Name: בידוד תסיסנית melanogaster האשכים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 13 s
Description: למדו לבודד אשכים מזכרי Drosophila melanogaster בני 0-3 ימים באמצעות מחטי ניתוח ו-PBS קר תחת מיקרוסקופ. שיטה זו מאפשרת בידוד מהיר לניתוחי RNA, חלבונים וצביעה אימונופלואורסצנטית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים ואסיה Vagin מציגה את הטכניקה הזו למעבדה שלנו.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך מיקרוסקופ זכוכית שקופית עם רקע שחור: חותכים נייר לבן 20 # לגודל זהה שקופיות מיקרוסקופ. צבע אחד בצד של שחור שקופיות בגודל הנייר באמצעות סמן קבע (למשל, לנוכל). החל דבק לבן (של אלמר) לצד שחור לדבוק הנייר לשקופית. השקופית ניתן לעשות שימוש חוזר. שימוש ¾ "הקלטת תווית (Fisherbrand), לאבטח את השקופית מיקרוסקופ, זכוכית בצד למעלה, אל משטח CO 2 לטוס כדי לתקן את זה במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף 0-3 הישן יום זבובים זכרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דלי קרח, פוספט שנאגרו מלוחים (PBS), מחטים לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטשטש 50-100 זבובים באמצעות זרם של CO 2 ולהעביר אותם מבקבוק או בקבוקון לרפד את לטוס ליד המגלשה מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה ~ 50 μl קר כקרח PBS לירידה באמצע שקופיות מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להרים זבוב זכר עם הניתוחים מחט לטבול את איזמל המנתחים לתוך PBS, מגע עדין הצד הגחוני (כלומר, ליד הכנפיים) של הזבוב עם מחט ולמקם אותו לתוך ירידה של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום אחד המחט על לטוס באמצע, בין החזה ועל הבטן, דוחף בחוזקה כלפי מטה. מניחים את המחט אחרים בין השישית (A6) והשביעית (A7) קטעים בטן (הפסים השני והשלישי מלמטה); למשוך את הבטן מן החזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקניט את האשכים מלבד איברים אחרים, במיוחד במעיים. במיוחד מוטנטים לבן, האשכים והבטן נראים דומים. ההבדלים העיקריים הם כי האשכים תמיד באים בזוגות; אשך אחד יש דפוס ספירלה והוא לבן בצבעו יותר במעיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את האשכים ב קר כקרח PBS בצינור microcentrifuge פוליפרופילן. </li></ol> נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/2641/2641fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. להציג הגבי של מערכת הרבייה של הגבר, החל flybase.org/reports/FBim0000074.html. Flybase ייחוס:... "אחרי 38 איור בעמוד 508 של מילר (1950) ע 'מילר אנטומיה היסטולוגיה פנימיים של Imago של תסיסנית melanogaster ב מ Demerec, עורך, ביולוגיה של תסיסנית, פרק 6, עמודים 420 - 534. Cold Spring Harbor Laboratory לחץ, מהדורת פקסימיליה, 1994. זכויות יוצרים 1994 על ידי Cold Spring Harbor Laboratory לחץ. השימוש נעשה ברשות סוג של Cold Spring Harbor Laboratory (CSHL) לעיתונות. ראה <a href="http://www.cshlpress.com">http://www.cshlpress.com</a> ".

<ol><li>Singh, S. R., Hou, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistological+Techniques+for+Studying+the+Drosophila+Male+Germline+Stem+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunohistological Techniques for Studying the Drosophila Male Germline Stem Cell.</a> Methods Mol Biol. 450, 45-59 (2008).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

אנו מספקים פרוטוקול לבודד את האשכים של הזכר הבוגר תסיסנית melanogaster. בגלל הטכניקה דורשת תיאום two אחד ידיים, מיומנות באה רק עם תרגול.

