הכרומטין Assay immunoprecipitation עבור גנים ספציפיים רקמות באמצעות שלבים מוקדמים של עוברי עכברים

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד עוברי עכבר בשלב E 8.5 לשימוש בבדיקות כרומטין, אימונופרסיפיטציה או ChIP. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד עוברי העכבר והכנת תרחיפי תאים בודדים. השלב השני של הפרוצדורה הוא קישור צולב (cross-link) כימי של חלבונים הקשורים ל-DNA אל ה-DNA הגנומי, ולאחריו סוניקציה לפירוק ה-DNA למקטעים.

השלב השלישי של הפרוצדורה הוא ביצוע שיקוע חיסוני (immunoprecipitation) של קומפלקסים של חלבון וכרומטין ובידוד של DNA מטוהר. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא ניתוח של ה-DNA המטוהר ששוקע חיסונית באמצעות PCR קונבנציונלי או באמצעות PCR כמותי בזמן אמת (quantitative real-time PCR). בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות אינטראקציות של חלבונים עם רצפים רגולטוריים של גנים ספציפיים לדיפרנציאציה במהלך תחילת תוכנית הדיפרנציאציה ברקמות ובאיברים מתפתחים.

סמסטר זה יכול לסייע במתן מענה לשאלה חשובה בנוגע להתחלת תוכנית הדיפרנציאציה במהלך האמבריוגנזה, וזאת באמצעות זיהוי גורמים רגולטוריים האינטראקטיביים עם רצפים רגולטוריים של גנים ספציפיים לדיפרנציאציה בעת שהם הופכים למסוגלים מבחינה שעתוקית. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, מוציאים קרני רחם מעכברת שהוקרב ביום עוברי 8.5. בהתאם לפרוטוקול מאושר, מעבירים את הרקמה למנת Petri המכילה מדיום לחיתוך טרי באמצעות מספריים.

גזרו כל אתר השתבשות בנפרד והניחו אותם בצלחת פטרי המכילה מדיום דיסקציה טרי כדי למנוע הצטברות דם. בעזרת פינצטה, הסירו את שכבת הרחם מכל אתר השתבשות כדי לחשוף את העובריים. בודדו עובריים בודדים באמצעות פינצטה. בשלב זה של ההתפתחות, העובריים מוקפים בשק חלבון פריאטלי, שנוגע ברקמת הדקום, בשק חלבון ויסרלי ובשק השתן (amnion).

השליה (amnion) היא קרומית שקופה הנמצאת במגע ישיר עם העובר. שק החלמון הוויסרלי (visceral yolk sack) ממוקם בין השליה לבין שק החלמון הפריאטלי, וניתן להבחינו בקלות בעוברים בגילאים 8.5 עד 9.5 ימים על ידי נוכחותם של כלי דם בולטים המזינים את העובר. הוצאו כל עובר מהקרומים המקיפים אותו והעבירו אותו באופן אינדיבידואלי לצלחת חדשה המכילה תמיסת דיסקציה להסרת עודפי דם.

לאחר מכן, העבירו כל עובר לשפופרת einor של 1.5 milliliter המכילה 200 microliters של מדיום לניתוח. הומוגניזציה של העובר המבודד מתחילה בהוספה של 200 microliters של תמיסת collagenase מסוג 2 לכל שפופרת einor המכילה את העוברים.

נער את הדגימות בעדינות בשייקר בטמפרטורה של 37 degree Celsius במהירות של 100 RPM למשך 20 דקות. לאחר מכן, השהה מחדש את הדגימות על ידי פיפיטציה (pipetting) כדי לפרק גושי תאים. העבר את תרחיף התאים לחלקו העליון של מסננת תאים סטרילית בעלת גודל רשת של 40 micron המונחת מעל מבחנה מסוג eend rph בנפח 1.5 milliliter.

הוסף מיד 600 µL של 1X DPBS בטמפרטורת החדר לחלקו העליון של מסננת התאים כדי להשלים את ההפרדה. לאחר סינון התוך-תליה, השלף את מסננת התאים וסבב את הדגימות בצנטריפוגה ב-4,000 G למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C. לאחר הסבוב, השלף את העלייה (supernatants).

שעליקו כל משקע ב-1 mL של 1X DPBS בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, סבבו את הדגימות בצנטריפוגה ב-4,000 G למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר השלכת העליון בפעם השנייה, שעליקו מחדש כל משקע ב-200 µL של מדיום דיסקציה (dissection media) בטמפרטורת החדר; בצעו קישור צולב (cross-link) לכרומטין על ידי הוספה של 5.6 µL של 37% formaldehyde לדגימות בנפח 200 µL, כדי להגיע לריכוז סופי של 1% formaldehyde.

