Name: שיטה Encapsulation השחלות זקיק ותרבות מערכת 3 מתכלה Proteolytically מימדי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: למד שיטת אנקפסולציה לזקיקים שחלתיים ברשת תלת-ממדית של פיברין-אלגינט. טכניקה זו תומכת בהתבגרות ביציות בשמירה על אינטראקציות תאיות לחקר ביולוגיה רבייה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי NIH (U54HD41857 ו PL1EB008542, P30 Biomaterials Core במסגרת קונסורציום Oncofertility מפת הדרכים מענק).

<ol><li>Cortvrindt, R., Smitz, J., VanSteirteghem, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vitro+maturation%2C+fertilization+and+embryo+development+of+immature+oocytes+from+early+preantral+follicles+from+prepuberal+mice+in+a+simplified+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">In-vitro maturation, fertilization and embryo development of immature oocytes from early preantral follicles from prepuberal mice in a simplified culture system.</a> Human Reproduction. 11, 2656-2666 (1996).</li>
<li>Smitz, J., Cortvrindt, R., Hu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+combined+with+recombinant+human+chorionic+gonadotrophin+improves+meiotic+progression+in+mouse+follicle-enclosed+oocyte+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor combined with recombinant human chorionic gonadotrophin improves meiotic progression in mouse follicle-enclosed oocyte culture.</a> Human Reproduction. 13, 664-669 (1998).</li>
<li>Xu, M., Banc, A., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+Follicle+Growth+and+Oocyte+Maturation+by+Culture+in+Alginate+Hydrogel+Following+Cryopreservation+of+the+Ovary+or+Individual+Follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Secondary Follicle Growth and Oocyte Maturation by Culture in Alginate Hydrogel Following Cryopreservation of the Ovary or Individual Follicles.</a> Biotechnology and Bioengineering. 103, 378-386 (2009).</li>
<li>Smitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+achievements+and+future+research+directions+in+ovarian+tissue+culture%2C+in+vitro+follicle+development+and+transplantation%3A+implications+for+fertility+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">Current achievements and future research directions in ovarian tissue culture, in vitro follicle development and transplantation: implications for fertility preservation.</a> Human Reproduction Update. 16, 395-414 (2010).</li>
<li>Shikanov, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpenetrating+fibrin-alginate+matrices+for+in+vitro+ovarian+follicle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Interpenetrating fibrin-alginate matrices for in vitro ovarian follicle development.</a> Biomaterials. 30, 5476-5485 (2009).</li>
<li>West, E. R., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+properties+of+alginate+hydrogels+and+their+effects+on+in+vitro+follicle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development.</a> Biomaterials. 28, 4439-4448 (2007).</li>
<li>Kreeger, P. K., Fernandes, N. N., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mouse+follicle+development+by+follicle-stimulating+hormone+in+a+three-dimensional+in+vitro+culture+system+is+dependent+on+follicle+stage+and+dose%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Regulation of mouse follicle development by follicle-stimulating hormone in a three-dimensional in vitro culture system is dependent on follicle stage and dose.</a> Biology of Reproduction. 73, 942-950 (2005).</li>
<li>Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+approach+for+the+three-dimensional+culture+of+granulosa+cell-oocyte+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes.</a> Tissue Engineering. 9, 1013-1021 (2003).</li>
<li>Xu, M., West, E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+stage-specific+permissive+in+vitro+culture+environment+for+follicle+growth+and+oocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Identification of a stage-specific permissive in vitro culture environment for follicle growth and oocyte development.</a> Biology of Reproduction. 75, 916-923 (2006).</li>
<li>Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulated+Three-Dimensional+Culture+Supports+Development+of+Nonhuman+Primate+Secondary+Follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Encapsulated Three-Dimensional Culture Supports Development of Nonhuman Primate Secondary Follicles.</a> Biology of Reproduction. 81, 587-594 (2009).</li>
<li>West, E. R., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+follicle+micro+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Reproductive+Medicine%22%5BJournal%5D)">Engineering the follicle micro environment.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 25, 287-299 (2007).</li>
<li>Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+follicles+produce+live%2C+fertile+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring.</a> Tissue Engineering. 12, 2739-2746 (2006).</li>
<li>Ebisch, I. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+the+role+of+the+plasminogen+activator+system+and+vascular+endothelial+growth+factor+in+subfertility%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Review of the role of the plasminogen activator system and vascular endothelial growth factor in subfertility.</a> Fertility and Sterility. 90, 2340-2350 (2008).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

