הנדסה ביולוגית המבוססת דם שתלי שימוש bioreactor pulsatile

המטרה הכוללת של הליך זה היא להנדס שתלים וסקולריים מבוססי ביולוגית באמצעות מערכת ביו-ריאקטור פועמת. זה מושג על ידי הכנת פיגום מתכלה מרשת PGA שבה התאים יגדלו בשורה והרכבתם בתא ביו-ריאקטור. לאחר מכן יושבים הפיגומים עם תאי שריר חלקים ומכסה עם אוויר וצינור הזנה אוטם את תא הביוריאקטור.

לאחר מכן, הביוריאקטור מחובר למערכת זרימה כדי לספק זרימה פועמת לכלי הדם בביו-ריאקטור. בכור התאים גדלים לכלי דם שעוברים בדיקות אימונוכימיות, ביוכימיות ומכניות. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול במחלת עורקים כליליים מכיוון שטכניקה זו היא גישה מבטיחה לחידוש שתלי כלי דם בקוטר קטן הניתנים להשתלה למעקף עורקים.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הנדסת כלי דם, ניתן ליישם אותה על מערכות איברים אחרות כגון כוחות פיזיולוגיים מחזוריים. בדרך כלל, אדם חדש בשיטה זו יתקשה. תדרוש תרגול רב כדי לשלוט במיומנויות באופן מלא.

הרעיון לגישה זו עלה לנו לראשונה כאשר הבנו את החשיבות של יישום גירוי מכני פיזיולוגי לחידוש מבנים הנדסיים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את תהליך השירה של הביוריאקטור מכיוון שיש שלבים רבים וניתן לרכוש אותם רק באמצעות הדגמה מפורטת. כדי להתחיל, השתמש במים מזוקקים כדי לנקות חלקים באורך 30 ס"מ של צינורות סיליקון בקוטר פנימי של שלושה מילימטר ולאפשר להם להתייבש באוויר.

השתמש במספריים כדי לחתוך קטע של 1.1 סנטימטר על שמונה סנטימטרים של רשת PGA עבור כל פיסת צינור באמצעות המוסטט, כך שרשת ה-PGA לצינור עם תפר Dexon 6.0 קושרת שלושה קשרים כירורגיים ועוקבת אחר תפרים בודדים עם המוסטט, הרשת המאובטחת יוצרת פיגום PGA. שטפו את הפיגומים על ידי טבילתם תחילה בנתרן הידרוקסיד מולרי אחד למשך דקה עד שתיים, ולאחר מכן שלוש טבילות במים מזוקקים למשך שתי דקות לכל טבילה. יבשו אותם בטפיחות בין הכביסות והניחו להם להתייבש באוויר במכסה המנוע למשך 15 דקות לאחר הכביסה השלישית.

לאחר הייבוש, תפר אזיקי דקרון בסנטימטר אחד על כל קצה הרשת בשלושה תפרים. השאירו חפיפה של צינורות של שניים עד שלושה מילימטרים ואל תנקבו את הצינור. הקפד להשאיר כ -15 סנטימטרים של תפר חופשי לשימוש מאוחר יותר בפרוטוקול זה.

כל הרכיבים והכלים של הביוריאקטור נאספים אוטומטית מראש. יום לפני התחלת תרבית הביוריאקטור, יש להרכיב את הביוריאקטור באופן חלקי להטביע את רכיבי הביוריאקטור הפיגומים, כך שצינורות סיליקון רשת, מכשירי הניתוח וחוט דק ארוך יותר מאורך הביוריאקטור באמבט אתנול 70% למשך 30 דקות לפחות כשהוא שקוע. השתמש בחוט כדי למשוך את צינור הסיליקון דרך זרועות הצד של הכור.

כעת הגיח הביוריאקטור והצמד את פיגומי ה-PGA פנימה על ידי הידוק אזיקי הדקרון מעל שפתי הזכוכית המתרחבות. השתמש בתפר העודף כדי לקשור כל שרוול. לאחר מכן, באמצעות מחברים, חבר את צינור הסיליקון בצד אחד של הפיגום עם זוג אחד של זרועות ביו-ריאקטור והצמד את הצינור בצד השני של הפיגום לשתי הזרועות האחרות.

