסיטת שנדונג בסין) כדי לשפר את הפרוטוקול. כמו כן, אנו מבקשים להודות לד&quot;ר האו נג (נאנג&#39;ינג החקלאות באוניברסיטה) עבור מסייע ביצירת הווידאו הזאת. עבודה זו נתמך בחלקו על ידי מענקי DOE (DE-SC0001295), NSF (MCB-0923779) ו USDA (2010-65116-20514) אל OY

פרוטוקול הבאים נעשה שימוש כדי ליצור צמחים שורש שעיר מורכב קטניות מודל מינים מ truncatula. פרוטוקולים דומים הותאמו לפחות שמונה מיני צמחים 1-4. השתמשנו מ צמחים truncatula שורש שעיר מרוכבים ללמוד פונקציות גנים שורש ופיתוח גולה. הפרוטוקול היה מופרד לארבעה חלקים: 1) חומרי plant בהכנת; 2) יצירת צמחים שורש שעיר מרוכבים: 3) הסימביוטי זיהום Rhizobia, ו 4) זיהוי שורש מהונדס. השתמשנו וקטור בינארי המכיל גן ירוק ניאון (GFP) חלבון ככתב להקרנה שורש מהונדס בצמחים מורכבים 3. בהשוואה מבחר אנטיביוטיקה מבוססת, GFP מבוססי ההקרנה היא מהירה, קלה וזולה. ב לבנות שלנו, ER-ביטוי ממוטב את הגן GFP הוא מונע על ידי האמרגן היוביקוויטין סופר, אשר חזקה אותות ה-GFP מכונן שורשי מהונדס, המאפשר הבחנה קלה בין השורשים מהונדס ולא מהונדס. 1. הכנת חומרים Plant <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מ 'זרעים truncautla נקצרים מצמחים הגדלים בחממה (לחות יחסית 50%, 16 / 8 שעות אור / חושך, 22/18 ° C יום / לילה טמפרטורה). זרעים מבוגרים ניתן לאחסן 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ -100 זרעים הם התחוח של 10 מ"ל חומצה גופרתית מרוכזת (95-98%, סיגמא אולדריץ, MO) במשך 10 דקות עם רעד תקופתיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרעים הם שטופים 5-7 פעמים עם מים סטריליים עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרעים הם ספוג אז בטמפרטורת החדר במים במשך 6 שעות וכל הזמן על 4 מעלות צלזיוס למשך 36-48 שעות כדי לסנכרן נביטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 20-30 זרעים מפוזרים על ניירות מסנן לחות להציב בצלחת פטרי. הם שמרו על 22 מעלות צלזיוס, עם 16 / 8 שעות אור / חושך מחזור, ו 40 μmol.m -2. S -1 עוצמת האור, עבור 5-6 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שתילים מונבטים מועברים לתוך האדמה והניח בחממה במשך חודש. </li></ol> 2. יצירת צמחים שעירים שורש מרוכב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בונה בינארי נושאים גנים של עניין הפכו א rhizogenes באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים. יש לנו מהונדסים קבוצה של וקטורים בינארי המכיל את הגן GFP כסמן המאפשרים הקרנת רקמות מהונדס. וקטורים אלו מכילים מקדמי שונים ולכולם יש שיבוט Gateway אתרים (Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה) לביטוי מעל או השתקה של גנים ממוקד 3,5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Rhizogenes א 'בתרבית בינוני 50 מ"ל LB עם מבחר אנטיביוטי מתאים בגיל 28 מעלות צלזיוס במשך 16-24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיידקים