אינדוקציה של Anergy Alloantigen ספציפיים בתוך האדם תאים דם היקפיים mononuclear על ידי גירוי Alloantigen עם המצור Co-גירוי אותות

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להפעיל תאי T של תורם הספציפיים לאלו-רקב של מקבל, באמצעות גירוי ex vivo עם אלו-אנטיגנים של המקבל בנוכחות נוגדנים החוסמים את העשיית-גירוי (co-stimulation) של תאי T על ידי תאים מציגי אנטיגן באמצעות קולטן CD 28 שלהם. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד PBMC משני תורמים בריאים שונים. לאחר מכן, מקימים תרבית משותפת להפעלת אלו-רקב מאסיבית על ידי דגירה של אוכלוסיות PBMC עם אי-התאמה ב-HLA בנוכחות נוגדנים מונוקלונליים לליגנדים B 7.1 ו-B 7.2 כדי לחסום את גירוי CD 28.

לאחר מכן, יעילות האנרגיה האלו-גנית נמדדת באמצעות תגובות לימפוציטים מעורבים (MLR) ראשוניות ושניות. לבסוף, הספציפיות האלו-גנית של האנרגיה האלו-גנית נמדדת על ידי קביעת תגובות ספציפיות ל-CMV ולצד שלישי. התוצאות המתקבלות מראות כי תאי T של התורם הופכים להיפו-רספונסיביים לגירוי אלו-אנטיגני עוקב, אך תאי T של תורם שאינם מגיבים לאלו-אנטיגנים נותרים שלמים ותפקודיים.

השתמשנו בהצלחה באסטרטגיה זו בניסויי קליניים פיילוט קודמים ומתמשכים של עירוי תאי T של תורם שהופעילו באנרגיה (allo energized) במהלך ולאחר השתקת תאי גזע עם חוסר התאמה של HLA, וצפינו בשיפור בשחזור החיסוני, בפחות זיהומים ובמחלת השתלה נגד מאכיל (graft versus host disease) חריפה וכרונית פחות חמורה מכפי שנראה בביקורת היסטורית של מקבלים של השתקות HLA עם חוסר התאמה ללא מניפולציה. יתרון מרכזי של אסטרטגיית ה-allo anodization הוא שסיכוני השפעות מחוץ למטרה (off-target effects) ממועטים, שכן הטכניקה אינה מפחיתה תגובות של תאי T ספציפיים לגורמי מחלה או ספציפיים לאנטיגנים הקשורים לגידולים, ואינה מסירה תאי T רגולטוריים מסוג CD four ממאגר תאי ה-T של התורם. את הפרוצדורה תדגים כריסטין וין, מדענית במעבדתנו. השלב הראשון הוא דגימת דם משני תורמים מתנדבים בריאים.

תאים מתורם אחד ישמשו כמתגבים ותאים מתורם אחר ישמשו כמעוררים. לאחר מכן, בודדו PBMC מהדם באמצעות סנטריפוגציה במדרג צפיפות תוך שימוש ב-fial pac. צבעו כמות קטנה של תאים ב-trian blue וספרו את ה-PBMC החיוניים באמצעות hemo cytometer reus.

העבירו PBMC מכל תורם למבחנות קונוס של 15 מיליליטר נפרדות, בתוך 10 מיליליטר של מצע תרבית מלא בריכוז של 1 מיליון תאים חיים למילליליטר. הגדירו מבחנה אחת של PBMC מתורם כמגרה ואת השנייה כמגיבה, כדי להקים את תרבית השיתוף (co-culture) להפעלת אלולו-אנרגיה (allo energizing) במסה.

הוסיפו 100 µg של נוגדנים anti B 7.1 ו-anti B 7.2 למבחנה של 15 mL המיועדת כמעורר. נערה את המבחנה בעדינות והדגירו למשך 30 דקות. לאחר תקופת ההדגרה, הקרינו את ה-PBMC של המעורר והוסיפו אותם לבקבוק תרבית תאים מסוג T 25 בנפח 50 cm³ עם מכסה חדיר לגז.