דגרו את הדגימות למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר; לאחר הדגירה, סובבו את הדגימות בצנטריפוגה ב-4,000 G למשך שלוש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס והסירו את הנוזל העליון (supernatant). השביו את התאים ב-1X-DPBS קר המכיל 80 microliters per milliliter של תערובת מעכבי פרוטאז או PIC. לאחר מכן, סובבו את הדגימות בצנטריפוגה ב-4,000 G למשך שלוש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

לאחר השלכת הנוזל העליון (supernatant), ניתן להקפיא את הדגימות בטמפרטורה של 80°C- והן יישארו יציבות למשך מספר חודשים לפני הסוניקציה. הפשיר את משקע התאים הקפוא על קרח, או הנח את המשקע מהשלב הקודם על קרח. השהה מחדש את משקע התאים ב-100 µL של בופר ליזיס SDS בטמפרטורת החדר. לאחר השהיה מחדש, הוסף 100 µL נוספים של בופר ליזיס SDS בטמפרטורת החדר והשהה את הדגימה מחדש באמצעות פיפטינג והפיכה.

דגרו את תרחיף התאים על קרח למשך 10 דקות. לאחר הדגירה, הגדירו את המכשיר לגזירת ה-DNA המקושר לאורך של בין 200 ל-500 זוגות בסיסים. בהדגמה זו, נעשה שימוש ב-DIO geno bio rupture UCD 200.

בצע סוניקציה לדגימה כאשר היא מוקפת בתערובת קרח. אין לאפשר לדגימה להתחמם מעל 4 °C או לקפוא. סבב את הדגימה שעברה סוניקציה בצנטריפוגה ב-14,000 G למשך 10 דקות ב-4 °C.

העבירו את העליון למבחנת eend DPH נקייה שקוללה מראש על קרח. חלקו את הדגימה שעברה סוניקציה למקסימום חמישה אליקוטים. שמרו אליקוט אחד בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius כדי לשמור את התוצר עבור ביטול הקשירה הצולבת (cross-link reversal).

שלב: דללו את שאר המנות פי עשרה בבופר דילול לשבב המכיל PIC שהתווסף טרי בריכוז של 1 µL ל-800 µL בופר. ראשית, קבעו אילו מהירויות הארו (aero speeds) ישתמשו עבור ניקוי מקדמי (pre clearing) בהתבסס על הנוגדן שישמש לבדיקת החלבון בשבב. כאן נעשה שימוש ב-A beads מכיוון שהנוגדן שישמש לשבב הוא rabid.

בצעו ניקוי מקדמי (Pre-clear) לסופרנאט המדולל על ידי הוספת 75 µL של תמיסת DNA וחלבון מזרע סלמון בריכוז 50%. הדגרירו את הדגימות בטמפרטורה של 4 °C עם סיבוב למשך שעה אחת; לאחר ההדגירה, צנטריפוגו את הדגימות ב-2,500 ×g למשך דקה אחת בטמפרטורה של 4 °C. העבירו את הסופרנאטים למבחנה מסוג Eppendorf מקוררת מראש.

הוסיפו ארבעה µg של נוגדן לכל דגימה ל-Eloqua שעבר ניקוי מוקדם (pre-cleared) והדגירו למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C תוך כדי סיבוב. התחילו בהוספה של 60 µL של תרחיף חרוזי aeros של DNA-protein מזרע סלמון לכל דגימה והדגירו בטמפרטורה של 4 °C תוך כדי סיבוב למשך שעה אחת. סבבו את הדגימות בצנטריפוגה במהירות של 1000 ×g למשך דקה אחת בטמפרטורה של 4 °C.

לאחר הסנטריפוגה, הסר בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) והשלך אותו, תוך שמירה על קומפלקס ה-DNA-חלבון-חרוץ על קרח. השהה (resuspend) ושטוף את המשקעים כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב באמצעות באפרים (buffers) 1 עד 4.

כל שלב שטיפה מורכב מתקופת אינקובציה של חמש דקות תוך כדי סיבוב, ולאחריה סבוב במערך צנטריפוגה ב-1000 G למשך דקה אחת והסרה של הנוזל העליון לאחר השטיפה. אלוטו את קומפלקס הנוגדן-כרומטין על ידי השעיה של קומפלקס חרוזי החלבון-כרומטין השטוף ב-250 µL של בופר אלוציה שהוכן טרי. ערבבו כל דגימה ב-Vortex בעוצמה למשך חמש שניות, ולאחר מכן הדגירו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות תוך כדי סיבוב, ולאחריה סבוב בצנטריפוגה ב-2,500 G למשך דקה אחת. בטמפרטורת החדר, העבירו כל אלואט לשפופרת Eppendorf חדשה.