נאספים מחדש מושעה לריכוז סופי של OD 600 = 0.3 פתרון ללא חנקן מזין הצמח (טבלה 1 ו 6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לתמוך התחדשות שורש שעיר, מטריצה ​​תמיכה מעוקר ("צמר סלעים", Hummert הבינלאומי, כדור הארץ סיטי, מיזורי) הוא חתך לתוך התקעים של כ 3 ס"מ 3. אנחנו מקום 4 plugs לתוך צלחת פטרי אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החור הוא שירבב על גבי תקע כל משתמש קצה פיפטה כדי להקל על הכניסה של explants א. rhizogenes (5 מ"ל) הוא הוסיף לחבר כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קטע לירות עם 2-3 בלוטות בבית השחי הוא נכרת על ידי חתך אלכסוני. Explant מוכנס מכן לתוך התקע, גדל ב 22 מעלות צלזיוס למשך כשלושה שבועות. אנחנו שומרים explants Medicago ללא השקיה עבור 10 הימים הראשונים, ולאחר מכן, מים להם פתרון 5 מ"ל חנקן חופשי בעת הצורך. מצאנו כי הסרת meristem apical עשוי להפחית את היווצרות שורשים adventitious. </li></ol> 3. הסימביוטי Rhizobia (Sinorhizobium Meliloti) זיהום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שלושה שבועות, כמה שורשים adventitious תצא מן צמר הסלע. צמחים שורש שעיר מרוכבים מועברים חול או vermiculite (עיקור), עם או בלי צמר הסלע. הם גדלו בחממה ב 22 ° C, 16 / 8 שעות אור / חושך מחזור, ו 300 μmol.m -2. S -1 עוצמת האור למשך שבוע נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני rhizobia זיהום, ש meliloti 1201 הוא בתרבית תמצית שמרים, מניטול 50 מ"ל בינוני למשך 7 ימים ב 30 מעלות צלזיוס (לוח 2, 6,7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-מושעה תאים rhizobia הם מדולל לריכוז סופי של OD 600 = 0.08 באמצעות פתרון חופשי חנקן תזונה. ההשעיה של 10 מ"ל טרי של ס meliloti היה מוחל על כל צמח מורכב לגרום להיווצרות גולה. </li></ol> 4. זיהוי שורש טראנסגנטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבועיים לאחר rhizobia חיסון, הצמחים הם מורכבים עד מושרשת על ידי שטיפה במים. שורשיה ניתן להפריד בקלות במים מן החולות או perlite. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנחנו שמים את השורשים שעיר תחת מיקרוסקופ-UV (ניקון SMZ1500, עירור 460-500nm, 505nm dichroic, הגדר יותר 510nm). שורשי מהונדס GFP הם חיוביים שורשי adventitious GFP הם שליליים. לאחר מכן, אנו אוספים את השורשים accordinז אות ה-GFP, ולספור את המספרים גולה, למדוד את אורך שורש, ולחשב צפיפות שורש לרוחב. שורשי ה-GFP שלילי משמשים שליטה. </li></ol> 5. נציג תוצאות בניסוי שלנו, את שורשי השיער החדש מחדש מתוך explants ב 2-3 שבועות לאחר A. rhizogenes innoculation. תחת מיקרוסקופ-UV, שורשים מהונדס נושאת את הגן GFP להראות חזק פלואורסצנטי ירוק (איור 1). כמות השורשים מחדש את החלק של ה-GFP השורשים חיובית תלוי בתנאי explants והסביבה צמיחה ממוצע של plants.On מרוכבים, 25% את השורשים הפיק היו