<table><tbody><tr><td>מחט דיסקציה</td><td>כלי</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17346</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ, רגילות </td><td>כלי</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-553</td><td></td></tr><tr><td>תאורת מיקרוסקופ</td><td>כלי</td><td>Schott AG</td><td>KO-1500</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; פד (רפידה)</td><td>כלי</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-172</td><td></td></tr><tr><td>מערכת Flowbuddy Complete לשולחן המעבדה</td><td>כלי</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-122WCU</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר לחות בבעבוע</td><td>כלי</td><td>Salter Labs</td><td>7100</td><td></td></tr><tr><td>מחט למילוי כדורים</td><td>כלי</td><td>Genesee Scientific</td><td>54-119</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#190;&amp;#8221; סרט סימון</td><td>אספקה</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-901-5B</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד תסיסנית melanogaster האשכים

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

האשכים של תסיסנית melanogaster לספק מודל חשוב ללימוד תחזוקה בתאי גזע והתמיינות, המיוזה, וכן סומה-germline אינטראקציות. האשכים הם מבודדים בדרך כלל 0-3 ימים לאחר eclosion ממקרה גלמי מן הזכרים הבוגרים. האשכים של wild-type זבובים נבדלים בקלות ברקמות אחרות, כי הם צהובים, אבל האשכים של זבובים מוטנטים לבן, רקע גנטי משותף ניסויי מעבדה דומים בצורת וגם צבע במעיים לעוף. ביצוע לנתיחה בשקופית מיקרוסקופ זכוכית עם רקע שחור עושה זיהוי האשכים הרבה יותר קל. האשכים יוסרו מן הזבובים באמצעות מחטים לנתח. לעומת פרוטוקולים להשתמש במלקחיים לנתיחה האשכים, השיטה שלנו היא הרבה יותר מהר, מה שמאפשר לאדם מיומן לנתח האשכים 200-300 wild-type זבובים לשעה, מניב 400-600 האשכים. האשכים של זבובים לבן או מוטציות כי להקטין את גודל האשכים קשה יותר לנתח ובדרך כלל תשואה 200-400 האשכים לשעה.

תסיסנית האשכים melanogaster ניתן במהירות וביעילות מבודדים מן הזכרים הבוגרים באמצעות מחטים לנתח. בעזרת תרגול, ניתן לבודד בקלות בתוך יום או יומיים סכום של האשכים מספיק לניתוח DNA או RNA על ידי רצף תפוקה גבוהה יותר או מסורתי או בשיטות הביולוגיה המולקולרית של חלבון עבור מבחני נוגדנים או אנזים מבוססות.

אשכי *Drosophila melanogaster* מהווים מודל חשוב לחקר התחזוקה וההדDifferentiation (הבחנה) של תאי גזע, למיוזה, ולממשק בין התאים הסומטיים לתאי הנבט...