זקיק הציגו השחלות אנקפסולציה השיטה FA-IPN מאפשר תרבות זקיק בסביבת 3D במבחנה. FA-IPN הוא דינאמי, תאים תגובה מטריצה ​​שבו תכונות מכניות הראשוני נקבעים על ידי שילוב של הפיברין והן אלגינט. במהלך התרבות, זקיק במארז מפעיל פרוטאזות כי לבזות רק מרכיב אחד של IPN, את הפיברין, שתוצאתה קשיחות ג&#39;ל בהדרגה יורדת כי היא תרמה אך ורק על ידי אלגינט הנותרים בסוף התרבות. תכונות מכניות דינמי שהושג עם FA-IPN הוצעו להיות עקבי עם הסביבה הטבעית של זקיקי בפיתוח תרם שער משופרת של הבשלת הביצית me...

<table><tbody><tr><td>פטיואין (Fetuin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3385</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל רב-ערכי (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10082-139</td><td></td></tr><tr><td>אפרוטינין</td><td>קבוצת Roche</td><td>10236624001</td><td></td></tr><tr><td>CaCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>039-00475</td><td>40 mM</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A412</td><td></td></tr><tr><td>rFSH</td><td>המכון הלאומי לסוכרת, למחלות מערכת העיכול ולמחלות כליות</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hCG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CG-5</td><td></td></tr><tr><td>היאלורונידאז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1603</td><td></td></tr><tr><td>ITS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1884-1VL</td><td></td></tr><tr><td>L-15</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>11415</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;MEM+Gluta MAX</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>32561</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטפטומייסין</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>TBS</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>28379</td><td></td></tr><tr><td>ערכת פיברין Tisseel</td><td>Baxter International Inc.</td><td>921030</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אלגינאט</td><td>FMC BioPolymers</td><td>LF200DL</td><td>משקל מולקולרי 418kDa</td></tr></tbody></table>

שיטה encapsulation השחלות זקיק ותרבות מערכת 3 מתכלה proteolytically מימדי

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

זקיק בשחלה היא היחידה תפקודית של השחלה כי מפריש הורמוני המין ותומך הבשלת הביצית. בטכניקות זקיק במבחנה לספק כלי להתפתחות זקיק מודל כדי לחקור את הביולוגיה הבסיסית, והם עוד יותר מפותח כטכניקה לשימור פוריות מרפאה 1-4. המערכת שלנו במבחנה תרבות מעסיקה הידרוג על מנת לחקות את הסביבה השחלות יליד ידי שמירה על ארכיטקטורת הזקיקים 3D, תאים תאים אינטראקציות איתות אוטוקריני כי התפתחות זקיק ישיר 5. בעבר, היו זקיקים תרבותי בהצלחה אלגינט, פוליסכריד אינרטי אצות נגזר כי עובר gelation עם יוני סידן 6-8. הידרוג אלגינט נוצר בריכוז של 0.25% w / v היו המתירני ביותר לתרבות זקיק, ושימר את יכולת ההתפתחות הגבוהה ביותר 9. הידרוג אלגינט לא מתכלה, ובכך להגדיל את קוטר תוצאות זקיק בכוח דחיסה על זקיק אשר יכול להשפיע על הצמיחה זקיק 10. לאחר מכן אנו פיתחה מערכת המבוססת על תרבות רשת הפיברין-אלגינט interpenetrating (FA-IPN), שבה תערובת של הפיברין וכן בג&#39;ל אלגינט הם בעת ובעונה אחת. שילוב זה מספק סביבת מכני דינמי כי שני הרכיבים לתרום קשיחות מטריצה ​​בתחילה, אולם פרוטאזות מופרש על ידי הזקיק גדל לבזות הפיברין במטריצה ​​עוזב אלגינט רק כדי לספק תמיכה. עם מהמכון נמסר, התוכן אלגינט יכול להיות מופחת מתחת 0.25%, דבר שאינו אפשרי עם אלגינט לבד 5. לכן, כפי הזקיק מתרחב, זה יהיה ניסיון כוח דחיסה מופחת עקב תוכן מוצקים מופחת. בזאת, אנו מתארים שיטה אנקפסולציה ומערכת במבחנה תרבות זקיקי השחלה בתוך FA-IPN. סביבת מכני דינמי מחקה את הסביבה הטבעית שבה השחלות זקיקים קטנים מתגוררים בקליפת נוקשה ולעבור לשד מתירני יותר כפי שהם גידול בגודל 11. רכיב מתכלה עשוי להיות קריטי במיוחד עבור תרגום קליניים כדי לתמוך יותר מ 10 6 פי הגידול בהיקף כי זקיקי אדם בדרך כלל עוברים in vivo.

