אינדוקציה של Anergy Alloantigen ספציפיים בתוך האדם תאים דם היקפיים mononuclear על ידי גירוי Alloantigen עם המצור Co-גירוי אותות

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להפעיל תאי T של תורם הספציפיים לאלו-אנטיגנים של מקבל, באמצעות גירוי ex vivo עם אלו-אנטיגנים של המקבל בנוכחות נוגדנים החוסמים קו-סטימולציה של תאי T על ידי תאים מציגי אנטיגן דרך קולטן ה-CD 28 שלהם. הדבר מושג תחילה על ידי בידוד PBMC משני תורמים בריאים שונים. לאחר מכן, מקימים תרבית משותפת להפעלת אלו-אנטיגנים בכמות גדולה, על ידי דגירה של אוכלוסיות PBMC עם אי-התאמה ב-HLA בנוכחות נוגדנים מונוקלונליים לליגנדים B 7.1 ו-B 7.2 כדי לחסום את הגירוי של CD 28.

לאחר מכן, יעילות ההפעלת האלוגנית (allo energization) נמדדת באמצעות תגובות לימפוציטים מעורבים (mixed lymphocyte reactions) ראשוניות ושניות, או MLR. לבסוף, הספציפיות האלוגנית של ההפעלה נמדדת על ידי קביעת תגובות ספציפיות ל-CMV ולצד שלישי. התוצאות המתקבלות מראות כי תאי T של התור הופכים לתגובתיים באופן חלש (hypo responsive) לגירוי אלוגני עוקב, אך תאי T של התור שאינם מגיבים באופן אלוגני נותרים שלמים ותפקודיים.

השתמשנו בהצלחה באסטרטגיה זו בניסויי קליניקה פיילוט קודמים ומתמשכים של עירוי תאי T מתרום שעברו הפעלה (allo energized) במהלך ולאחר השתלת תאי גזע עם אי-התאמה ב-HLA, ותיעדו שיפור בשחזור החיסוני, פחות זיהומים ומחלת השתל נגד המארח חריפה וכרונית קלה יותר מאשר אלו שנצפו בביקורת היסטורית של מקבלי השתלות עם אי-התאמה ב-HLA ללא מניפולציה. יתרון מרכזי של אסטרטגיית ה-allo anodization הוא מזעור השפעות שאינן במטרה, שכן הטכניקה אינה מפחיתה תגובות של תאי T ספציפיים לנתיב פתוגנים או לסגמנטים של אנטיגנים הקשורים לגידולים, ואינה מסירה תאי T רגולטוריים מסוג CD4 ממאגר תאי ה-T של התרום. את הפרוצדורה תדגים כריסטין וין, מדענית במעבדה שלנו. השלב הראשון הוא דגימת דם משני תרומי מתנדבים בריאים.

תאים מתורם אחד ישמשו כמגיבים (responder) ותאים מתורם אחר ישמשו כמעוררים (stimulator). לאחר מכן, בודדו PBMC מהדם באמצעות סנטריפוגציה במדרג צפיפות (density gradient centrifugation) באמצעות fial pac. צבעו כמות קטנה של תאים ב-trian blue וספרו PBMC חיוניים באמצעות hemo cytometer reus.

העבירו PBMC מכל תורם לנפח של 10 מיליליטר של מצע תרבית מלא, בריכוז של מיליון תאים חיוניים למיליליטר, לשפופרות קוניות נפרדות בנפח 15 מיליליטר. הגדירו שפופורה אחת של PBMC מתורם כמעמירה (stimulators) ואת השפופורה השנייה כמגיבה (responders), כדי להקים את תרבית השיתוף (co-culture) להפעלת אלואנרגיה (allo energizing) במסה.

הוסיפו 100 µg של נוגדנים anti B 7.1 ו-anti B 7.2 למבחנה בנפח 15 mL המיועדת כמעורר (stimulator). נערה את המבחנה בעדינות והדגירו למשך 30 דקות. לאחר תקופת ההדגרה, הקרינו את תאי ה-PBMC של המעורר והוסיפו אותם לבקבוק תרבית תאים T 25 בנפח 50 cm³ בעל פקק חדיר לגז.