המטרה הכללית של הליך זה היא לבודד אשכים מזכרי דרוזופילה (*Drosophila melanogaster*) בני אפס עד שלושה ימים. הדבר מבוצע על ידי הרדמת זבובים זכרים ודיסקציה של אשכיהם בטיפה של PBS קר תחת מיקרוסקופ, תוך שימוש בשתי מחטי דיסקציה כדי להפריד את בטן הזבוב מהחזה שלו.לבסוף, הפר את האשכים משאר הרקמה ואסוף אותם לשימוש במגוון טכניקות אנליטיות כגון אימונופלורסצנציה, צביעה, או בידוד RNA וחלבון כולל. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן זיהוי האשכים המופרדים עשוי להיות קשה ללמידה מכיוון שהם קשים להבחנה מהמעי. את הפרוצדורה תדגים shemei ma, טכנאית מהמעבדה שלי.ראשית, הכינו דלי קרח, מחטי ניתוח וכ-100 milliliters של phosphate buffered saline. הניחו את ה-PBS בדלי הקרח להתקררות. הכינו זכוכית מיקרוסקופ עם רקע שחור על ידי גזירת נייר לבן במשקל 20 פאונד כך שיתאים לגודל הזכוכית.לאחר מכן, צבעו צד אחד בשחור. בעזרת טוש פרמננטי, הדביקו את הנייר במקומו על השקף והדביקו את השקף למסכת ה-CO2. תחת מיקרוסקופ דיססקציה, הרדימו בקבוק של זבובים בני 0 עד 3 ימים באמצעות זרם של CO2 ורוקנו אותם על המסכה.בסביבת זכוכית העמדה של המיקרוסקופ, זהו זבובים זכרים לפי וווי הזיווג כהים הצבע האופייניים להם, וטפטפו באמצעות פיפטה כ-50 µL של PBS קר מהקרח אל מרכז זכוכית העמדה ליצירת טיפה. אספו זבוב זכר על ידי טבילת מחט דיסקציה בטיפת ה-PBS ונקיעה עדינה בצדו הגחוני של הזבוב, כך שיידבק למחט.הניחו את הזבוב בטיפת PBS ולחצו בחוזקה עם מחט אחת בין החזה לבטן של הזבוב. לחצו עם המחט השנייה בין פלחים 6 ו-7 של הבטן, ולאחר מכן משכו את הבטן הרחק מהחזה. הפרידו את האשכים משאר האיברים, ובמיוחד מהמעי, שעלול להיראות דומה, כדי לסייע בהבחנה בין האשכים לבין המעי.זכרו כי האשכים מופיעים תמיד בזוגות, בעלי צורה ספירלית אופיינית והם לבנים יותר מרקמת המעי. אספו את האשכים לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה המכילה PBS קר מאוד ושמרו אותם על קרח, שם ניתן להחזיק אותם למשך מספר שעות. ברגע שהתהליך נלמד, ניתן להבדיל זבוב אחד בפחות מדקה אחת לפי פרוטוקול זה.ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון ריצוף עמוק של RNA משתיק קטן או microRNAs, על מנת לענות על שאלות נוספות, כגון כיצד משתנה רפרטואר ה-RNAs בזבוב מוטנטי מסוים?

isolation-of-drosophila-melanogaster-testes

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מתאר את הדיסקציה של בלוטות האביזרים מזבובים זכרים ומציג דוגמה שבה הבלוטה המבודדת תנותק לתרחיף של תא יחיד.

דרוזופילה דיסקציה של בלוטת האביזר הגברי: שיטה לבידוד תאים משניים

סרטון זה מתאר את האנטומיה הכללית של שחלה דרוזופילה וכולל שיטה לניתוח שחלות לצורך הדמיה חיה או קבועה.

דרוזופילה מלנוגסטר דיסקציה שחלתית: טכניקה להכנת רקמות Ex Vivo

סרטון זה מתאר את בלוטת טבעת דרוזופילה, מבנה אנדוקריני מורכב החשוב לביוסינתזה ולהפרשת אקדיסטרואידים והורמונים אחרים. הפרוטוקול המוצג מדגים את הדיסקציה, הקיבוע והחיסון.

דיסקציה של בלוטת טבעת הזחל: בידוד איברים אנדוקריניים התפתחותיים מדרוזופילה

בידוד בשלב מסוים של זקיקי דרוזופילה האמצע עד סוף שימושי למגוון מטרות. זקיקים כזה מתפתחים בתרבות, המאפשרת למניפולציות גנטיות ו / או תרופתיות כדי להיות יחד עם מבחני חוץ גופיית פיתוח והדמיה לחיות. בנוסף, זקיקים יכולים לשמש למחקרים מולקולריים, כגון בידוד mRNA וחלבון.

השירות של שלב ספציפי אמצע לסוף<em&gt; דרוזופילה</em&gt; בידוד זקיק

שיטות לבידוד והכנת דגימות דרוזופילה אשכים (לחיות וקבוע) להדמיה על ידי שלב בניגוד ומיקרוסקופ פלואורסצנטי מתוארים במסמך זה.

