אפיון מבודד, מאוורר ריאות, instrumented ועכבר perfused עם תזרים pulsatile
29 באפריל 2011
פרוטוקול הבא מתאר את התהליך של בידוד, איוורור ו instrumenting הריאות העכבר כדי למדוד יציב או pulsatile לחץ הדם הריאתי זרימה יחסים כדי לכמת את ההשפעות של זרימת הדם, זרימת אוויר, שינויים בדרכי הנשימה ושינויים בכלי הדם על afterload חדרית הנכון.
לחקור קשרי זרימת לחץ ריאתי פועם. פרוטוקול זה מסביר כיצד לבודד, לאוורר ולחלחל ריאות עכבר. קנה הנשימה חשוף בניתוח לאוורור.
לאחר מכן מבודדים את הלב והריאות כך שניתן יהיה לתקן את עורק הריאה והפרוזדור השמאלי. לאחר מכן מערכת הריאות מוחדרת. הניסויים מבוצעים על ידי שינוי זרימת עורק הריאה, גודל, צורת גל ו/או תדירות.
צורות גלי הלחץ של עורק הריאה והפרוזדורים השמאלי המתקבלות נרשמות ומדגימות את יחסי זרימת הלחץ הריאתי הפועם. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כמו תכשירים in vivo, הוא ששינויים ביחסי זרימת הלחץ. ניתן להשיג קשרי זרימת לחץ פועמים בהיעדר שינויים במצב עוצמת הקול, טונוס מערכת העצבים הסימפתטית, פעילות והשפעות ההרדמה.
כמו כן, רוב תכשירי הריאות המבודדים מודדים רק יחסי זרימת לחץ קבועים, בעוד שהטכניקה שלנו מאפשרת לקבוע יחסי זרימת לחץ פועמים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הפיזיולוגיה של הריאות, כגון כיצד מחלת כלי דם ריאתיים משפיעה על המודינמיקה ריאתית פועמת, או כיצד התקשות עורק ריאה גדול משפיעה על עומס לאחר החדר הימני? הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את חשיפת הלב והריאות ואבטחת הצינורית בעורק הריאה.
לחץ עודף מהמכשור עלול לגרום לבצקת בריאות ומיקום לא נכון של הצינורית עלול לנקב את עורק הריאה. לפני תחילת הניסוי, יש צורך להכין את מערכת IL one המשמשת לאוורור ולחלחלת הריאה המבודדת. יש לחבר את הצינור למתמרי הלחץ.
ה משאבה בודדת ומד זרימה לחלוטין שטפו את המערכת במים מזוקקים שחוממו ל-37 מעלות צלזיוס והסירו את כל הבועות בצינור. לאחר מכן הפעילו את צינור המשאבה הטכנולוגי של Endur עם 1% PBS. עכשיו אפס.
הלחץ עבור כל מתמר P 75 על ידי סגירת השסתום שלו למערכת IL one ופתיחת השסתום שלו לאטמוספירה. לאחר מכן השתמש בתקע SIS ampחיים יותר כדי לאפס אוטומטית את הלחץ לפני הכנת החיה להרטיב את מערך ה-IO one על ידי השריית החלק הנקבובי הקרמי במים מזוקקים. לאחר הרדמת העכבר מייצב את העכבר לניתוח על ידי הצמדת כפות רגליו הקדמיות ללוח שעם.
כעת רססו את החזה ב-95% אלכוהול. השתמש במלקחיים ישרים כדי לתפוס את העור בצוואר ולחתוך פתח של סנטימטר אחד עם המספריים הישרים. לאחר חשיפת החלק הפנימי של הצוואר, חתכו רקמת בלוטה לבנה בשרירים שטחיים תוך חיפוש אחר הוושט וקנה הנשימה.
בודד את הוושט וקנה הנשימה מרקמה משני הצדדים ומאחור וקשר תפר רופף סביב קנה הנשימה. כדי לקנול את קנה הנשימה, חתכו בזהירות V קטן לצד אחד שלו בעזרת המספריים הקטנים. עכשיו קח את העכבר למערכת IL one באמצעות מלקחיים קהים.
תפוס את צינורית קנה הנשימה והחלק אותה לתוך קנה הנשימה. אבטח את הצינורית בעזרת תפר. התחל לאוורר תחילה באוויר החדר, רסס את החזה באלכוהול והסר את העור באמצעות מלקחיים ישרים ומספריים ישרים.
חותכים את העור כלפי מעלה לאורך עצם החזה. מרימים את העור מכל צד וחותכים לאורך קו הצלעות התחתונות. כעת תפוס את תהליך ה- xiphoid בפינצטה והשתמש במספריים עם קצה כדורי כדי לחתוך חור בסרעפת במקום בו הוא פוגש את תחתית עצם החזה.