שיטה חדשה אנקפסולציה השחלות זקיק ברשת 3D הפיברין-אלגינט interpenetrating מתואר. מערכת זו משלבת תמיכה מבנית עם השפלה פרוטאוליטי כדי לתמוך בפיתוח של זקיקים בשלים לייצר ביציות בוגרות. שיטה זו עשויה להיות מיושם אגרגטים תא התרבות לשמור תאים תאים מגעים ללא הגבלת ההתרחבות.

שיטה Encapsulation השחלות זקיק ותרבות מערכת 3 מתכלה Proteolytically מימדי

הזקיק השחלאי הוא היחידה התפקודית של השחלה, המפרישה הורמונים מיניים ותומכת בהבשלת הביצית. טכניקות של גידול זקיקים במעבדה (in vitro) מספקות...

פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשנית לכלילה של זקיקי שחלה ברשת השבקה של פיברין ואלגינאט לצורך תרבית in vitro. זקיק שני מורכב מציטה הממוקמת במרכז ומוקפתה במספר שכבות של תאים סומטיים התומכים בהתפתחות הציטה; כלילה ותרביות של זקיקים בסביבה תלת-ממדית מאפשרות את התרחבות הזקיק תוך תמיכה בתקשורת בין מספר מדורים תאיים ושמירה על המבנה הכדורי של הזקיק. בשלב הראשון של פרוטוקול זה, בודדים זקיקים שניים משחלה של עכבר בבני 16 ימים באמצעות שיטת הטיפה.שטפו והעבירו את הזקיקים לתמיסת אנקפסולציה. שאבו כל זקיק באמצעות פיפט עם תמיסת fibrinogen alginate לתוך תמיסת thrombin calcium, והמתינו לצמירה של החרוזיים עבור שיטת ה-paraform. העבירו זקיקים בודדים לתוך טיפות של תמיסת fibrinogen alginate על גבי שלביה זכוכית מצופה ב-paraform, והוסיפו תמיסת thrombin כדי להתניע את קישור הצלב של F-A-I-P-N.לאחר מכן, העבירו את הזקיקים העטופים למצע גידול ובצעו דימות של הזקיק העטוף ב-FA IPN. מכיוון שמערכת זו משלבת תמיכה מבנית עם תגובתיות ביולוגית כדי לתמוך בצמיחה ובפיתוח של זקיקים לא בשלים לייצור ביציות, ניתן ליישמה לתרביות של אגרגטים של תאים כדי לשמר מגעים בין תאים ללא הגבלה של התפשטותם. שלום, שמי לוני שי (Lonnie Shea), ובמסגרת שיתוף פעולה עם three wood drip, פיתחנו מערכת תרבית להבשלה במעבדה (in vitro) של זקיקי שחלה.מחקר תרבית זה משקף שיתוף פעולה אמיתי בין הנדסה ביומדית לביולוגיה של הרבייה. והיום, האנשים שפיתחו בפועל את מערכת התרבית הזו יציגו בפניכם את השיטות. ראשית, אריאל צ'קוף הוא עמית פוסט-דוקטורט להנדסה ביומדית שפיתח את מערכת הביומטריאלים.שלישית היא מינסו, ביולוגית של מערכות רבייה במחלקה למיילדות וגינקולוגיה, שפיתחה את נהלי הטיפול ברקמת השחלה. יחד הם יציגו בפניכם את השיטות לכמיסה ולתרבית של רקמת השחלה. היתרון המרכזי של הטכניקה המתוארת על פני שיטות קיימות, כגון תרבית סטנדרטית על משטח פלסטיק שטוח, הוא שמערכת הפיברין-אלגינאט תומכת במבנה התלת-ממדי של הזקיק, תוך אספקת סביבה דינמית מכנית עבור הזקיק המתרחב במהירות.