סמנו את הבקרה של תרבית ה-allo coal. לאחר מכן, הוסיפו לבקרה 10 milliliters של PBMC מגיבים מתורם אחר בריכוז של 1 מיליון למילוiliter במצע מלא. הוסיפו לבקרה 100 micrograms נוספים מכל אחד מהנוגדנים antib 7.1 ו-Antib 7.2 וערבבו בעדינות לפני הצבת הבקרה במצב אנכי באינקובטור למשך 72 שעות.

לאחר מכן, הקרינו 10 מיליון תאי PBMC מעוררים נוספים עבור קו-קלטורת בקרת מסה (bulk control) ללא נוגדנים חוסמים, והוסיפו אותם לבקראת תרבית תאים T 25 בנפח 50 cubic centimeter. סמנו את הבקראת כ-bulk control coal culture. הוסיפו לבקראת 10 milliliters של אותם תאי PBMC מגיבים ששימשו עבור קו-קלטורת ה-bulk allo energizing, בריכוז של 1 מיליון למילליטר במצע מלא, וערבבו בעדינות לפני הנחת הבקראת במצב זקוף באינקובטור למשך 72 שעות.

השלב הבא הוא למדוד את התפקוד של מאגר תאי T תורמים שהופעלו אלו-גננית (allo energized) באותו היום שבו תויגו תרביות ה-bulk co-cultures בלוח 96 באריים (96-well plate) עם U אחד בתחתית, עבור MLR ראשוני לכל אחת משלוש נקודות הזמן למדידה. לאחר מכן, העבירו חמישה מיליליטרים מכל אחת מהתרביות של ביקורת ה-bulk וה-allo energizing co-cultures לתוך מבחנות בנפח 15 מיליליטר.

בשלב הבא, העבירו בפיפט 200 µL של תרחיף תאים מכל מבחנה לשלוש בארות שחזור בכל אחת משלוש הפלטות. סמנו בארות אלו כ-"no co-stimulatory blockade" או "no CSB" עבור התאים מתרביות הקר בקרת המסה, וכ-"CSB" עבור התאים מתרביות הקר המעבירות אלואנרגיה (allo energizing) בקרת המסה. לאחר מכן, הוסיפו 200 µL של מצע גידול מלא לשש בארות בכל פלטה כביקורות שליליות.

לבסוף, הוסיפו 200 µL של PBS לכל הבארות הריקות כדי להפחית אידוי, והכניסו את הפלטות לאינקובטור. 72 שעות לאחר הקמת תרביות השיתוף (co cultures) הגדולות, סמנו פלטת UBO של 96 בארות כ-"secondary MLR" עבור כל אחת משלוש נקודות הזמן שיימדדו. כדי להכין את תאי המגיבים עבור ה-secondary MLR, העבירו 5 mL מכל אחת מתרביות השיתוף של ביקורת ה-bulk וה-allo energizing לשפופרות של 15 mL, וסבבו את השפופרות בצנטריפוגה במשך 5 עד 10 דקות במהירות של 2000 RPM בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את התאים פעמיים נוספות על ידי שאיבה זהירה של ה-SNAs, פירוק המשקעים, הוספת 10 mL של מצע גידול מלא לכל שפופרת, וסבב נוסף של התאים בצנטריפוגה לאחר השטיפה השנייה.

ששעו שוב את התאים במיליליטר אחד של מצע מלא. השתמש בצביעה ב-trypan blue כדי לספור את התאים החיוניים והתאם את ריכוז התאים ל-1 מיליון תאי responder חיוניים למיליליטר. טפטף 100 µL של ת сусפנזיית תאים מכל מבחנה לתוך באריות משולשות בכל פלטה.