ניתוח ציטולוגית של תאי זרע: הכנות בשידור חי והקבועות של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אשכים

פרוטוקול זה מתאר את הנתיחה והטיפוח של אשכים שלמים וציסטות בקו הנבט מגלמים של Drosophila melanogaster. שיטה זו מאפשרת תצפית מיקרוסקופית על זרע הזרע ex vivo. יתר על כן, אנו מתארים בדיקה פרמקולוגית של השפעת המעכבים על שלבים ספציפיים של התפתחות תאי נבט באשכים גולמים.

אקס תרבות Vivo של דרוזופילה גלמי אשך וציסטות נבט אונליין רווק בן: Dissection, הדמיה, ותרופתי טיפול

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתק ולמיין אוכלוסיית תאים מסוימת של בלוטות אביזר זכר Drosophila ילה (תאים משניים) עבור רצפי RNA ו-RT-qpcr. בידוד התא מושגת באמצעות הטיהור של FACS של התאים המשניים של GFP-ביטוי לאחר תהליך מרובה שלב-דיסוציאציה המחייב ניתוח, העיכול הפרוטסיס ופיזור מכני.

פרוטוקול מבוסס FACS כדי לבודד RNA מן התאים המשניים של דרוזוהילה בלוטות אביזר זכר

שלמות מכשול הדם במוח. היא קריטית לתפקוד מערכת העצבים בדרוזופילה מלאנוסטר, מכשול המוח בדם נוצר על ידי תאי גלאל במהלך הembryogenesis המאוחרות. פרוטוקול זה מתאר שיטות לטיפול בתפקוד ותחזוקה של מחסומי מוח בדם בד. מלאנוגסטר עוברים והזחלים השלישי.

שיטת שלמות המוח בדם בדרוזופילה מלאנוסטר

המטרה של פרוטוקול זה היא לנתח את חלוקת התא ברקמה שלמה על ידי מיקרוסקופ התאים החיים והקבוע באמצעות דרוסוילה מיוטיק מאיוציטים. הפרוטוקול מדגים כיצד לבודד את כל האשכים שלמים, מזחלים מדרוזופילה ומהגלמים המוקדמים, וכיצד לעבד ולטעון אותם למיקרוסקופיה.

הכנת מדרוזופילה זחל ופופל אשכים לניתוח חטיבת תאים בשידור חי, רקמה שלמה

אנו מציגים כאן פרוטוקול משופר להכנה וחיסון של כל ההר של אשכי דרוזופילה, מתאים למיקרוסקופיה קונפוקלית וגם מאפשר תיוג ניתן לשחזור ואמין. אנו ממחישים פרוטוקול זה על ידי ייצוג תלת מימדי וכימות של ניסויי קולוקליזציה על זרעונים S4-S5 גדולים.

חיסון של אשכי דרוזופילה הר שלם לניתוח קונפוקלי תלת מימדי של זרעונים גדולים

הפרוטוקול מתאר שיטת פלואורסצנטיזציה רגישה לפולימורפיזמים בודדים של נוקלאוטידים בודדים (SNP-FISH) כדי להבחין בין תעתיקי RNA ריבוזומליים שמקורם בלוקוס ה-DNA הריבוזומלי של כרומוזום X או Y  ב-Drosophila melanogaster.

זיהוי FISH רגיש לפולימורפיזם נוקלאוטידי יחיד של שעתוק RNA ריבוזומלי ספציפי ללוקוס ב-Drosophila melanogaster

למדו לבודד אשכים מזכרי Drosophila melanogaster בני 0-3 ימים באמצעות מחטי ניתוח ו-PBS קר תחת מיקרוסקופ. שיטה זו מאפשרת בידוד מהיר לניתוחי RNA, חלבונים וצביעה אימונופלואורסצנטית.

בידוד תסיסנית melanogaster האשכים

גלה סרטונים נוספים