המיקרו-סביבה המכנית הדינמית בגישה הנוכחית מספקת יתרונות נוספים כאשר טכנולוגיה זו מועברת ממודל של עכבר ליישום קליני פוטנציאלי, מכיוון שבזקיקים אנושיים נדרש גדילה נרחבת הרבה יותר כדי להפיק ביציים בשלות ובעלות יכולת הפריה. לקבלת תוצאות אופטימליות, בצעו את כל הדיסקציות במדיום מבוסס L 15 לבקרת pH, על משטחים מחוממים בטמפרטורה של 37 °C לבקרת טמפרטורה ובתוך תא עבודה סטרילי (clean bench) כדי לצמצם זיהום חיידקי. העבירו שחלות שחולצלו טריים לצלחית פטרי חדשה בקוטר 35 מילימטר עם 1 עד 2 מיליליטר של מדיום תחזוקה המכיל 0.1% collagenase ו-0.1% DNase, והדגירו למשך 15 דקות באינקובטור CO₂.שטפו את הדגימות ב-DM כדי להסיר את הקולגןאז ו 그런 לאחר מכן העבירו אותן לצלחת פטרי בניצב 35 מילימטר עם DM רענן כדי לבודד זקיקים מהשחלה. נתקו בעדינות את הזקיקים מהשחלה השלמה באמצעות מחטים בכילוי 28 5 8 גאוגה המחוברות למזרקי אינסולין. הסירו כמה שיותר תאי סטרומה מבלי לפגוע בשלמות הזקיק.בודדים 20 עד 40 זקיקים משניים בעלי קוטר של 130 עד 150 microns מכל שחלה. לזקיקים אלה יש בדרך כלל שתי עד שלוש שכבות של תאי גרנולוזה. כעת, לצלחת IVF, מוסיפים מיליליטר אחד של mm לבאר המרכזית ושלושה מיליליטרים של mm לטבעת החיצונית.העבירו את הזקיקים השלמים באמצעות הפיפטה אל הטבעת החיצונית של צלחת ה-IVF. השאירו צלחת IVF זו בתוך האינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide. לאחר שכל הזקיקים נאספו.בחנו את הדגימות תחת מיקרוסקופ סטריאו בהגדלה של פי חמישה עד שמונה; בחרו זקיקים בגודל של 130 עד 150 מיקרון המראים מורפולוגיה בריאה, כולל שתי עד שלוש שכבות של תאי גרנולוזה, ללא הפרדה בין האוציט לתאי הגרנולוזה ואוציטים שלמים ועגולים. העבירו את הזקיקים הבריאים למרכזו של כלי IVF אחר לצורך כמיסה. עבור שיטת הטיפה לכמיסות זקיקים, הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת תרומבין בריכוז של 50 יחידות בינלאומיות למיליליטר למסגרת המרכזית של כלי IVF; הפשיקו והחזיקו תמיסת מלאי של פיברינוגן על קרח.והביאו את הפיברינוגן לטמפרטורת החדר ממש לפני הכמיסה. מיד לפני השימוש, הכינו את תמיסת הפיברינוגן-אלגינאט על ידי ערבוב של PBS בריכוז 1x עם 0.5% אלגינאט ו-50 milligrams per milliliter של פיברינוגן.