סמנו באותיות אלה את הבארים כ-first party או FP alloy stimulation. לאחר מכן, העבירו בפיפטה 100 µL של תרחיף תאים מכל מבחנה לשלוש בארים נוספות בכל פלטה, וסמנו בארים אלו כ-CD 3/28 stimulation PBMC מתורם זהה לזה שסיפק את ה-first party stimulator PBMC עבור ה-allo. תרביות משותפות של תאים מופעלים (energized) ובקרות משמשות כתאי מעבדה (stimulator cells) עבור MLR משני. השעו 10 מיליון PBMC של תורם first party בריכוז של 1 מיליון למילליטר והקרינו.

הוסיפו 100 microliters של תאי מעצב מקרינים לבארים המסומנות fp allo restimulation בכל פלטת MLR משנית. עבור בקרות חיוביות, הוסיפו מיקרוליטר אחד מכל אחד מהנוגדנים החד-שבטיים CD three ו-CD 28 וכן 98 microliters של מצע מלא לבארים המסומנות CD 3 28 stimulation בכל פלטת MLR משנית. בנוסף, הוסיפו 200 microliters של מצע מלא לשש בארות ריקות בכל פלטה כדי שישמשו כבקרות שליליות, והוסיפו 200 microliters של PBS לכל הבארות הריקות כדי להפחית התאיידות.

הניחו את הפלטות באינקובטור. השלב הבא הוא למדוד את הסגוליות של ה-allo PBMC שהבודדו מתורם בריא חדש, המכונה התורם השלישי, אשר משמשים לבדיקת הסגוליות של תהליך ה-allo ב-MLR משני. תלו את ה-PBMC של התורם השלישי בריכוז של 1 million cells per milliliter והקרן וסמן 3 פלטות 96 עבור סגוליות MLR משני בימים השלישי, החמישי והשביעי.

כדי להכין את התאים המגיבים ל-MLR משני למדידת ספציפיות, העבירו חמישה מיליליטרים מכל אחת מהתרביות המשותפות של ביקורת הכלל (bulk control) וההפעלה האלוגנית (allo energizing) למבחנות בנפח 15 מיליליטר וסובבו אותן בצנטריפוגה למשך חמש עד 10 דקות ב-2000 RPM. לאחר מכן, שטפו את התאים פעמיים על ידי שאיבה זהירה של הנוזלים שמעל המשקע, פירוק המשקעים, הוספה של 10 מיליליטרים של מצע גידול מלא לכל מבחנה וסבב נוסף בצנטריפוגה לאחר השטיפה השנייה. השביו את התאים במיליליטר אחד של מצע גידול מלא.

השתמשו בצביעה ב-trypan blue כדי לספור את התאים והתאימו את ריכוז התאים ל-1 מיליון תאי responder חיים למיליליטר, ולאחר מכן העבירו בפיפטה 100 µL של תגסוס התאים מכל מבחנה לשלוש בארות חזרתיות בכל פלטה. סמנו בארות אלו כ-TP או third party allo stimulation. לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של תאי stimulator מקרינים של TP לבארות המסומנות כ-TP allo stimulation.

כדי לבחון באופן מעמיק יותר את הסגוליות, נמדדו תגובות allo לפתוגנים לאחר הפעלה (energization) של PBMC מתורמים עם תגובות פרוליפרטיביות שנקבעו בעבר ל-CMV; סמנו את פלטות הבארים "secondary M-L-R-C-M-V day three, five and seven", והעבירו 5 mL מכל אחת מתרביות ה-bulk control וה-allo energizing למבחנות של 15 mL. לאחר מכן, שטפו, ספרו ותלו את התאים בריכוז של 1 מיליון ל-mL במצע מלא; השתמשו בפיפטה כדי להעביר 100 µL של תרחיף תאים מכל מבחנה לשלוש בארות בכל פלטה, וסמנו בארות אלו כ-CMV stimulation.

