הנדסה ביולוגית המבוססת דם שתלי שימוש bioreactor pulsatile
14 ביוני 2011
הקבוצה שלנו פיתחה תרבות bioreactor מערכת המחקה את מדגיש pulsatile פיזיולוגיות של מערכת הלב וכלי הדם להתחדש מושתלת בקוטר קטן שתלי כלי דם.
המטרה הכללית של הליך זה היא להנדס שתלי כלי דם מבוססי ביולוגיה באמצעות מערכת ביו-ראקטור פולסטילית. דבר זה מושג על ידי הכנת פיגום ביודגרדבילי מרשת PGA שבה יגדלו התאים, והרכבתם בתא ביו-ראקטור. לאחר מכן מזריעים את הפיגומים בתאי שריר חלק, ומכסה עם אטמים לצינורות אוויר והזנה אוטם את תא הביו-ראקטור.
לאחר מכן, הביוראקטור מחובר למערכת זרימה כדי לספק זרימה פועמת לכלי הדם בביוראקטור. בתוך הריאקטור, התאים גדלים לכלי דם העוברים בדיקות אימונוכימיות, ביוכימיות ומכניות. להשלכות של טכניקה זו יש פוטנציאל לטיפול במחלת עורקים כליליים, שכן טכניקה זו מהווה גישה מבטיחה לחידוש שתלי כלי דם בעובים קטנים להשתלה לצורך מעקף עורקי.
למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות בתחום ההנדסה של כלי דם, ניתן להחיל אותה על מערכות איברים אחרות החשופות לכוחות פיזיולוגיים מחזוריים. באופן כללי, מי שאינו מכיר את השיטה יתקשה בביצועה. נדרש תרגול רב כדי לשלוט במיומנויות באופן מלא.
הרעיון לגישה זו עלה תחילה כאשר הבנו את החשיבות של הפעלת גרייה מכנית פיזיולוגית לשיקום מבנים הנדסיים. הדגמה ויזואלית של שיטה זו היא קריטית, שכן תהליכי התפעול של הביוראקטור קשים ללמידה עקב ריבוי השלבים, וניתן לרכוש אותם רק באמצעות הדגמה מפורטת. לתחילת העבודה, השתמש במים מזוקקים כדי לנקות קטעים באורך 30 centimeter של צינור סיליקון בעל קוטר פנימי של three millimeter, והשאר אותם לייבוש באוויר.
השתמשו במספריים כדי לגזור חלק של 1.1 סנטימטר על שמונה סנטימטרים מרשת PGA עבור כל קטע צינור. באמצעות המוסטט, הצמידו את רשת ה-PGA לצינור באמצעות תפר Dexon 6.0, קשרו שלושה קשרים כירורגיים והמשיכו בתפרים בודדים עם המוסטט; הרשת המאובטחת מהווה פיגום PGA. שטפו את הפיגומים תחילה על ידי טבילה בנתרן הידרוקסיד בריכוז 1 molar למשך אחת עד שתיים דקות, ולאחר מכן בביצוע שלוש טבילות במים מזוקקים למשך שתי דקות לכל טבילה. ייבשו אותם בטפיחות בין השטיפות והניחו להם להתייבש באוויר בתוך מ 빠르게 למשך 15 דקות לאחר השטיפה השלישית.
לאחר הייבוש, תפרו שרוול Dacron באורך של סנטימטר אחד לכל קצה של הרשת באמצעות שלוש תפרים. השאירו חפיפה של שני עד שלושה מילימטרים של הפיתול והימנעו מניקור הפיתול. הקפידו להשאיר כ-15 סנטימטרים של חוט תפירה חופשי לשימוש מאוחר יותר בפרוטוקול זה.