שורשים שעירים מהונדס 3. כדי להגביר את יעילות הטרנספורמציה, 1) אבדון כיסוי פלסטיק, כפי שמוצג על הוידאו, זה מספיק כדי לשמור על לחות במגש הצמיחה בימים הראשונים, וצמחים רק דורשים מעט מים בימים הראשונים. השקיית יתר הוא מזיק היווצרות שורש שעיר; 2) את ריכוז innoculant Agrobacterium חשוב לשינוי. כמות מוגזמת של תאים לא מועילים היווצרות שורש שעיר או היווצרות גולה. ליצירת גולה, הפתרון צריך להיות להשקות חנקן חופשי, אחרת, מעט גושים יהוו. צמחים שורש שעיר מורכב יכול להיווצר באמצעות cotyledons או שתילים entact כחומר המוצא. רק שינויים קלים של הפרוטוקול הנ"ל ncessary ליצור שורשים שעירים מרקמות אחרות 8. חשוב לציין, כל שורש שעיר הוא אירוע שינוי עצמאית. לכן, פנוטיפים שנצפתה נטמון מרוכבים הם סכום של אירועים transforamtion כמה צריכה להיות מאושרת על ידי חזרות בצמחים מורכב מרובים <img src="/files/ftp_upload/2633/2633fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. א השורשים טראנסגנטי ניתן למיין מתוך שורשים שעירים. גושים ב נוצרו הצמחים שורש שעיר מרוכבים. הנחנו 4 שבועות בת מ צמחים truncatula שורש שעיר תחת מיקרוסקופ-UV ואת השורשים GFP חיובית ניתן לזהות בקלות. (החץ האדום: שורש GFP, חץ צהוב: אי - GFP שורש) <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מניות </td><td> g/200ml </td><td> מניות מ"ל / ליטר </td></tr><tr><td> MgSO 4 0.7 H 2 O </td><td> 12.3 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> CaCl 2 .2 H 2 O </td><td> 14.7 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 0.3 H 2 O </td><td> 6.8 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> K 2 SO 4 </td><td> 11 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> פה Cl 3 0.6 H 2 O </td><td> 0.49 </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Micronutrients </td><td> ראה להלן </td><td> 1 </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> Micronutrients </td><td> גרם לליטר </td></tr><tr><td> H 3 BO 3 </td><td> 0.142 </td></tr><tr><td> MnSO 4. H 2 O </td><td> 0.077 </td></tr><tr><td> ZnSO 4 0.7 H 2 O </td><td> .1725 </td></tr><tr><td> CuSO 4 .5 H 2 O </td><td> 0.037 </td></tr><tr><td> NaMoO 4. H 2 O </td><td> 0.024 </td></tr><tr><td> CoCl 2. H 2 O </td><td> .0025 </td></tr><tr><td> NiSO 4 </td><td> 0.001 </td></tr></tbody></table> 1. טבלת Nitogen ללא תזונה פתרון <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> K 2 HPO4 </td><td> 0.5g </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 0.1g </td></tr><tr><td> MgSO 4 ° 7H 2 O </td><td> 0.2g </td></tr><tr><td> תמצית שמרים </td><td> 0.4g </td></tr><tr><td> Mannitol </td><td> 10g </td></tr><tr><td> pH = 6.8 </td><td></td></tr></tbody></table> טבלה 2. שמרים תמצית בינוני מניטול (לליטר)