כאשר המחברים מותקנים, משוך אותם מהזרועות הצדדיות ושטוף את הביוריאקטור החוצה באתנול. השאירו את הכור ספוג במשך 10 דקות מכל צד. הניחו את הביוריאקטור על כמה צלחות פטרי ושטפו אותו החוצה עם תרבית רקמות.

מים כיתתיים. בעזרת פיפטה, הקפד לשטוף גם את הרשת והצינורות. כעת הנח מוט ערבוב סטרילי בכור לשימוש עתידי וייבש את המכשיר למשך הלילה במכסה המנוע עם מפוח דולק ו-UV כבוי מנקודה זו ואילך.

אין להישען מעל הכור מכיוון שהדבר עלול להוביל לזיהום במהלך ההתקנה, יש לנגב את כל המחברים באלכוהול. לפני ביצוע קבצים מצורפים, רבים מהמפרקים מחוזקים בפרפורם, אותו יש להשרות באתנול 70% לפני היישום. אז יש הרבה משניהם.

כאמצעי זהירות, הניחו צלחת פטרי סטרילית מעל כל פתח ביו-ריאקטור כדי להגן על פיגום ה-PGA שבתוכו מפני מזהמים. כעת התחל את ההתקנה על ידי חיבור יציאת ההזרקה לזרוע השלישית שאינה בשימוש של הביוריאקטור. לאחר מכן, חבר את שקית העירוי למערכת הזרימה.

בעזרת סט צינורות סוסי הים, קשרו את הקצה הכחול קרוב ככל האפשר לצומת Y והדקו את הצינור. חבר את הצינור האדום לקצה הרחוק של שקית העירוי. לאחר מכן חבר את הצינור הלבן לצד אחד של מערכת הזרימה.

הכנס זין עצירה תלת-כיווני למערכת הזרימה. חבר קצה אחד של צינור מתמר הלחץ לזין העצירה והצמד את הקצה השני לפתח האמצעי של שקית העירוי. כעת כדי למלא חלקית את מערכת הזרימה ולבדוק אם יש נזילות, הוסף 350 מיליליטר PBS ואזור פטריות של 1% לשקית העירוי.

בעזרת מזרק של 60 מיליליטר לפני או אחרי חיבור למערכת הזרימה, כוונן את תא העצירה כדי לשלוט בכיוון הזרימה של PBS וסחט את השקית כדי לשטוף את המערכת. שלב זה יכול להיעשות לפני או אחרי הישיבה בתא. כעת ניתן לשבת תאים בביו-ריאקטור.

בדוגמה זו, החייאה משהה 8 מיליון תאי SM, שהם בערך T 75 אחד ב-1.25 מיליליטר של מדיום ומטפטפת אותם באופן אחיד על פיגום ה-PGA מצומת דקרון לצומת דקרון. לאחר הוספת התאים, נגב את שפת הביוריאקטור באלכוהול. הימנע מריחוף מעל הכור.

לאחר מכן, הרכיבו בזהירות את מכסה פקק הסיליקון. הקפד לא לחשוף את החלק התחתון של המכסה בעת הוצאתו מתיק החיטוי או במהלך כל אחד משלבי ההצמדה הבאים. ראשית, חבר את יציאת ההזרקה לצינור ההזנה במחבר הזכר.

שנית, חבר מסנני PTFE 0.20 מיקרון לכל אחד משלושת שדות התעופה. פסקה שלישית, צלם את יציאת ההזרקה. הכנס את מכסה פקק הסיליקון המורכב לביו-ריאקטור זכוכית.

ודא שצינור ההזנה אינו נוגע בפיגומי ה-PGA היושבים. ואז אוטמים עם פרפורם. כעת חבר את הביוריאקטור למערכת הזרימה והנח את הביוריאקטור ומערכת הזרימה בתוך אינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.