כל רכיבי המבאר (bioreactor) והכלים עוברים עיקור באוטוקלאב מראש. ביום שלפני תחילת התרבית במבאר, יש להרכיב חלקית את המבאר ולהטbil את רכיבי המבאר - הפיגומים (scaffolds), רשת סיליקון, הכלים הכירורגיים וחוט דק שיהיה ארוך יותר מאורך המבאר - באמבט אתנול 70% למשך 30 דקות לפחות. השתמשו בחוט כדי להשחיל את צינור הסיליקון דרך הזרועות הצדדיות של המבאר.
כעת הוצא את הביוריאקטור והצמד את פיגומים ה-PGA בתוכו על ידי הידוק טבעות ה-Dacron מעל שפתי הזכוכית המורחבות. השתמש בחוט התפירה העודף כדי לקשור כל טבעה. לאחר מכן, באמצעות מחברים, חבר את צינור הסיליקון בצד אחד של הפיגום לזוג אחד של זרועות הביוריאקטור, וחבר את הצינור בצד השני של הפיגום לשתי הזרועות האחרות.
לאחר התקנת המחברים, משוך אותם מהזרועות הצדדיות ושטוף את הביוראקטור באתנול. השאר את הר актуаקטור להשריה למשך 10 דקות בכל צד. הנח את הביוראקטור על צלחות פטרי ושטוף אותו בתמיסת תרבית רקמות.
שטפו את המים. בעזרת פלפוט, הקפידו לשטוף גם את הרשת ואת הפצצות. כעת, הניחו מגנט ערבוב סטרילי בתוך הריאקטור לשימוש עתידי, ויבשו את המכשיר למשך לילה בתוך המנדף כאשר המפוח פועל וה-UV כבוי מעתה ואילך.
אין להתרכוע מעל הכור, שכן הדבר עלול להוביל לזיהום. במהלך ההכנה, יש לנגב את כל המחברים עם אלכוהול עד לניקיונם. לפני החיבורים, רבים מהחיבורים מחוזקים בפרפורם, אותו יש להשרות ב-70% ethanol לפני היישום. לכן, יש להכין כמות מספקת של שניהם.
כאמצעי זהירות, הנח צלחת פטרי סטרילית מעל כל פתח של הביוריאקטור כדי להגן על פיגום ה-PGA שבתוכו מפני מזהמים. כעת התחל את ההכנה על ידי חיבור פתח ההזרקה לזרוע השלישית שאינה בשימוש בביוריאקטור. לאחר מכן, חבר את שקיות ה-IV למערכת הזרימה.
בעזרת סט צינורות walrus, קשרו את הקצה הכחול קרוב ככל האפשר לצומת ה-Y והדקיפו את הצינור. חברו את הצינור האדום לקצה הרחוק של שקית ה-IV. לאחר מכן, חברו את הצינור הלבן לצד אחד של מערכת הזרימה.
הכנס ברז עצירה תלת-כיווני למערכת הזרימה. חבר קצה אחד של צינור מתמר הלחץ לברז העצירה וחבר את הקצה השני לפתח המרכזי של שקית ה-IV. כעת, כדי למלא חלקית את מערכת הזרימה ולבדוק דליפות, הוסף 350 milliliters של PBS ו-1% fungi zone לשקית ה-IV.
באמצעות מזרק של 60 milliliter לפני או אחרי חיבורו למערכת הזרימה, כוון את הברז (stopcock) כדי לשלוט בכיוון זרימת ה-PBS ולחץ את השקית כדי לשטוף את המערכת. ניתן לבצע שלב זה לפני או אחרי קיבוע התאים. כעת ניתן לקבע את התאים בביוריאקטור.
בדוגמה זו, השעו 8 מיליון תאי SM, המהווים כ-T 75 קונפלואנטית אחת, ב-1.25 מיליליטר של מצע, וטפטפו אותם באופן אחיד על פיגום ה-PGA, מצומת Dacron לצומת Dacron. לאחר הוספת התאים, נגבו את שולי הביוראקטור בעזרת אלכוהול. הימנעו מהשתהות מעל הריאקטור.