<ol><li>Limpens, E., Ramos, J., Franken, C., Raz, V., Compaan, B., Franssen, H., Bisseling, T., Geurts, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+in+Agrobacterium+rhizogenes-transformed+roots+of+Arabidopsis+and+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">RNA interference in Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula.</a> J. Exp. Bot. 55, 983-992 (2004).</li>
<li>Collier, R., Fuchs, B., Walter, N., Kevin, L. W., Taylor, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vitro+composite+plants%3A+an+inexpensive%2C+rapid+method+for+root+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Ex vitro composite plants: an inexpensive, rapid method for root biology.</a> Plant J. 43, 449-457 (2005).</li>
<li>Zhang, J., Subramanian, S., Stacey, G., Yu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavones+and+flavonols+play+distinct+critical+roles+during+nodulation+of+Medicago+truncatula+by+Sinorhizobium+meliloti%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Flavones and flavonols play distinct critical roles during nodulation of Medicago truncatula by Sinorhizobium meliloti.</a> Plant J. 57, 171-183 (2009).</li>
<li>Boisson-Dernier, A., Chabaud, M., Garcia, F., Becard, G., Rosenberg, C., Barker, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-rhizogenes-transformed+roots+of+Medicago+truncatula+for+the+study+of+nitrogen-fixing+and+endomycorrhizal+symbiotic+associations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant-Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations.</a> Mol. Plant-Microbe Interact. 14, 695-700 (2001).</li>
<li>Zhang, J., Subramanian, S., Zhang, Y., Yu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavone+synthases+from+Medicago+truncatula+are+flavanone-2-hydroxylases+and+are+important+for+nodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Flavone synthases from Medicago truncatula are flavanone-2-hydroxylases and are important for nodulation.</a> Plant Physiol. 144, 741-751 Forthcoming.</li>
<li>Subramanian, S., Hu, X., Lu, G., Odelland, J., Yu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promoters+of+two+isoflavone+synthase+genes+respond+differentially+to+nodulation+and+defense+signals+in+transgenic+soybean+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The promoters of two isoflavone synthase genes respond differentially to nodulation and defense signals in transgenic soybean roots.</a> Plant Mol Biol. 54, 623-639 (2004).</li>
<li>Vincent, J. A manual for the practical study of root nodule bacteria International Biological Program Handbook. , Blackwell Science Ltd. Oxford. 1-13 (1970).</li>
<li>Subramanian, S., Graham, M. Y., Yu, O., Graham, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Interference+of+Soybean+Isoflavone+Synthase+Genes+Leads+to+Silencing+in+Tissues+Distal+to+the+Transformation+Site+and+to+Enhanced+Susceptibility+to+Phytophthora+sojae%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">RNA Interference of Soybean Isoflavone Synthase Genes Leads to Silencing in Tissues Distal to the Transformation Site and to Enhanced Susceptibility to Phytophthora sojae.</a> Plant Physiol. 137, 1345-1353 (2005).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