במשך 25 עד 30 דקות, יש להניח את הכור על צדו ולסובב אותו כל חמש דקות. לאחר מכן, בעודכם בחממה, מלאו את תא הביוריאקטור ב-400 מיליליטר של ארבעה עד 10 אמצעי תרבית באמצעות משאבה דרך צינור הזנה. כעת דגרו על הפיגומים הזרעים ללא שאיבה פועמת במשך שישה עד שבעה ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.

אין צורך בשינוי בינוני או בתוספת ויטמין C במהלך תקופה זו לפני הפעלת המשאבה, בדוק את הצינור לאיתור נזילות או קיפולים. לאחר מכן כוונן את קצב המהירות של המשאבה כדי לשמור על טווח לחץ בין שלילי 30 ל -270 מילימטר כספית. עקוב אחר לחץ זה ושמור עליו מדי יום לאורך כל התרבות.

יש לבצע שינויים בינוניים ותוספת של חומצה אסקורבית פעמיים בשבוע בזמן שהפיגום גדל בשאיבה פועמת כדי להזין מדיום טרי תחילה, חבר את יציאת ההזרקה ומסנן ה-PTFE על מכסי ההזנה למטרות סילוק פסולת בינונית ובינונית כאחד. לאחר מכן, הנח את צינור ההזנה בחוזקה במשאבה הדו-כיוונית והכנס קצה אחד ליציאת ההזנה של הביוריאקטור ואת הקצה השני למכסה ההזנה. עכשיו התחל לאט לאט לשאוב 200 מיליליטר מדיום.

בהדרגה ניתן להגביר את מהירות המשאבה. לאחר מכן חבר צינור הזנה חדש והתחל לאט לאט לשאוב 200 מיליליטר של מדיום טרי. כדי להוסיף חומצה אסקורבית לכור, הסר 25 מיליליטר מדיום באמצעות מזרק סטרילי של 30 מיליליטר.

הוסף חמישה מיליליטר של תמיסת חומצה אסקורבית סטרילית ואז החזיר את 25 מיליליטר. כלים מהונדסים בינוניים ייראו אטומים וישיגו עובי דופן של כ-250 מיקרון לאחר תרבית של שמונה שבועות. בתנאים פועמים, צביעת המט, טואין ואאוזין של כלי דם מהונדסים מראה שינויים במורפולוגיה של רקמות עם הזמן ועם הפעימה.

הצד הלומינלי של הכלים מסומן בכתם Tri CHRO של L masson. עבור קולגן מראה שכלי הדם הפועם בן ארבעה שבועות מכיל יותר קולגן מאשר מקבילו ללא פולסים, חיצים לבנים מצביעים על שברי PGA שנותרו בכלי הדם עד 12 שבועות. ניתוח אימונוכימי מראה את הביטוי של סמן השריר החלק המוקדם אלפא אקטין סמן השריר החלק הבינוני cal poin one וסמן השריר החלק המאוחר שרשרת כבדה מיוזין לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שבע עד שמונה שעות אם היא מבוצעת כראוי.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבצע הכל בצורה נקייה וסטריבית ככל האפשר בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו שינוי לומן של כלי השיט המהונדסים על מנת לענות על שאלות נוספות כמו החשיבות של שינוי פני השטח הלומינלי בתחזוקה של כלי שיט מהונדסים במהלך מחקרי in vivo. לאחר פיתוחו.

טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הנדסת הרקמות, במיוחד הנדסת כלי דם, לחקור אמצעים פוטנציאליים לטיפול במחלות עורקים כליליים במודלים של בעלי חיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשיג שתלי כלי דם מהנדסים מושתלים באמצעות תרבית דואר דינמית. אל תשכח שעבודה עם נתרן הידרוקסיד עלולה להיות מסוכנת, ותמיד יש להשתמש באמצעי זהירות כגון הגנה על העיניים ומעיל מעבדה בעת ביצוע הליך זה.