סמנו את הבקרה כתרבית פחם אלוגנית בנפח גדול. לאחר מכן, הוסיפו לבקרה 10 מיליליטר של PBMC מגיב מתורם אחר בריכוז של 1 מיליון למילליטר במצע מלא. הוסיפו לבקרה 100 מיקרוגרם נוספים מכל אחד מהנוגדי הגוף antib 7.1 ו-Antib 7.2 וערבבו בעדינות לפני הצבת הבקרה במצב זקוף באינקובטור למשך 72 שעות.

לאחר מכן, הקרינו 10 מיליון תאי PBMC מעבדים נוספים עבור בקרה כללית של תרבית השיתוף (bulk control co-culture) ללא נוגדנים חוסמים, ולאחר מכן העבירו אותם לבקבוק תרבית תאים T 25 בנפח 50 cubic centimeter. סמנו את הבקבוק כ-bulk control coal culture. הוסיפו לבקבוק 10 milliliters של אותם תאי PBMC מגיבים ששימשו עבור תרבית השיתוף ה-bulk allo energizing, בריכוז של 1 מיליון תאים למילילטר במצע מלא, וערבבו בעדינות לפני הנחת הבקבוק במצב זקוף באינקובטור למשך 72 שעות.

השלב הבא הוא למדוד את התפקוד של מאגר תאי T תורמים שהופעלו על ידי אלוקו (allo energized) באותו היום שבו תומתקו תרביותי המסה (bulk co-cultures). הגדירו בלוח 96 בארות עם תחתית אחת (U bottom) MLR ראשוני עבור כל אחת משלוש נקודות הזמן המיועדות למדידה. לאחר מכן, העבירו חמישה מיליליטרים מכל אחת מתרביות הבקרה והתרביות המופעלות על ידי אלוקו למבחנות בנפח 15 מיליליטר.

בשלב הבא, העבירו בפיפט 200 µL של סספנסיית תאים מכל מבחנה למשולש בארות בכל אחת משלוש הפלטות. סמנו בארות אלו כ-"no co-stimulatory blockade" או "no CSB" עבור התאים מתרביות הקרה של ביקורת ה-bulk, וכ-"CSB" עבור התאים מתרביות הקרה של bulk allo energizing. לאחר מכן, הוסיפו 200 µL של מצע גידול מלא לשש בארות בכל פלטה כביקורות שליליות.

לבסוף, הוסיפו 200 µL של PBS לכל הבארות הריקות כדי להפחית התאיידות והכניסו את הפלטות לאינקובטור ל-72 שעות לאחר הקמת תרביות השותפות (co cultures) הגדולות. סמנו פלטת UBO 96-בארות כ-secondary MLR עבור כל אחת משלוש נקודות הזמן שיימדדו. כדי להכין את תאי המגיבים עבור ה-secondary MLR, העבירו 5 mL מכל אחת מתרביות השותפות של ביקורת ה-bulk ושל ה-allo energizing לשפופרות של 15 mL וסובבו את השפופרות בצנטריפוגה למשך 5 עד 10 דקות במהירות של 2000 RPM בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את התאים פעמיים נוספות על ידי שאיבה זהירה של ה-SNAs, פירוק המשקעים, הוספה של 10 mL של מצע גידול מלא לכל שפופרה, ולאחר מכן סובבו שוב את התאים בצנטריפוגה לאחר השטיפה השנייה.

שעלקו את התאים במיליליטר אחד של מצע גידול מלא. השתמשו בצביעת trypan blue כדי לספור את התאים החיים והתאימו את ריכוז התאים ל-1 מיליון תאי responder חיים למיליליטר. העבירו בפיפט 100 µL של תרחיף תאים מכל מבחנה לשלוש בארות (triplicate) בכל פלטה.