יצירת plant שורש שעיר מרוכבים היא שיטה קלה ומהירה להשיג כמויות גדולות של חומר מהונדס עבור מינים רבים dicot. אמנם שיטה זו לא יכולה לייצר זרעים מהונדס, הוא יכול לייצר חומרים מהונדס בעוד כמה שבועות. השיטה מתאימה במיוחד עבור הצמחים מתקשים להקים תרביות רקמה או יצירת transformants יציב. במהלך השנים, יש לנו השתמשו בטכנולוגיה זו כדי ללמוד פונקציות גן, פונקציות האמרגן, רנ&quot;א, שורש ופיתוח שורש לרוחב, הגנה ותגובות אביוטי מתח, nodulation תהליכים סימביוטיים אחרים, התגובות הורמון, פרופיל מטבולי, פרופיל גנטי, ניתוח proteomic, ו תהליכים ביולוגיים אחרים. פרוטוקול איתנה לשכפול.

דור של צמחים composite ב medicago truncatula המשמש מבחני nodulation

Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays

בדומה tumerfaciens Agrobacterium, rhizogenes Agrobacterium יכול להעביר DNAs זרים לתוך בתאי צמח על בסיס אוטונומי שורש וישכנע (הר&quot;י) פלסמיד א. rhizogenes יכול לגרום להיווצרות שורש שעיר על רקמות הצמח צורה צמחים מורכבים לאחר השינוי. על הצמחים האלה מורכבים, כמה שורשים מחדש הם מהונדס, נושאת את סוג בר T-DNA ואת וקטור בינארי מהונדסים, בעוד יורה עדיין לא מהונדס, המשמש על מנת לספק אנרגיה לתמוך בצמיחה. אלו צמחים שורש שעיר מרוכבים לא ייצרו זרעים מהונדס, אך יש מספר תכונות חשובות ההופכות את הצמחים האלה מורכב מאוד שימושי מחקר הצמח. ראשית, עם מגוון רחב מארח, א rhizogenes יכול להפוך מיני צמחים רבים, במיוחד dicots, המאפשר הנדסה גנטית במגוון רחב של מינים. שנית, א rhizogenes להדביק רקמות explants ישירות; לא בתרביות רקמה לפני השינוי הוא הכרחי כדי להשיג צמחים מורכבים, מה שהופך אותם אידיאליים עבור הפיכת מיני הצמחים הסוררים. יתר על כן, רקמות השורש מהונדס יכול להיווצר בתוך כמה שבועות. עבור Medicago truncatula, אנחנו יכולים להשיג שורשים מהונדס ב קצר ככל שלושה שבועות, מהר יותר מאשר שינוי נורמלי לטבול פרחים ארבידופסיס. בסך הכל, שורש שעיר המשולב בטכנולוגיה הצמח כלי תכליתי ושימושי ללמוד פונקציות גנים הקשורים שורש-פנוטיפים. כאן אנו מדגימים כיצד צמחים שורש שעיר המשולב יכול לשמש כדי ללמוד צמחים rhizobium אינטראקציות nodulation ב קשות להפוך מינים מ truncatula.