תפוס את הסרעפת וחתוך אותה מהצלעות. בעזרת מספריים עם קצה כדורי, אחוז שוב בתהליך ה-xiphoid והשתמש במספריים עם קצה כדורי כדי לחתוך בזהירות את עצם החזה דרך הצלעות מבלי לפגוע בריאות, בלב או בכלי הדם. כדי לחשוף את הלב, תפסו את הצלעות השמאליות וחתכו את קצותיהן.
כעת הזרקו לאט לחדר הימני 0.1 מיליליטר הפרין לאחר ההזרקה, חתכו את שאר הצלעות. השתמש בקצה האחורי או המעוגל של המלקחיים כדי לדחוף בעדינות את הריאות הרחק מהצלע תוך חיתוך הצלעות במיקרוסקופ. הסר את רקמת הבלוטה בשומן על גבי הלב.
השתמש בפינצטה כדי למשוך את הממחטות ולקצץ אותן. בעזרת המספריים הקפיציים להניח תפר סביב אבי העורקים ועורק הריאה, כף בעדינות את הלב בפינצטה קהה. צריכה להיות התנגדות מועטה.
כעת קושרים תפר רופף עם הזריקה הכפולה. לאחר מכן, חתכו את הבטן התחתונה. השתמש במספריים זוויתיים כדי לחתוך את הצלעות ועמוד השדרה.
זה יגרום לכמות משמעותית של דם לזרום. השתמש ב-Q-tip כדי לעצור את הזרימה. לאחר הפסקת זרימת הדם, יש להזין את מערכת ה-IL בארבעה מיליליטר של RPMI ממזרק מלא ב-10 מיליליטר RPMI.
כדאי לבדוק שוב שהצינור אינו מכיל בועות. כעת קנול את החדר הימני על ידי חיתוך חריץ קטן ליד הקודקוד והחדרת הצינורית כוון כלפי מטה לימין כדי להגיע לעורק הריאה. קצה הגשושית צריך להיות גלוי דרך הדופן הכמעט שקופה של עורק הריאה.
לאחר מכן הדק את התפר סביב הצינורית, אבי העורקים ועורק הריאה כדי לשרר את החדר השמאלי. חותכים חריץ בקודקוד ומכניסים את הצינורית המכוונת כלפי מעלה לאטריום השמאלי. ייתכן שיהיה צורך בלחץ קל כדי למצוא את השסתום, אך לאחר שנמצא, הצינורית תחליק דרכו ותהיה מאובטחת ללא תפר.
החדרה ידנית של RPMI ממזרק 10 מיליליטר ב-0.3 מיליליטר לדקה עד שתראה זרימה בצינור הזרימה. אם אין זרימה בצינור היציאה, מקם מחדש את צינורית החדר השמאלי. עם זאת, אם אין זרימה בריאות, בטל את הניסוי מכיוון שסביר להניח שיש דליפה בעורק הריאה.
כעת, כשהלב מנוצל במלואו, חבר את מזרק ה-60 מיליליטר למערכת IL one. השתמש במשאבת הזרימה הקבועה והחדיר את ה-RPMI Perfuse שמונה בקצב של מיליליטר אחד לדקה. בדוק אם יש דליפה במהלך הזלוף הראשוני.
יש לחלחל בהדרגה את הריאות למשך שתי דקות נוספות שבמהלכן הריאות יהפכו ללבנות. למחקרי זרימה פועמת. ראשית הגדר את תזוזה של בוכנת המשאבה הבודדת ברמות הרצויות.
לאחר מכן הגדר את קצב הזרימה הקבוע. כעת פתח את השסתום למשאבת ה-osli והתחל להקליט נתונים ממש לפני הפעלת פרופיל זרימת ה-osli. לאחר שתסיים, פתח את קובץ פלט הנתונים והתווה את זרימת הניסוי על סמך זרימות הניסוי מהניסוי הראשוני.
כוונן את תזוזה של בוכנת משאבת התנודה בכל תדר כך ש-Q max יהיה כרצונך. החזק אוורור בלחץ קבוע במהלך איסוף הנתונים לניסויי זרימה קבועה, סגור את השסתום למשאבה הבודדת והגדר את קצב הזרימה הקבוע לרמה הרצויה. התחל להקליט נתונים ועבור דרך פרוטוקול הזרימה הקבועה.
איסוף נתונים למשך 10 שניות לפחות בכל קצב זרימה בין ניסויים. אפס את קצב הזרימה ל-0.5 מיליליטר לדקה. הקפד להחזיק את האוורור בלחץ קבוע במהלך איסוף הנתונים.