סמנו באותם בארות אלו כ-first party או FP alloy stimulation. לאחר מכן, העבירו בפיפט 100 µL של תרחיף תאים מכל מבחנה לשלוש בארות נוספות בכל פלטה וסמנו בארות אלו כ-CD 3/28 stimulation PBMC מתורם זהה לזה ששימש לאספקת PBMC של first party stimulator עבור ה-allo. תרביות משותפות (co-cultures) של ביקורת ושל תאים מופעלים (energized) משמשות כתאי מעורר עבור MLR משני. השביו 10 מיליון PBMC של תורם first party בריכוז של 1 מיליון למל והוסיפו radiate.

הוסיפו 100 µL של תאי מעצב שהקרינו לבארים המסומנות fp allo restimulation בכל פלטת MLR משנית. עבור בקרות חיוביות, הוסיפו מיקroliter אחד של נוגדנים מונוקלונליים CD3 ו-CD28 ו-98 µL של מצע מלא לבארים המסומנות CD 3 28 stimulation בכל פלטת MLR משנית. בנוסף, הוסיפו 200 µL של מצע מלא לשישה בארים ריקים בכל פלטה שישמשו כבקרות שליליות, והוסיפו 200 µL של PBS לכל שאר הבארים הריקים כדי להפחית אידוי.

הניחו את הפלטות באינקובטור. השלב הבא הוא מדידת הסגוליות של ה-allo PBMC שבודדו מתורם בריא חדש, המכונה תורם צד שלישי, המשמשים לבדיקת הסגוליות של תהליך ה-allo ב-MLR משני. השעו את ה-PBMC של תורם הצד השלישי בריכוז של 1 million cells per milliliter והקרינו; סמנו 3 פלטות 96 עבור secondary MLR specificity לימים 3, 5 ו-7.

כדי להכין את תאי המגיבים ל-MLR משני למדידת ספציפיות, העבירו חמישה מיליליטרים מכל אחת מהתרביות המשותפות של ביקורת הbulk ושל allo energizing למבחנות בנפח 15 מיליליטר וסובבו את המבחנות בצנטריפוגה למשך חמש עד 10 דקות ב-2000 RPM. לאחר מכן, שטפו את התאים פעמיים על ידי שאיבה זהירה של העל-נוזלים (supranames), פירוק של המשקעים, הוספת 10 מיליליטר של מצע מלא לכל מבחנה וסבב נוסף של התאים בצנטריפוגה לאחר השטיפה השנייה. השביהו מחדש את התאים במיליליטר אחד של מצע מלא.

השתמש בצביעה ב-trypan blue כדי לספור את התאים והתאם את ריכוז התאים ל-1 מיליון תאי responder חיים למילליליטר, ולאחר מכן העבר בפיפט 100 µL של תרחיף תאים מכל מבחנה לשלוש בארות חזרות בכל פלטה. סמן בארות אלו כ-TP או third party allo stimulation. לאחר מכן, הוסף 100 µL של תאי TP stimulator שהוקרנו לבארות המסומנות כ-TP allo stimulation.

כדי לבחון את הספציפיות של תגובות אלואימיוניות, נמדדו תגובות לנפיגנים לאחר הפעלה (energization) של PBMC מתורמים עם תגובות פרוליפרטיביות שהוכרו ön previamente ל-CMV. סמנו את פלטות ה-96 ב-"label 3", "secondary M-L-R-C-M-V day three, five and seven", והעבירו 5 ml מכל אחת מתרביות הבקרה הכללית (bulk control) ותרביות ה-allo energizing למבחנות של 15 ml. לאחר מכן, שטפו, ספרו ותלו את התאים בריכוז של 1 מיליון לתמליל של 1 ml במדיום מלא. פפטו 100 µL של תמיסת תאים מכל מבחנה לשלושה בארות בכל פלטה, וסמנו בארות אלו כ-"CMV stimulation".