אנו מדגימים כיצד צמחים שורש שעיר המשולב יכול לשמש כדי ללמוד צמחים rhizobium אינטראקציות nodulation ב קשות להפוך מינים<em&gt; Medicago truncatula</em&gt;.

דור של צמחים Composite ב Medicago truncatula המשמש מבחני Nodulation

בדומה ל-Agrobacterium tumefaciens, החיידק Agrobacterium rhizogenes מסוגל להעביר DNA זר לתאי צמח בהתבסס על פלסמיד ה-Ri (autonomous root-inducing)...

שלום, שמי אוליבר יו ממרכז מדעי הצמחים של וגן. היום נראה לכם כיצד להפיק צמחים טרנסגניים באמצעות Agrobacterium tumefaciens. טכניקה זו הובאה למרכז וגן על ידי ד"ר כריס טיילור, שנמצא כיום באוניברסיטת אוהיו סטייט.מספר מחברי הקבוצה שלי בעבר שיפרו את הטכניקות הללו לאורך השנים, וכיום חברי הקבוצה הנוכחיים שלי, Dr.Stone ו-Mao, הכינו את הסרטון הזה כדי להדגים כיצד מפיקים Harry Root Composite Plans. Agrobacterium ZOS דומים מאוד ל-agrobacterium tumor fis בכך שהם מחדירים DNA זר לצמחים, אך ZOS יכולים להשרות יצירה מוגברת של שורשים ברקמות מסוג wild type, ובכך ליצור צמחים קומפוזיטיים כמו זה. לכן, בצמחים אלו, חלק מהשורשים הם טרנסגניים בעוד שהנביטות הן עדיין wild tap.לפיכך, טכנולוגיה זו לא תייצר זרעים טרנסגניים. עם זאת, קיימים שלושה יתרונות מרכזיים לצמחים בעלי שורשים עביבים ההופכים טכנולוגיה זו לשימושית מאוד. ראשית, מיני צמחים רבים, ובמיוחד מיני דו-פסיות, ניתנים לטרנספורמציה באמצעות אגרובקטריה.שנית, אין צורך להקים תרבית רקמות לפני הטרנספורמציה. ניתן להשתמש בחלקים רבים של הצמחים, כגון נבטים, נשירים ו-co, כדי לייצר צמחים campy באופן ישיר. ולבסוף, ניתן להשיג רקמת שורש טרנסגנית בתוך מספר שבועות.עבור העברה גנטית של פולי סויה ומדיקה (medic), ניתן לקבל שורשים טרנסגניים תוך שלשה שבועות בלבד, מהר יותר מהעברה בשיטת OPIS. באופן כללי, טכנולוגיית השורשים המטופלים (root cyte) היא כלי שימושי מאוד לחקר תפקודי גנים ופנוטיפים הקשורים לשורשים. שלום, שמי הוא אונג.שלום, שמי הוא, וזה הצלם שלי ביל. היום נציג את הפרוטוקול של Harry root Composite Plant. כן, אנו משתמשים בפרוטוקול זה במספר פרויקטים שלנו.כבר התחלנו, כן. עבור הדגמה זו, נשתמש ב-meta cargo Tula כדוגמה. אלו הן תרמילים בוגרים של meta cargo.הניחו את התרמילים על תיבת טחינה וטחנו אותם בתנועה ארוכה ונחושה. הפרידו את הזרעים מהתרמילים על ידי ניעור עדין והעבירו את הזרעים למבחנת צנטריפוגה של 50 milliliter. לאחר מכן, הוסיפו חמישה milliliters של חומצה גופרית רכז.צריבה בזהירות רבה. התהליך אורך כ-10 דקות. יש לבצע וורטקס (Vortex) לשפופרת פעמיים עד שלוש פעמים.במהלך הטיפול בחומצה, צבע מעטפת הזרעים ישתנה לצהוב. הסירו את חומצה הגופרית מהמבחנה ושטפו את הזרעים לפחות חמש פעמים במים סטריליים. השריגו את הזרעים במים דה-יוניים בטמפרטורת החדר למשך שש שעות, ולאחר מכן שמרו אותם בטמפרטורה של 4 °C למשך יומיים.כדי לסנכרן את הנבטה. פזרו 20 עד 30 זרעים על נייר סינון לח בתוך צלחת פטרי. לאחר חמישה עד שישה ימים, העבירו את קישורי הזרעים לאדמה ולאחר מכן גדלו אותם בחממה במשך ארבעה שבועות.