פיברינוגן ביחס של שניים לאחד לאחד בתוך מבחנה מיקרו-צנטריפוגה סטרילית בנפח של 1.7 milliliter. ערבבב בעדינות באמצעות וורטקס וצנטריפוגה את התמיסה העכורה מעט כדי להפחית אידוי. כבה את משטח החימום של מיקרוסקופ הדיסקציה והנח בפיגול של הטבעה החיצונית של צלחת IVF.90 מיקרוליטר של תמיסת פברינוגן אלגינאט עבור הכמיסה וטיפה שנייה של 10 מיקרוליטר לשלב השטיפה. העבירו 10 עד 15 זקיקים לתוך הטיפה של 10 מיקרוליטר עם כמות מינימלית של מצע תרבית, ערבבו במהירות עם כמות מינימלית של תמיסה, העבירו את כל הזקיקים לתוך הטיפה של 90 מיקרוליטר וערבבו. שאבו זקיק אחד בתוך 5 מיקרוליטר של תמיסת פברינוגן אלגינאט באמצעות טיפ של 10 מיקרוליטר, ושחררו את תמיסת הפברינוגן אלגינאט יחד עם הזקיק לתוך תמיסת התרומבין במרכז צלחת ה-IVF. חזרו על שלב זה עד להכמיסה של כל הזקיקים.השאירו את החרוצים למשך חמש עד שבע דקות כדי לאפשר קשירה צולבת של הג'ל בתמיסת ה-thrombin calcium. החרוצים יהפכו לכהים יותר ככל שנוצר הפיברין. העבירו את החרוצים אל מצע התחזוקה, החל מהחרוצים הכהים יותר.ראשית, דגרו למשך 15 עד 30 דקות ב-37 °C ושטפו את התרומבין שנותר. לבסוף, העבירו את החרוזים לפלטת תרבית ובצעו דימות. הכינו מיד את תמיסת הפיברינוגן-אלגינט על ידי ערבוב של 0.5% אלגינט ו-50 mg/mL.פיברינוגן ביחס של אחד לאחד בתוך מבחנה מיקרו-צנטריפוגה סטרילית בנפח 1.7 מיליליטר. טפטפו באמצעות פיפטה 7.5 µL מתערובת הפיברינוגן-אלגינאט על זכוכית מצופה פרפום. השתמשו במגש עם מפריד של 3 מ"מ והעבירו זקיק אחד לתוך כל טיפה, עם כמות מינימלית של מצע גידול.הוסיפו 7.5 µL של תמיסת thrombin לכל טיפה, ללא מגע או ערבוב של הטיפה עם הזקיק, כיוון שהג'ל נוצר באופן מיידי כמעט. כסו את הג'לים עם זכוכית שנייה מצופה ב-para film. החליקו והניחו בתוך צלחת של 100 mm, כשהיא הפוכה, באינקובטור למשך חמש דקות.העבירו את החרוזיים הדביקים למצע תחזוקה באמצעות פינצטה במידת הצורך, ולאחר מכן לבאר תרבית בכל יומיים. צלמו את הזקיקים המטופחים באמצעות מיקרוסקופ אור ומדדו את קוטר הזקיק באמצעות Image J. כמו כן, החליפו מחצית ממצע הגידול במצע גידול מאוזן (Equilibrated) טרי בכל יומיים. לאחר שמונה ימי תרבית, ההידרוג'ל אמור להיראות שקוף עקב פירוק מלא של רכיבי הפיברין, והזקיקים עשויים להגיע לממדיהם הסופיים, הגדולים מ-400 מיקרון בקוטרם. הסירו את מצע הגידול והוסיפו 100 µL של 10 IU/mL.הוסף אלגינאט ל-alpha mem כדי לפרק את האלגינאט. הנח את הצלחת באינקובטור למשך 25 עד 30 דקות. לאחר מכן, הוצא את הזקיקים מהחרוזיים שהומסו חלקית באמצעות טיפ בעל קצה קהה.