לאחר מכן, הוסיפו 0.1 µL של ליזאט CMV ב-100 µL של מצע גידול מלא לבארות המסומנות כ-CMV stimulation. לאחר מכן, הוסיפו 200 µL של מצע גידול מלא לשיש בארות בכל פלטה כביקורות שליליות. לסיום, הוסיפו 200 µL של PBS לכל הבארות הריקות כדי להפחית אידוי, והכניסו את הפלטות לאינקובטור למדידת פרוליפרציה ב-MLR ראשוני a ושני.

הוסיפו מיקרו-קורי אחד של תימידין טריטיומי (tritiated thymidine) לבקרת השלילה ולבארים המכילות תאים 16 שעות לפני קציר הפלטות. אספו את התימידין על גבי פוד פילטר אחד עבור כל פלטה באמצעות קוצר TomTec או מכשיר דומה. ייבשו את פודי הפילטר למשך שעה אחת.

לאחר מכן, העבירו אותם לשקיות דגימה נפרדות. הוסיפו חמישה מיליליטר של נוזל סינתילציה לכל אחת ואטמו אותן. מדדו את שילוב ה-tri thymidine ב-16 השעות האחרונות של הניסוי על ידי קריאת משטחי המסנן באמצעות מונה סינתילציה מיקרו-בטא מסוג wallach, או מכשיר דומה, תוך שימוש בתאי PBMC של מעבדה (stimulator) ומגיב (responder) עם חוסר התאמה ב-HLA.

ניתן לראות בדמות זו כי נוכחות של חסימה קו-סטימולטורית (co-stimulatory blockade) ב-MLR הראשוני מפחיתה את ממוצע הפרוליפרציה האלו-גננית של PBMC המגיבים ביום החמישי לכ-30% מהזו שנצפתה ב-MLR ראשוני של ביקורת בהיעדר חסימה קו-סטימולטורית. הדבר שקול לעכבה ממוצעת של פרוליפרציה אלו-גננית ראשונית של כ-70% ביום החמישי, כפי שניתן לראות בדמות זו.

ניתן לראות בדמות זו שבבדיקת MLR משנית, השכפול האלו-גנרי של תאי PBMC שהוערכו אלו-גנרית ביום החמישי הוא בדרך כלל 10 עד 15% מזה שנראה בתאי PBMC של ביקורת. זה שקול לעכבה ממוצעת של השכפול בשיעור של 85 עד 90%, מה שמראה כי תאי PBMC שהוערכו אלו-גנרית הם בעלי תגובה נמוכה (hypo responsive) למעוררים אלו-גנריים של הצד הראשון. כפי שניתן לראות בדמות זו, ניתן להקים תרביות משולבות של תאי דם פריפריים מונונוקליאריים של תורם שהוערכו אלו-גנרית בתוך שעתיים עד שלוש שעות.

ניתן להסדיר את הגישה בקלות לשימוש קליני כדי להפיק תאי T מתורם בעלי תגובתיות אלוגנית מופחתת, אך עם שימור חסינות ספציפית לפתוגנים. תאים אלו ניתנים להעברה אדופטיבית במסגרת השתלת תאי גזע המטופויטים אלוגנית כדי לשפר את השחזור החיסוני ללא מחלה מוגברת של דחיית השתל נגד המארח (graft-versus-host disease). בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לעבוד במהירות.

שלב זה מסייע בשימור חיוניות התאים ובמניעת הפעלה לא ספציפית או אובדן של תאים מציגי אנטיגן. במידה ומשתמשים ב-PBMC שנשמרו בהקפאה עבור מעבדים (stimulators) או מגיבים (responders), יש להשתמש בפרוטוקול מאושר להחייאת תאים קפואים המניב באופן עקבי תפוקה גבוהה של תאים חיוניים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של האופן שבו מבצעים allo-anization לתאי דם פריפריאליים מונונוקליאריים מתורם אנושי, וכיצד לבצע בדיקות להערכת היעילות והספציפיות של הליך זה; ניתן להשתמש באסטרטגיה זו כדי לייצר תאי T מתורם אנושי עם תגובות allo מופחתות, שניתן להשתמש בהן באופן קליני לשיפור השחזור החסוני לאחר השתקת תאי גזע המטופויית אלוגנית.