עבור טרנספורמציה של צמחים מורכבים, אנו משתמשים בדרך כלל בזן האגרובקטריום Zony K 5 99. ניתן להעביר את וקטור המעבר (shuttle vector) או את הוקטור הבינארי ל-K 5 99 בהתאם לפרוטוקול הטרנספורמציה הסטנדרטי של agrobacterium tumor facit. יש להקרין את האגרובקטריום ולגדלו בטמפרטורה של 30 °C למשך 16 עד 24 שעות. לאחר תקופת הגדילה, יש לאסוף את התאים על ידי העברת תמיסת התרבית למבחנה לצנטריפוגה בנפח של 50 ml.סובב את הדגימה בצנטריפוגה ב-5,000 G למשך 30 דקות. השהה מחדש את המשקע בתמיסת הזנה נטולת חנקן. ודא שדילול תאי ה-agrobacterium הוא ל-0.3 ב-OD 600.ריכוז זה חשוב להשגת טרנספורמציה מקסימלית. אנו משתמשים בקיר סלע כמטריצה תומכת. שימוש בחומר זה חשוב להשגת תדר טרנספורמציה גבוה.גזרו את דופן הסלע לגודל המתאים. פקק. חוררו חור בחלק העליון בקוטר של כמעל סנטימטר וחצי עד שני סנטימטרים. בעזרת טיפ של פיפטה, הוסיפו חמישה מיליליטרים של תמיסת Resuspended Agrobacterium Zony לכל פקק.בחרו קטע גבעול עם שתי עד שלוש ניצנים היליאריים ובצעו חיתוך אלכסוני. הכניסו את קטעי הצמח לחור בדופן הסלע. הניחו את הצמחים החתוכים בתא גידול או על שולחן מעבדה למשך שלושה שבועות.הוסיפו חמישה מיליליטר של תמיסת הזנה לכל תבנית מדי 10 ימים. לאחר שלושה שבועות, השורשים יתחדשו מהצד החתוך. השרו את הצמח במים.הסירה בזהירות את דופן הסלע הרכה והקפד לא לפגוע בשורשים. ודא כי כל דופן הסלע הוסרה. ניתן להעביר את צמחי השורש השעיר המורכבים לחול או לפרליט. עבור ניסויי סימביוזה, גדל את ה-rhizobium במצע yeast extract manito למשך שבעה ימים ב-30 °C.אספו את תאי ה-zoia Resus. סספנדו את המשקע בתמיסת הזנה נטולת חנקן. דללו את התמיסה עד ל-0.08 ב-OD 600.הוסיפו 10 milliliters של תמיסת ZOA לכל תרבית צמחים משולבת, והמתינו שבועיים עד שלושה שבועות נוספים כדי לאפשר את היווצרות הפקעות. הסירו את החול מהצמחים המשולבים על ידי עקירה ושטיפה שלהם. השתמשו בביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק כדי לבדוק את השורש הטרנסגני.עבור ביצוע פעולה זו תשתמשו במיקרוסקופ פלואורסצנטי. לכל מבני השורשים השעירים שלנו יש קסטת GFP קונסטיטיבית לסריקת קווים טרנסגניים. תמונה זו מציגה צמחים מורכבים בעלי שורשים שעירים טרנסגניים ל-GFP שנצפו במיקרוסקופ פלואורסצנטי.ניתן להבחין בקלות בין השורשים הטרנסגניים, בעלי הפלואורסצנציה הירוקה והבהירה יותר, לבין השורשים שאינם טרנסגניים. בקשרי שורשים (Nodules) נוצרים בשורש השעיר של הצמחים המרוכבים. להלן הפרוטוקול המלא.שוב, יצירת צמחים מורכבים בעלי שורשים שיעריים היא שיטה מהירה ופשוטה להשגת כמויות גדולות של רקמה טרנסגנית, במיוחד עבור מיני diop. למרות ששיטה זו אינה מאפשרת קבלת זרעים טרנסגניים, היא יכולה להפיק חומר טרנסגני תוך שבועות ספורים. היא מתאימה במיוחד לצמחים שבהם קיימים קשיי הקמה של תרביית רקמה והטרנספורמציה.במהלך השנים, השתמשנו בטכנולוגיה זו כדי לחקור תפקודי גנים, תפקודי פרומוטורים, microRNAs, התפתחות שורשים ושורשים צדדיים, תגובה למגננה ולעקה אנטיביוטית, קשרינג ותהליכים סימביוטיים אחרים. חקרנו תגובה הורמונלית, פרופיל מטבולי, פרופיל גנים ואנליזה פרוטאומיקה באמצעות צמחים מורכבים של שורשים עליונים. אנו מקווים שסרטון זה יעזור לכם להתאים מערכת זו למין המועדף עליכם.אתם מוזמנים ליצור איתנו קשר לשאלות הקשורות לטכנולוגיה זו, ובהצלחה.