בשלב הבא, הרכיבו בזהירות את מכסה פקק הסיליקון. ודאו שחלקו התחתון של המכסה אינו נחשף בעת הוצאתו משקית האוטוקלאב או במהלך כל אחד משלבי החיבור הבאים. ראשית, חברו את פתח ההזרקה לצינור ההזנה במחבר הזכר.
שנית, הצמידו מסנני PTFE של 0.20 מיקרון לכל אחד משלושת פתחי האוורור. שלישית, אטמו את פתח ההזרקה. הכניסו את מכסה פקק הסיליקון המורכב לתוך הביוראקטור מזכוכית.
וודאו שצינור ההזנה אינו נוגע לפיגומים מסוג PGA שהוצבו. לאחר מכן, אטמו באמצעות פאראפילם. כעת חברו את הביוריאקטור למערכת הזרימה והניחו את הביוריאקטור ומערכת הזרימה בתוך אינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius.
במשך 25 עד 30 דקות, יש להניח את הכור על צדו ולסובב אותו בכל חמש דקות. לאחר מכן, בעודו בתוך האינקובטור, מלאו את תא הביוריאקטור ב-400 milliliters של מצע גידול מסוג four to 10 באמצעות משאבה דרך צינור הזנה. כעת דגרו את הפיגומים המיושבים ללא שאיבה פולסטילית למשך שישה עד שבעה ימים ב-37 °C עם 5% carbon dioxide.
אין צורך בהחלפת מצע או בהשלמת ויטמין C במהלך זמן זה. לפני הפעלת המשאבה, יש לבדוק את הצינורות לאיתור דליפות או כיפופים. לאחר מכן, יש לכוונן את קצב המהירות של המשאבה כדי לשמור על טווח לחצים שבין 30- ל-270 millimeters of mercury. יש לנטר ולשמור על לחץ זה מדי יום לאורך כל תקופת התרביות.
יש לבצע החלפות מצע ותוספת של חומצה אסקורבית פעמיים בשבוע בזמן שהפיגום גדל תחת שאיבה פולסטילית להזנת מצע טרי; ראשית, חברו את פתח ההזרקה ואת מסנן ה-PTFE אל מכסאי ההזנה לצורך החלפת המצע ופינוי הפסולת של המצע. לאחר מכן, מקמו את צינור ההזנה בחוזקה במשאבה הדו-כיוונית והכניסו קצה אחד לפתח ההזנה של הביוראקטור ואת הקצה השני למכסאי ההזנה. כעת, התחילו לשאוב לאט 200 milliliters של מצע.
ניתן להעלות בהדרגה את מהירות המשאבה. לאחר מכן, חברו צינור הזנה חד והתחילו לשאוב לאט 200 milliliters של מצע טרי. כדי להוסיף חומצה אסקורבית למכור, הסירו 25 milliliters של מצע באמצעות מזרק סטרילי בנפח 30 milliliters.
הוסיפו חמישה מיליליטרים של תמיסת חומצה אסקורבית סטרילית ולאחר מכן החזירו את ה-25 מיליליטרים. כלי דם מהונדסים ייראו עכורים ויגיעו לעובי דופן של כ-250 מיקרון לאחר שמונה שבועות של תרבית. בתנאים פולסטיליים, צביעת המטוקסילין, אאוזין של כלי דם מהונדסים מראה שינויים במורפולוגיה של הרקמה עם הזמן ועם הפולסציה.
הצד הלומנלי של כלי הדם מסומן ב-L בצביעת Masson's trichrome. עבור קולגן, כלי דם שקיבלו דחפים במשך ארבעה שבועות מראים כמות קולגן רבה יותר מאשר המקבילים להם שלא קיבלו דחפים; חצים לבנים מצביעים על שרידי פגמנטים של PGA בכלי הדם בשבוע 12. ניתוח אימונוכימי מראה את הביטוי של סמן השריר החלק המוקדם alpha actin, סמן השריר החלק הבינוני calponin 1, וסמן השריר החלק המאוחר myosin heavy chain. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בתוך שבעה עד שמונה שעות, במידה והיא מבוצעת כראוי.
בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לבצע את כל השלבים בצורה נקייה וסטרילית ככל האפשר, בהתאם לנוהל זה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון שינוי של הלומן (lumen) של כלי הדם המהונדסים, על מנת לענות על שאלות נוספות, כגון חשיבותו של שינוי פני השטח של הלומן בשמירה על כלי דם מהונדסים במהלך מחקרים in vivo, לאחר פיתוחם.
טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הנדסת הרקמות, ובמיוחד הנדסה כלי דם, לבחון אמצעים פוטנציאליים לטיפול במחלות עורקים כליליים במודלים של בעלי חיים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד להשיג שתלי כלי דם מהונדסים הניתנים להשתלה באמצעות תרבית דינמית לאחר השתלה. אל תשכחו כי עבודה עם נתרן הידרוקסיד עלולה להיות מסוכנת, ויש להשתמש תמיד באמצעי זהירות כגון הגנה על העיניים וחלוק מעבדה בעת ביצוע הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג מערכת גידול בביוראקטור שנועדה לשחזר את המאמצים הפולסטיליים הפיזיולוגיים של מערכת הלב וכלי הדם. המטרה היא להנדס שתלי כלי דם ביולוגיים המתאימים להשתלה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביוטכנולוגיה
- הנדסה קרדיו-וסקולרית
- הנדסת רקמות
רקע
- שתלים כליים הם קריטיים לניתוחי מעקף עורקיים.
- שתלים נוכחיים נכשלים לעיתים קרובות בשל חוסר באינטגרציה ביולוגית.
- מערכות ביו-ריאקטור יכולות לסמל תנאים פיזיולוגיים טבעיים.
- שימוש בפיגומים מתכלים ביולוגית יכול לשפר את גדילת התאים ואת האינטגרציה.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה ליצירת שתלים וסקולריים בעובר קטן.
- שימוש בביוראקטור פולסטילי להבטחת צמיחה והבשלה של תאים.
- הערכה של התכונות המכניות והביוכימיות של השתלים המהונדסים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה של פיגומים מרשת PGA מתכלה.
- זריעה של תאי שריר חלק על הפיגומים.
- הרכבת הפיגומים בתא של ביו-ראקטור.
- יישום זרימה פולסטילית לקידום צמיחת תאים.
תוצאות עיקריות
- תאים התפתחו למבנים כליים תפקודיים בתוך הביוראקטור.
- השתלים ההנדסיים עברו בדיקות אימונוכימיות וביוכימיות.
- התכונות המכניות של השתלים הוערכו בהצלחה.
- טכניקה זו מבטיחה פוטנציאל לטיפול במחלה של עורקי כלי הדם הכליליים.
מסקנות
- מערכת הביוראקטור הפועלת בפעימות תומכת ביעילות בהנדסת שתלי כלי דם.
- פיגומים ביודגרדביליים יכולים לשפר את השילוב ואת התפקוד של השתל.
- גישה זו עשויה להוביל לתוצאות משופרות בניתוחים של מעקפים עורקיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הנדסת שתלי כלי דם בעלי קוטר קטן המתפקדים באופן תקין נותרה אתגר קריטי במחקר ופיתוח קרדיווסקולרי, בשל שיעורי כישלון גבוהים של שתלים סינתטיים. מערכת ביו-ראקטור פולסטילית זו מאפשרת הפחתת סיכונים מכנית על ידי שחזור תנאים כימיים-מכניים פיזיולוגיים, ובכך תומכת בביטחון חזוי לגבי הבשלת השתל והשתלבתו. הפלטפורמה נותנת מענה לרציפות תרגומית משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני, ובכך מפחיתה סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים של פיתוח טיפולים למעקפים עורקיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי מתן אפשרות למחקר מבוקר של השפעות גרייה מכנית על הבשלת רקמות כלי דם.