אם רוצים אפס ניסויי לחץ פרוזדורים שמאליים, הסר את צינורות הזרימה בזמן ביצוע ניסויים. שימו לב בדריכות ל-RPMI בצינורות דרכי הנשימה. אסור לאפשר ל-RPMI להגיע למתמרי לחץ דרכי הנשימה אחרת הם ייפגעו.
להלן תוצאות של זלוף הזרימה הקבועה עם זרימה Q בשורה העליונה וכתוצאה מכך עורק הריאה ולחץ הפרוזדורים השמאלי בשורה השנייה במגוון תנאים. בשני הפאנלים הראשונים, לחץ הפרוזדורים השמאלי עלה וירד עם Q מכיוון שצינור הזרימה היה במקום, הפאנל הראשון מראה לחץ אוויר בקצה, לחץ שאיפה, והשני מראה לחץ אוויר בלחץ נשיפה קצה. לאחר מכן, הצינור הוסר כך שלחץ הפרוזדורים השמאלי היה קבוע ובלתי תלוי ב-Q.לאחר מכן הותאם גובה צינור היציאה באופן ידני כך שלחץ הפרוזדורים השמאלי היה גבוה יותר.
אך ללא תלות ב-Q שוב, הפאנל הראשון מראה לחץ אוויר בקצה, לחץ שאיפה והשני מראה לחץ אוויר בסוף. לחץ נשיפה. ניתן להשיג את יחסי זרימת הלחץ היציבים של עורק הריאה המתקבלים עבור כל מקרה על ידי התוויית לחץ לעומת זרימה.
להלן התוצאות של זלוף הזרימה הפועמת עם זרימה Q בפאנל העליון וכתוצאה מכך עורק ריאה, פרוזדורים שמאלי ולחץ אוויר. בחלונית התחתונה. מיחסי זרימת הלחץ הריאתי הפועמים הללו, ניתן לחשב את עכבת כלי הדם הריאתיים, המשקפת את העומס הכולל של החדר הימני.
לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 20 עד 30 דקות. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לקחת את הזמן ולהירגע כדי שהידיים שלך יהיו יציבות. ברגע שהריאות מוחדרות כראוי, החלק הקשה נגמר.
לאחר הליך זה, ניתן לבצע טכניקות אחרות כגון היסטולוגיה או בדיקות ביוכימיות על רקמת הריאה כדי לענות על שאלות נוספות כגון אילו מנגנונים מולקולריים אחראים לשינויים הנצפים ביחסי זרימת לחץ פועם ריאתי. טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום הפיזיולוגיה של הריאות לחקור את תפקידם של גנים וחלבונים ספציפיים בהתפתחות והתקדמות של מחלות כלי דם ריאתיות באמצעות עכברים מהונדסים גנטית.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מסביר את תהליך הבידוד, ההאוורור והפרפוזיה של ריאות עכבר לצורך חקר יחסי זרימה-לחץ ריאתיים פולסטיליים. מטרתו היא לכמת את ההשפעות של גורמים שונים על העומס לאחר-סיסטולי (afterload) של החדר הימני.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- פיזיולוגיה ריאתית
- מחקר קרדיווסקולרי
- ביולוגיה ניסויית
רקע
- הבנת מערכות היחסים בין לחץ לזרימה בכלי הדם הריאתיים היא קריטית לבריאות הלב וכלי הדם.
- בידוד ריאות עכבר מאפשר ביצוע ניסויים מבוקרים.
- העומס שאחרי התכווצות (afterload) של החדר הימני מושפע מזרימת הדם ומשינויים בדרכי הנשימה.
- לימוד מערכות יחסים אלו יכול לספק תובנות לגבי מחלות ריאה.
מטרת המחקר
- למדידת קשרי לחץ-זרימה כליים ריאתיים במצב יציב ובמצב פולסטילי.
- לכימות השפעות זרימת הדם וזרימת האוויר על העומס לאחר-טעינה (afterload) של החדר הימני.
- לבחינת ההשפעה של שינויים וסקולריים על התפקוד הריאתי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד ריאות עכבר באמצעות חשיפה כירורגית של הקנה.
- הנשמה ופרפוזיה של מערכת הריאות.
- קנולציה של העורק הריאתי והעליה השמאלית.
- מניפולציה ניסיונית של זרימת העורק הריאתי ושל צורת הגל.
תוצאות עיקריות
- ביסוס פרוטוקול למדידת קשרי לחץ-זרימה ריאתיים.
- הדגמה של האופן שבו שינויים בזרימה משפיעים על העומס שאחרי (afterload) של החדר הימני.