העבירו את הזקיקים לטבעת החיצונית של צלחת IVF עם מדיום דיסקציה כדי לשטוף את האלגינאט, ולאחר מכן העבירו אותם לטבעת הפנימית. כעת העבירו את הזקיקים האנטראליים לטבעת החיצונית ולאחר מכן לטבעת הפנימית של צלחת ה-IVF עם מדיום הבשלה המכיל HCG ו-EGF, והדגירו באינקובטור פחמן דו-חמצני למשך 15 עד 16 שעות. בחנו את התרביות כדי לזהות התרחבות של תאי הקומולוס לצורך הסרתם.הוסיפו תמיסת IDE בריכוז סופי של 0.1 מיליגרם למילליטר והדגירו למשך שתיים עד שלוש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני. השתמשו בפיפטה בפה כדי לשחרר את התאים הביציים (Oocytes) מתאי הקומולוס, וקבעו לבסוף את שלב הבשלות שלהם תחת המיקרוסקופ.אלגינאט הוא ביו-חומר טבעי המתאים לתרבית זקיקים in vitro בשל תכונותיו העדינות ומאפייניו הביוכימיים, כגון גודל הרשת, קשיחות ניתנת לבקרה ואינרטיות ביולוגית. זקיקים קטנים המעטופים באלגינאט חווים כוח דחיסה נמוך בתחילת התרבית. עם זאת, ככל שהזקיק מתרחב, הנפח הנדחה בתוך החרוץ גדל, מה שמוביל לכוח דחיסה רב יותר בכיוון המנוגד להתרחבות הזקיק.שרשראות של פולימרים בודדים שזורות לחלוטין בתמיסת פברילין-אלגינאט לפני קשירה צולבת. שני הרכיבים של F-A-I-P-N מתחילים לעבור קשירה צולבת מיד עם חשיפתם לתערובת של תרומבין וסידן; זקיקים מפרקים את רכיב הפיברין של ה-F-A-I-P-N במהלך תקופת התרבית, דבר המודגם על ידי עיגול ברור סביב הזקיק. המבנה התלת-ממדי של הזקיק נתמך על ידי האלגינאט הנותר.תמונות אלו מראות צמיחה של זקיקים משניים ב-F-A-I-P-N לאורך זמן מהיום ה-0, 4, 6, ושמונה עד לשלב X של M שתי שלבים. עם גוף קוטבי, aprotinin הוא מעכב פרוטאז שניתן להוסיף למצע התרבית כדי להאט את פירוק הפיברין. כאשר מוסיפים למצע התרבית 0.01 TIU למיליליטר של aprotinin בארבעת הימים הראשונים, הזקיקים אינם מסוגלים לפרק את המטריקס. לאחר הסרת ה-aprotinin, הזקיקים ממשיכים לצמוח ומגיעים לשלב האנטראלי.עם זאת, בזפקים שגודלו בתחילה בריכוז גבוה יותר של aprotinin, הצמיחה נבלמה. כיום הדגמנו טכניקה חדשה לשינוי כיסוי הזקיקים ותרבית in vitro ברשת תלת-ממדית של פיברין-אלגינאט. המערכת לא רק שומרת על מבנה זקיק שלם במהלך התרבית, אלא גם תומכת ביצירה מוצלחת של זקיקים in vitro, אשר גורמת ל-M two stage O site.טכנולוגיה זו חשובה לגילוי אופן הפעולה של זקיק השחלה ויש לה פוטנציאל לספק אפשרויות פוריות למטופלים צעירים עם סרטן באופן כללי יותר. ניתן להשתמש במערכת תרבית זו לתרבית של מקבצי תאים או לתרבית של תאים בעודם מתארגנים למבנים. מערכות תרבית בתלת-ממד אלו יספקו כלים בעלי ערך לניתוח מולקולרי של צמיחת רקמות.

