לא ניתוחי Intratracheal החדרה של עכברים עם ניתוח ריאות וניקוז ריאות בלוטות הלימפה על ידי זרימת cytometry

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להחדיר חומר לבדיקה לריאות של עכברים ללא התערבות כירורגית באמצעות מחט גבג' (gavage needle), ולאחר מכן לנתח את הריאות ואת קשרי הלימפה המנקזים מהריאות. הדבר מבוצע תחילה על ידי הכנסת לרינגוסקופ מאיר ומחט גבג' כפופה לקנה הנשימה של עכבר הרדום. לאחר מכן, חומר הבדיקה מוחדר לריאות החיה באמצעות הלרינגוסקופ ומחט הגבג'.

בשלב הבא, מוצאים את הריאות ואת קשרי הלימפה המנקזים. לבסוף, הריאות וקשרי הלימפה מעובדים לתליית תאים בודדים (single cell suspensions). בסיכומו של דבר, שיטה זו מאפשרת ניתוח של ציטומטריה זרימה (flow cytometric analysis) של הקשר בין חומר הבדיקה לתאי מערכת החיסון של הריאה, ושל נדידת התאים לקשרי הלימפה המנקזים של הריאה.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון חשיפה תוך-אפית או באמצעות אירוסול, הוא שהיא מאפשרת הובלה מ directed של חומר הבדיקה לתוך הריאות תוך עקיפה של הרקמה הלימפואידית הקשורה לאף. בנוסף, היא פשוטה לביצוע בהשוואה לניתוחים בחולדות לצורך הזרקה לקנה הנשימה. את הפרוצדורה ידגימו אליזבת אנטי, פוסט-דוקטורנטית במעבדתו של ריצ'י, ומנג'י, סטודנט לתואר מתקדם במעבדתו של לנס.

לאחר הרדמת העכבר, הכין את האינוקולום ב-50 µL של תמיסת סלין. מלא מזרק של 1 mL המצויד במחט גבג' (gavage) סטרילית ומעוקלת באינוקולום. טען את המזרק עם כיס אוויר של 100 µL מאחורי האינוקולום כדי להבטיח שכל הנוזל יוחדק לתוך הריאה.

הניחו את העכבר על הפלטפורמה מעץ בעלת הזווית, כך שיהיה תלוי על ידי שיניו החותכות על התיל, וקבעו אותו בעדינות במקומו בעזרת פיסת סרט. לאחר מכן, הדליקו ביד אחת את הלרינגוסקופ והשתמשו ביד השנייה כדי לתפוס צבת קהה. השתמשו בקצה הלרינגוסקופ ובצבת כדי לפתוח בעדינות את הפה.

משכו את הלשון החוצה והחזיקו אותה בצד. הנחו את להב הלרינגוסקופ לכיוון אחורי הפה. השאירו את הלרינגוסקופ לחוץ בעדינות רבה בזווית של 90 מעלות עד שפתח הקנה נראה לעין.

תוך כדי החזקת הלרינגוסקופ במקומו ביד אחת, קחו ביד השנייה את מזרק ה-1 mL המצויד במחט הגavage כפופה המכילה את האינוקולום. הכניסו את המחט לקנה הנשימה עד שהכיפוף במחט נמצא בגובה השיניים הקדמיות. דחפו את הבוכנה באופן אחיד כדי להעביר את האינוקולום ללא יצירת בועות.

שלפו את המחט מהקנה בהקדם האפשרי. החזיקו את העכבר במצב אנכי למשך מספר שניות כדי לאפשר את שאיפת האינוקולום לתוך הריאות. הניחו את העכבר ליד מנורת חימום והמתינו להתעוררותו.

לאחר ההמתה, מקבעו את זרועותיו ורגליו של העכבר ללוח נתיחה בעזרת סיכות. בצעו חתך לאורך מרכז הצד הוונטרלי בעזרת מספריים. משכו בעדינות את העור וחשפו את הפריטונאום.

בצעו חתכים בפריטונאום כדי לחשוף את איברי הבטן. אחזו בקצה העצם הסטרינלית באמצעות הפנפלס ונקבו את הסרעפת בעזרת המספריים. גזרו את הסרעפת לאורך דפנות כלוב הצלעות, כאשר המספריים מקבילות למשטח לוח הניתוח.