חזור על תהליך an elution ושלב את ה-eluate עבור כל דגימה באותה מבחנת Eppendorf. כדי לבטל את הקשירות הצולבות (cross links), הוסף 20 µL של sodium chloride בריכוז 5 M לכל 500 µL של eluate. עבור בקרת ה-input שנשמרה מראש, הוסף 40 µL של sodium chloride בריכוז 5 M לכל מיליליטר.

חממו את ה-EITs במקלח מים בטמפרטורה של 65 °C למשך ארבע שעות. להרצה לילה, הניחו 10 µL מכל דגימה בבקרת הקלט (input control) על ג'ל agarose בריכוז 2%, לצד ס marker של גדלים בטווח של 0.1 עד 1 kb, כדי לבדוק את גודל פרגמנטי ה-DNA. ה-DNA יופיע כמריחה (smear) ולא כפס חד.

הפיקו את ה-DNA מכל דגימה של 500 µL באמצעות ערכת kaya quick gel extraction. התחילו בהוספה של 600 µL של qg buffer כדי למטב את ספיגת ה-DNA לממברנת הסיליקה בתוך עמודת kaya quick spin, ולאחר מכן הוסיפו 200 µL של isopropanol לפני טעינת העמודה. בדקו את התערובת כדי לקבוע האם קיים משקע של SDS.

אם התרחשה שקיעה של SDS, יש לחמם את הדגימות באמבט מים של 42 °C עד להיעלמות המשקע. לאחר מכן, יש להעביר את הדגימות לעמודות ולבצע אלוציה של ה-DNA בהתאם להוראות היצרן. SDS עלול להפריע לפעילות של PCRT polymerase ולכן יש להסירו לחלוטין לפני ביצוע PCR.

דגרו כל דגימת DNA על קרח כדי להשקיע שאריות של SDS וסובבו בצנטריפוגה ב-14,000 G למשך דקה אחת בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. העבירו את ה-SANE למבחנות אפנדורף חדשות. ניתן לזהות את ה-DNA EITs באמצעות PCR קונבנציונלי או באמצעות PCR כמותי בזמן אמת (quantitative real-time PCR או QPCR) עם פריימרים ספציפיים. עבור כל רצף המיועד לניתוח, השתמשו ב-5 עד 10 µL מתוך ה-DNA IIT הכולל עבור תגובת PCR או QPCR אחת; תנאי ה-PCR וה-QPCR ישתנו.

עם זאת, הכמות המוגבלת של חומר המוצא מחייבת מחזורי PCR נוספים לצורך זיהוי ב-PCR קונבנציונלי; יש להתחיל ב-40 מחזורים ולהתאים את הכמות לפי הצורך. באמצעות פרוטוקול זה, בוצעו שבבים מעוברים בשלבים E 8.5 ו-E 9.5. DNA שזוהה ושובב עבר אנליזה באמצעות PCR קונבנציונלי ובאמצעות PCR כמותי בזמן אמת (quantitative realtime PCR).

התוצאות מדגימות כי הגורם המיוגני והרגולטורי נוכח על ה-myogenic והפרומוטור בעוברים בשלבים E 8.5 ו-E 9.5. לעומת זאת, לא הייתה עדות לקישור של ה-myogenic לפרומוטור ה-myogenic ב-oak sac, שבו myogenic אינו מבוטא. פרומוטור האינטרפרון גמא, המכיל רצפים התואמים לאתר הקישור של ה-myogenic, שימש כביקורת רצף שלילית; כצפוי, myogenic לא נקשר לפרומוטור האינטרפרון גמא באף אחת מדגימות הרקמה שנבדקו.

התוצאות מעידות כי Myogenic קשור לקידומת (promoter) של Myogenic בסומיטים של עוברים בשלבי E 8.5 ו-E 9.5, כיוון ש-myo Genin מתבטא באופן ספציפי בסומיטים בשלבים אלה. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו מבודדים ומכינים עוברי עכבר בשלב E 8.5 לצורך ביצוע chromatin precipitation assay, שיזהה גורמים רגולטוריים הנמצאים בגנים ספציפיים לרקמה ברקמות מתפתחות.