a-method-for-ovarian-follicle-encapsulation-culture-proteolytically

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

התרבות של תאים נורמליים בהקשר שלהם תלת ממדי מייצג שיטה חלופית לחקור אירועים מוקדם נדרש שינוי tumorigenesis הסלולר. שיטה זו משמשת לגדול השחלות נורמלי תאים oviductal ללמוד האירועים מוקדם להיווצרות סרטן השחלות.

אלגינט הידרוג לתרבות תלת ממדי איברים של השחלות Oviducts

סרטון וידאו זה מתאר את הפרוטוקולים לעטוף קומולוס-ביציות חזיריות (COC) בחרוזי פיברין-אלגינט כדי לבסס תרבית תלת-ממדית. מערכת הבשלה חוץ-גופית זו שומרת על תקשורת תקינה בין תאים, ומבטיחה הבשלת ביציות ושמירה על כדאיות.

תרבית תלת ממדית של COC חזירי: הליך לעטוף קומולוס קומוציטים קומולוס בחרוזי הידרוג'ל פולימריים פיברין-אלגינט

בסרטון זה אנו מתארים פרוטוקול לאנקפסולציה של ביציות חזיריות במיקרוביוריאקטורים הידרופוביים.

מערכת מיקרוביוריאקטור שיש נוזלי: פרוטוקול תרבית תלת ממדי לאנקפסולציה של ביציות חזיריות

פרוטוקול זה מתאר את התרבות העיקרית / שיתוף התרבות של רקמת השחלה עכבר, באמצעות השחלות מעכברים בילוד וזקיקים בשחלות בודדות מעכברים לפני גיל בגרות מיניים. טכניקות התרבות לתמוך בפיתוח באופן פיסיולוגי מאוד, המאפשר חקירה של ההשפעה של סוכנים חיצוניים בשחלה, ושל יחסי גומלין בין זקיקים בשחלות.

תרבות ושיתוף התרבות של עכבר שחלות וזקיקים בשחלות

מוצגים כאן שני פרוטוקולים לתחינה של ציטים שונים בתנאי תרבות תלת-מידוד. בתחילה, קומפלקסים cumulus-oocyte (COCs) הם עטוף חרוזים fibrin-אלגינט. בשנייה, הם מוקפים פלואורציה אתילן פרופילן אבקת חלקיקי (microbioreactors). שתי המערכות מבטיחות תנאים אופטימליים לשמירה על ארגון תלת-מיוד.

הידרוג'לים אלג'ינאט מפורקים ופרוטאוליטית ומיקרוביו-סיבה לאנקלוסציה של פורצין אוציט

פרוטוקול זה מתאר מודל תרבית תלת מימדי חדש (3-D) המשתמש בהידרוג'ל היאלורונן המקושר לטירמין כדי לעטוף ולתרבית זקיקים פרה-אנטרליים משחלת העכבר. אנו מפרטים גם שתי גישות לשימור הקפאה של זקיקי השחלות על ידי ויטריפיקציה.

יישום של הידרוג'ל היאלורונן חדשני לתרבית זקיקים תלת מימדית ומתודולוגיה לשימור הקפאה של זקיקי שחלות עכבר

אנו מתארים שיטות לתרבית זקיקי שחלות בתבנית אגרוז חדשה ללא פיגומים המשלימים את הגמטוגנזה במבחנה .

ייצור ושימוש בתבניות אגרוז הניתנות להתאמה אישית לתרבית זקיקי שחלות עכבר ללא פיגומים

אנו מתארים שיטות לבידוד תאי סומטיקה של שחלות העכבר מחלק מועשר בסטרומה של השחלה וליצירת אורגנואידים סומטיים של שחלות העכבר בגישה ללא פיגומים.

חקירת מיקרו-סביבת השחלות: שיטות לבידוד, תרבית דו-ממדית ותרבות אורגנואידית של תאי סומטיקה בשחלות בעכברים

שיטה מתוארת להכנת מטריצה ​​3-ממדית המורכבת מסוג קולגן אני ופיברובלסטים אנושיים ראשוניים. ג'ל organotypic זה משמש כמצע שימושי להעריך נדידת תאים פולשניים כי זה מחק את התכונות בסיסיות של הרקמה סטרומה והוא נוח לצורות רבות של מיקרוסקופיה.

קולגן אני Assay Organotypic: פלטפורמה חשילה לבחינת התנהגות תא בהקשר 3-Dimensional

עצמית התאספו monolayers (Sams) נוצר זמן alkane thiols על שרשרת זהב לספק מוגדרים היטב מצעים ליצירת דפוסי חלבון תא הכליאה. הדפסה Microcontact של hexadecanethiol באמצעות חותמת (PDMS) polydimethylsiloxane ואחריו למלא את משבצות עם גליקול, הסתיים alkane תיאול מונומר מייצר דפוס שבו חלבונים בתאים לספוג רק לאזור hexadecanethiol חותמת.

יצירת דו מימדי מצעים Patterned עבור החזקת חלבון ו-Cell

למד שיטת אנקפסולציה לזקיקים שחלתיים ברשת תלת-ממדית של פיברין-אלגינט. טכניקה זו תומכת בהתבגרות ביציות בשמירה על אינטראקציות תאיות לחקר ביולוגיה רבייה.

שיטה Encapsulation השחלות זקיק ותרבות מערכת 3 מתכלה Proteolytically מימדי

גלה סרטונים נוספים