בצעו חיתוך דרך חלל בית החזה לאורך הקו הגבי-בטני (dorsa ventral line) משני הצדדים באופן קל. הרימו את כלוב הצלעות בצד ימין של הלב. חפשו שני קשרי לימפה ממש מתחת לטימוס.

קשרית לימפה שלישית, גדולה מעט יותר, ממוקמת מתחת לכלי דם עורקי קטן העובר בניצב לקנה הנשימה. יש לאסוף את קשריות הלימפה אל תוך 1 mL של תמיסה לעיכול קשריות לימפה, לערבב ולהניח על קרח. לאחר איסוף קשריות הלימפה, יש לאסוף את הריאות אל תוך פלטת 6 בארות.

תוך שמירת פלטת שש הבארות על קרח, שפו את ה-PBS וקצצו את האונות לחתיכות קטנות בעזרת פינצטה ומספריים. הצמידו כל קשריה לימפה באמצעות מחט 26 gauge והפרידו את הרקמה בעזרת מחט 26 gauge שנייה. כדי להבטיח שחרור של כל התאים, הוסיפו שלושה מיליליטרים של תערובת העיכול עבור הריאות ומיליליטר אחד עבור קשריה הלימפה.

לאחר דגירה של קשרי הלימפה למשך 25 עד 30 דקות, ושל הריאות למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 °C, הוסיפו EDTA עד לריכוז סופי של 10 mM לכל אחת מתערובות העיכול כדי לעצור את התגובה, ולאחר מכן הניחו אותן על קרח. בעזרת מזרק של 3 mL, העבירו חתיכות מהריאות דרך מחט במידה 18G. מעכו חלקי הריאות וקשרי הלימפה שלוש פעמים דרך מסנני תאים של 70 עד 100 micron.

בעזרת החלק האחורי של בוכנה ממזרק של 1 ml, שטפו את מסנני התאים עם 10 ml של HBSS ללא סידן ומגנזיום. סבבו את דגימות התאים ב-500 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C. השביתו את המשקעים ב-5 ml של בופר לליזה של תאי דם אדומים, והדגירו למשך שלוש דקות.

בטמפרטורת החדר, הוסיפו 10 milliliters של HBSS ללא סידן ומגנזיום כדי לעצור את הליזיס וסובבו את הדגימות בצנטריפוגה במהירות של 500 times gravity למשך חמש דקות. השלימו את תרחיפי התאים הבודדים מהריאות ומקשרי הלימפה המנקזים של הריאות לנפח של 10 milliliters ו-5 milliliters בהתאמה. השתמשו ב-trypan blue exclusion ובמערך ספירה של המוציטומטר (hemocytometer) כדי לספור את התאים.

בשתי איורים אלה, עכברי AJ נחשפו ל-1*10⁸ נגעי נבגי bacillus rassis, והריאות נותחו באמצעות פלואו-ציטומטריה 30 דקות לאחר ההדבקה. תרשימי הנקודות הללו מראים את אסטרטגיית הסינון (gating strategy). פאנלים אלו מראים את אחוז תאי הריאה החיוביים ל-CD 45 וחיוביים ל-CD 11 C שהם חיוביים לנבגי bacillus anthrax.

באיור זה, עכברי AJ קיבלו הזרקה תוך-קשית (intratracheally) ולאחר מכן נותחו קשרי הלימפה המנקזים את הריאות. תרשימי נקודות (dot plots) מייצגים מראים את אחוז התאים בעלי ביטוי גבוה של CD 11 C בקשרי הלימפה המנקזים את הריאות, המכילים חרוזי פלואורסצנציה, כאשר הם מופיעים מול ערוץ ריק. הפאנל השמאלי מציג תוצאות מעכברים שהוזרק להם PBS, והפאנל הימני מציג תוצאות מעכברים שהוזרקו להם 5×10⁹ מיקרוספירות צהובות-ירוקות זוהרות עם 10 µg של LPS.

שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום, כגון אילו אירועים מתחילים באופן ספציפי בריאות, וכיצד אנטיגנים שנשאפו מובלים מהריאות אל קשרי הלימפה המנקזים.