generation-composite-plants-medicago-truncatula-used-for-nodulation

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מוות מבוססי תא assay עבור PTI בצמחים ניקוטיאנה benthamiana מתואר.

Assay עבור תבנית הפתוגן-Associated מולקולרית (PAMP)-שהופעלו חסינות (PTI) בצמחים

שתי שיטות שונות על צמחים מסך עם השורש קושר את נמטודות מתוארים. הגישות שתוארו כוללות תפוקה גבוהה מסכים עם נמטודות באופן הורסות להקל על השימוש בצמחים אלה בתוכניות רבייה.

קצב העברה גבוה ונמוך מסכים עם השורש קושר את נמטודות Meloidogyne spp.</em

צמיחה של צמחי truncatula Medicago בסימביוזה עם meliloti Sinorhizobium חיידקי חנקן כמו במיקרוקוסמוס הבודד, סטרילית עשויים מצלחות מעבדה סטנדרטיות מאפשרת בדיקה תכופה של מערכת שורשים וגושים בלי להתפשר על סטריליות. יכולים להישמר צמחים בתאי גידול אלה לתקופה של עד 9 שבועות.

Single-צמח, סטרילי מיקרוקוסמוס לNodulation וצמיחה של צמח הקטניות<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; עם סימביונט Rhizobial<em&gt; Sinorhizobium meliloti</em

המטרה היא להמחיש שניתן להשתמש בקלות במודל הקטניות Medicago truncatula כדי לחקור את הוויסות של עובריות צמחים מוקדמות כדי להשלים את מודל ה-Arabidopsis שאינו קטניות. מורפולוגיה של תרמילים קשורה לשלבי אמבריוגנזה זיגוטית ומסופק גם פרוטוקול לאיסוף עוברים באמצעות תרבית רקמה.

פרוטוקולים לקבלת Zygotic וסומטי עוברים ללימוד תקנה של פיתוח העובר מוקדם בקטניות הדגם<em&gt; Medicago truncatula</em

ניתוח ביטוי יזם מכריעים לשיפור ההבנה של הכונה וביטוי ייתכן היעד גנים. במסמך זה אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות, לבודד לשבט מקדם הצמח. עוד יותר, אנו מתארים את האפיון של האמרגן גולה ספציפיים שורשים שעירים שעועית נפוצות.

מי קולחין יזם: זיהוי ואפיון של השורש גולה יזם ספציפי בתוך השעועית נפוצות

פרוטוקול זה מספק צעדים ניסיוני ומידע אודות ריאגנטים, ציוד וכלים לניתוח לחוקרים המעוניינים בביצוע ניתוח הגנום כולו מבוסס על מערך השוואתי גנומית הכלאה (CGH) של עותק מספר וריאציות צמחים.

מבוסס על מערך השוואתי גנומית הכלאה פלטפורמה יעילה לזיהוי של עותק מספר וריאציות במוטציות מהר ניוטרון-induced אספסת truncatula

הביטוי heterologous ארעי של אנזימים biosynthetic הוחלף נגזר benthamiana טבק העלים להסיט אספקה אנדוגני של 2, 3-oxidosqualene לעבר הייצור של מוצרים בעלי ערך גבוה טריטרפן חדשים. בזאת הוא תיאר נוהל מפורט לייצור מיכשור וציוד בקנה מידה מהירה (5 ימים) של triterpenes, תחליפי ניצול פלטפורמה חזקה זו מבוססת על צמחים.

ארעי ביטוי טבק Benthamiana משאיר לייצור טריטרפן בקנה מידה מפוח

נייר זה מתאר שתי שיטות לכמת את התגובות ההגנה באריידאופזיס thaliana בעקבות החשיפה elicitors החיסונית: פרץ חמצוני חולף, ואת עיכוב צמיחת שתיל.

תבנית-המופעל חמצוני ושתיל עיכוב הצמיחה שתילה Assays באריידרופסיס thaliana

Parasponia andersonii הוא עץ טרופי בצמיחה מהירה השייכת משפחת קנאביס (הקנאביים) והוא יכול ליצור חנקן לתקן גושים שורש בשיתוף עם ריזוזוביום. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור ניתוחים גנטיים הפוכה P. אנדרסונב מבוסס על Agrobacterium tumefaciens-מתווכת יציבה שינוי מבוסס Crispr/Cas9 מבוססי הגנום עריכה.

שינוי צורה, הגנום עריכת ופנוהקלדת החנקן-תיקון טרופי קנאביציים עץ Parasponia אנדרסונii

כאן, אנו מספקים את הפרוטוקול המפורט של שיטת טרנספורמציה חד-שלבית בתיווך Agrobacterium tumefaciens לייצור צמחים מרוכבים.

שיטה יעילה וניתנת לשחזור לייצור צמחים מרוכבים על ידי טרנספורמציית שורשים שעירים מבוססי קנה שורש אגרובקטריום

למד לייצר צמחי שורש שעיר composite ב-Medicago truncatula לחקר אינטראקציות צמח-ריזוביום ותהליכי נודולציה. שיטה זו מאפשרת ייצור מהיר של רקמת שורש טרנסגנית ללא צורך בתרבת רקמות מסורתית.

דור של צמחים Composite ב Medicago truncatula המשמש מבחני Nodulation

גלה סרטונים נוספים