לאחר מכן, הוסיפו 0.1 µl של CMV lysate ב-100 µl של מצע גידול מלא לבארים המסומנות כ-CMV stimulation. לאחר מכן, הוסיפו 200 µl של מצע גידול מלא לשישה בארים בכל פלטה כביקורות שליליות. לבסוף, הוסיפו 200 µl של PBS לכל הבארים הריקות כדי להפחית אידוי, והניחו את הפלטות באינקובטור למדידת השגחה ב-MLR ראשוני ושני.

הוסיפו מיקרו-קורי אחד של תימידין טריטיומי לבארות של ביקורת השלילה ולבארות המכילות תאים, 16 שעות לפני קצירת הפלטות. אספו את התימידין על גבי מד-מסנן אחד לכל פלטה באמצעות קוצר TomTec או מכשיר דמה. ייבשו את מדי המסננים למשך שעה אחת.

לאחר מכן, העבירו אותם לשקיות דגימה נפרדות. הוסיפו חמישה מיליליטרים של נוזל סינצילציה לכל שקית ואטמו אותן. מדדו את השילוב של tri thymidine ב-16 השעות האחרונות של הניסוי על ידי קריאת משטחי המסננים במספר בטא סינצילציית-מיקרו מסוג wallach, או מכשיר דומה, תוך שימוש ב-PBMC של מעורר ומגיב עם HLA mismatch.

ניתן לראות בדמות זו כי נוכחות של חסמה קו-סטימולטורית (co-stimulatory blockade) ב-MLR ראשוני מפחיתה את ממוצע הפרוליפרציה האלוגנית של PBMC מגיבים ביום החמישי לכ-30% מזו שנצפתה ב-MLR ראשוני ביקורת ללא חסמה קו-סטימולטורית. נתון זה שקול לעכבה ממוצעת של פרוליפרציה אלוגנית ראשונית של כ-70% ביום החמישי, כפי שניתן לראות בדמות זו.

ניתן לראות בדמות זו כי ב-MLR משני, שגשוג (proliferation) של PBMC שהוערכו-allo (allo energized) למול תאי תמורה מהצד הראשון ביום החמישי הוא בדרך כלל 10% עד 15% מזה שנראה ב-PBMC של ביקורת. הדבר שקול לעכבה ממוצעת של השגשוג בשיעור של 85% עד 90%, מה שמעיד על כך ש-PBMC שהוערכו-allo הם בעלי תגובה נמוכה (hypo responsive) למעוררים-allo מהצד הראשון. כפי שניתן לראות בדמות זו, ניתן להקים תרביות משותפות (co cultures) של תאים בנפח גדול (bulk) של תאי דם פריפריים מונונוקלאריים של תורם שהוערכו-allo תוך שעתיים עד שלוש שעות.

ניתן להפוך את הגישה לסטנדרטית בקלות לשימוש קליני כדי לייצר תאי T מתורם עם תגובתיות אלוגנית מופחתת, אך עם שימור של חסינות ספציפית לפתוגנים. תאים אלו ניתנים להעברה אדופטיבית בהקשר של השתלת תאי גזע המטופואטיים אלוגנית כדי לשפר את השיקום החסוני ללא מחלת שתל נגד מאכסן מוגברת. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לעבוד במהירות.

פעולה זו מסייעת בשמירה על חיוניות התאים ובמניעת הפעלה לא ספציפית או אובדן של תאים מציגי אנטיגן. במידה ומשתמשים ב-PBMC שהשמרים בהקפאה עבור סטימולטורים או רספונדרים, יש להשתמש בפרוטוקול מתוקף להחייאת תאים קפואים, המניב באופן עקבי תשואות גבוהות של תאים חיוניים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לבצע אלואניזציה (allo-anize) לתאים מונונוקליאריים של דם פריפריאלי מתורם אנושי, וכיצד לבצע בדיקות להערכת היעילות והספציפיות של הליך זה; ניתן להשתמש באסטרטגיה זו כדי לייצר תאי T מתורם אנושי עם תגובות אלואנטיות מופחתות, אשר ניתן להשתמש בהם באופן קליני לשיפור השחזור החסוני לאחר השתלת תאי גזע המטופואטיים אלוגנאיים.