- תובנות לגבי הדינמיקה של ההתנגדות הווסקולרית הריאתית.
- השלכות פוטנציאליות להבנתיתלחץ דם ריאתי (pulmonary hypertension).
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה מהימנה לחקר המודינמיקה הריאתית.
- הממצאים תורמים להבנת הפיזיולוגיה של מערכת القلب וכלי הדם.
- מחקרים נוספים יכולים לבחון התערבויות טיפוליות למצבים ריאתיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
אפיון כמותי של התנגדות וכבלי העמידה (impedance) של כלי הדם הרשמיים בריאות עכבר מבודדות ומאווררות מאפשר הפחתת סיכונים מדויקת של מנגנוני העומס לאחר-טעינה (afterload) של החדר הימני במודלים פרה-קליניים. גישה זו מספקת בקרה עצמאית על משתנים פיזיולוגיים מרכזיים, ובכך תומכת בתיקוף יעדים ברמת ביטחון גבוהה ובבדיקה מנגנונית של מחלות כלי דם ריאתיים. יכולתה של השיטה להבחין בין תרומות של כלי דם פרוקסימליים לדיסטליים תומכת ברציפות תרגומית (translational continuity) מהפרעה מולקולרית ועד לתוצאות המודינמיות תפקודיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה קפדנית של היפותזות טיפוליות הנוגעות למערכות היחסים בין המבנה לתפקוד של כלי הדם הריאתיים.
- תומך בהסרת סיכונים מכניסטית על ידי בידוד ההשפעות של התערבויות גנטיות או פרמקולוגיות על העכבה וההתנגדות הווסקולרית.
- מסייע בתיקוף תפקודי של יעדים על ידי כימות העומס שאחרי (afterload) של החדר הימני בתגובה לפגמים ברמה המולקולרית.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק מערכת ex vivo מןוולידציה למדידה הדירה של מדדי לחץ-זרימה ועכבה.
- מסטנדרטיז פלטיים כמותיים כגון Z0, ZC, ו-RW לצורך סריקה השוואתית של תרכובות או גנים.
- מאפשר הערכה ניתנת להרחבה של פעולות ספציפיות לאתר של חומרים וזוואקטיביים בתוך כלי הדם הריאתיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים מדדי המודינמיקה פרה-קליניים למדדים רלוונטיים קלינית של עומס לאחר (afterload) בחדר הימני.
- תומך בפיתוח ביומרקרים תרגומיים על ידי קישור הפרעות מולקולריות לתוצאות כלי דם פונקציונליות.
- מאפשר קבלת החלטות על קידום מותאם סיכונים המבוססות על תוצאות המודינמיות ניבויות במודלים רלוונטיים למחלה.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
שיטה זו מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים לתיקוף פרה-קליני על ידי אספקת פלטפורמה לבדיקת השערות, הפחתת סיכונים מכניסטיים והערכה כמותית של תפקוד כלי הדם הריאתיים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבידוד של משתנים בלתי תלויים כדי להבהיר תרומות של מסלולים לעכבה והתנגדות וסקולרית.
- סריקה: מספק פלטיים המודינמיים כמותיים וניתנים לשחזור להשוואה בין תנאים שונים ובין תרכובות שונות.
- אנליטיקה: מאפשר חישוב של עקומות לחץ-זרימה מרובות נקודות ומדדי עכבה תלויי-תדירות.
- מחקר תרגומי: מקשר בין התערבויות גנטיות או פרמקולוגיות למדידות של עומס לאחר בחדר הימני בעלות רלוונטיות קלינית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה סטנדרטית וניתנת לשימוש חוזר להערכה פונקציונלית של כלי הדם בריאות לאורך תוכניות מו"פ.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות ואת ההבנה המכניסטית של מחלות כלי דם ריאתיים.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה של בדיקות המודינמיות.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) באמצעות אספקת נקודות קצה כמותיות ורובסטיות למיון פורטפוליו.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות ותרכובות בהתאם לסיכון, על בסיס תוצאות וסקולריות פונקציונליות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטכניקות של בידוד ריאות וקנולציה במיקרו-כירורגיה.
- נדרש מיכשור מדויק למדידת לחץ, זרימה ועכבה (אימפדנס).
- נדרש סטנדרזציה קפדנית בין הצוותים של פרמטרי פרפוזיה ואוורור.
- התאמה למערכות מודל אחרות עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול עבור הבדלים אנטומיים.
- טיפול זהיר חיוני כדי למנוע ארטיפקטים כגון בצקת או נקב בכלי דם במהלך ההקמה.