- ערך תפעולי: מספק מודלים כלי דם הניתנים לשחזור לצורך הבהרת מסלולים ותיקוף מטרות תפקודיות במנגנוני מחלות קרדיווסקולריות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: יוצר מבנים כליים סטנדרטיים המהוכחים היסטולוגית, עם השקעה כמותית של מטריקס חוץ-תאית, המוכנים לסריקת תרכובות.
- ערך תפעולי: תומך בתרבית ניתנת להרחבה של מספר כלי דם תחת תנאים מכניים משתנים בתוך סביבה כימית אחידה, ובכך משפר את הסטנדרטיזציה של הבדיקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מדגים תכונות מכניות הרלוונטיות למחלה המאפשרות השתלה מוצלחת במודלים של בעלי חיים, ובכך מגשר בין שלב הגילוי לרצף פרה-קליני.
- ערך תפעולי: מאפשר מעקב לא פולשני ובזמן אמת אחר עיצוב מחדש של קולגן באמצעות NLOM, ובכך תומך בהערכה אורך (longitudinal assessment) ללא צורך בנקודות סיום טרמינליות.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
הביוראקטור ממוקם בתוך רצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה, דרך זיהוי מובילים (lead identification) ועד לעבודה פרה-קלינית, ובכך הוא מספק פלטפורמה לשימוש חוזר להבשלת שתלים כלי דם תחת תנאים פולסטיליים פיזיולוגיים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות לגבי האופן שבו זרימה פולסטילית מווסתת את הדיפרנציאציה של SMC ואת ייצור ה-ECM בכלי דם מהונדסים.
- סריקה: מספק מבנים וסקולריים המוכנים לבדיקה, עם תכולת קולגן וחוזק מכני מדידים, לצורך הערכה מהימנה של תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשר קריאות ביוכימיות ואימונוכימיות כמותיות (למשל, SMMHC, calponin, alpha-actin) ובדיקות מכניות להשוואת תנאי תרבית.
- מחקר תרגומי: מקשר בין הבשלת כלי דם מהונדסים להצלחת השתלה פרה-קלינית באמצעות תיקוף היסטולוגי ופונקציונלי.
- שימוש חוזר ארגוני: מתאים לקטרי כלי דם של 1 mm עד 3 mm, מה שמאפשר שימוש חוזר בפלטפורמה עבור מטרות וסקולריות מרובות ללא צורך בתכנון מחדש של הביוריאקטור.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון ניבוי בתפקודיות של השתלה וסקולרית באמצעות שחזור של היסטולוגיה ומכניקה דמויות טבעיות.
- ערך תפעולי: הדירות גבוהה ופשטות בהרכבה ובתחזוקה של הביוריאקטור, המפחיתות שונות בתהליכי עבודה של הנדסה וסקולרית.
- ערך אסטרטגי: שיפור קבלת החלטות מסוג go/no-go באמצעות הערכה מוקדמת של השלמות המכנית של ההשתלה, להפחתת כשלים בשלב מאוחר בתוכניות למעקפים עורקיים.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מותאם סיכון של מועמדים להשתלות וסקולריות בהתבסס על ביצועים בתרבית פולסטילית ומדדי שיקוע קולגן.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בהנדסת רקמות סטרילית, הפעלת ביו-ראקטור והיסטולוגיה וסקולרית.
- נדרשות מערכות זרימה פולסטילית, ניטור לחץ ואינקובטורים לתרבית השומרים על 37°C ו-5% CO₂.
- נדרשים פרוטוקולים סטנדרטיים להכנת פיגומים, זריעת תאים והחלפת מצעי גידול כדי להבטיח הדירות בין צוותים.
- כולל שיקולי התאמה לקטרי וסקולריים שונים וחומרים שונים לפיגומים בטווח של 1–3 mm.
- מוגבל על ידי הצורך בסטריליות קפדנית במהלך תרבית שנמשכת מספר שבועות ושלבי טיפול ידני הפגיעים לזיהום.
