לא ניתוחי Intratracheal החדרה של עכברים עם ניתוח ריאות וניקוז ריאות בלוטות הלימפה על ידי זרימת cytometry
May 2nd, 2011
אנו מדגימים לא ניתוחי מסירה של חומרי הבדיקה לריאות של העכברים הרדים דרך קנה הנשימה. שיטה זו מאפשרת חשיפה הריאות לפתוגנים, ציטוקינים חיידקים ווירוסים, נוגדנים, חרוזים, כימיקלים, או צבעים. בנוסף, אנו מתארים קציר ועיבוד של הריאות ניקוז ריאה בלוטות לימפה (LDLNs) עבור cytometry הזרימה.
המטרה הכוללת של הליך זה היא עדיין לבדוק חומר ללא ניתוח לריאות של עכברים באמצעות מחט גבאז' ולאחר מכן לנתח את הריאות ובלוטות הלימפה המנקזות את הריאות. זה מושג על ידי החדרת לרינגוסקופ מאיר ומחט גבאז' מכופפת לקנה הנשימה של עכבר מורדם. לאחר מכן מוחדר חומר הבדיקה לריאות החיה באמצעות הגרון ומחט הגאווג'.
לאחר מכן, מוציאים את הריאות ובלוטות הלימפה המנקזות. לבסוף, הריאות ובלוטות הלימפה מעובדות לתרחיפים של תאים בודדים. בסופו של דבר, שיטה זו מאפשרת ניתוח זרימה ציטומטרי של הקשר של חומר הבדיקה עם תאי חיסון ריאות ושל העברת התאים לבלוטות הלימפה המנקזות את הריאות.
היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו חשיפות תוך-אף ואירוסול, הוא בכך שהיא מאפשרת אספקה מכוונת של חומר הבדיקה לריאות תוך עקיפת רקמת הלימפה הקשורה לאף. בנוסף, זה פשוט לביצוע בהשוואה לחולדות כירורגיות בהתקנת קנה הנשימה. מי שידגים את ההליך יהיו אליזבת אנטי, פוסט-דוקטורנטית במעבדה של ריצ'י, ומנג'י, סטודנטית לתואר שני במעבדת העדשות.
לאחר הרדמת העכבר, הכינו את החיסון ב -50 מיקרוליטר מי מלח. מלאו מזרק של מיליליטר אחד המצויד במחט כפופה סטרילית עם החיסון. טען את המזרק בכיס אוויר של 100 מיקרוליטר מאחורי החיסון כדי להבטיח שכל הנוזל מותקן בריאה.
הנח את העכבר על משטח העץ הזוויתי התלוי על ידי החותכות שלו על החוט ורסן אותו בעדינות במקומו בעזרת חתיכת סרט. לאחר מכן, הפעל את הגרון ביד אחת והשתמש ביד השנייה כדי לתפוס זוג מלקחיים קהים. השתמש בקצה הגרון והמלקחיים כדי לפתוח בעדינות את הפה בעזרת המלקחיים.
משוך את הלשון החוצה והחזק אותה בצד. הנח את להב הגרון לכיוון החלק האחורי של הפה. שמור על הגרון לחוץ בעדינות רבה בזווית של 90 מעלות עד שניתן לראות את פתח קנה הנשימה.
תוך כדי החזקת הגרון במקומו ביד אחת, קח ביד השנייה את מזרק המיליליטר המצויד במחט הגוואג' הכפופה המכילה את החיסון. הכנס את המחט לקנה הנשימה עד שהעיקול במחט נמצא ליד החותכות הקדמיות. דחוף את הבוכנה באופן שווה כדי לספק את החיסון מבלי לבעבע.
משוך את המחט החוצה מקנה הנשימה בהקדם האפשרי. החזק את העכבר זקוף למשך מספר שניות כדי לאפשר לשאוף את החיסון לריאות. הנח את העכבר ליד מנורת חימום ואפשר לו להתעורר.
לאחר המתת חסד הצמד את הידיים והרגליים של העכבר ללוח דיסקציה. בצע חתך באמצע הצד הגחוני בעזרת מספריים. משוך בעדינות את העור וחשוף את הצפק.
בצע חתכים על הצפק כדי לחשוף את איברי הבטן. החזק את קצה עצם החזה בעזרת המלקחיים ונקב את הסרעפת במספריים. חותכים את הסרעפת לאורך צידי כלוב הצלעות כשהמספריים מקבילים למשטח לוח הניתוח.
חותכים מעט את חלל בית החזה לאורך קו הגחון הדורסה משני הצדדים. הרם את כלוב הצלעות בצד ימין של הלב. ממש מתחת לבלוטת התימוס חפשו שתי בלוטות לימפה.
בלוטת לימפה שלישית מעט גדולה יותר ממוקמת מתחת לכלי דם עורקי קטן העובר בניצב לקנה הנשימה. קצרו את בלוטות הלימפה למיליליטר אחד של עיכול בלוטות הלימפה, ערבבו והניחו על קרח. לאחר קצירת בלוטות הלימפה, קצרו את הריאות לצלחת שש בארות.
שמירה על צלחת שש הבארות על קרח, שאפו את ה-PBS וקוצצים את האונות לחתיכות קטנות בעזרת מלקחיים ומספריים. החזק כל בלוטת לימפה כלפי מטה עם מחט בגודל 26 והקניט אותה עם מחט שנייה בגודל 26. כדי להבטיח את שחרור כל התאים, הוסף שלושה מיליליטר מתערובת העיכול לריאות ומיליליטר אחד לבלוטות הלימפה.
לאחר דגירה של בלוטות הלימפה במשך 25 עד 30 דקות, והריאות למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, הוסיפו EDTA לריכוז סופי של 10 מילימולר לכל אחת מתערובות העיכול כדי לעצור את התגובה ואז הניחו אותן על קרח. בעזרת מזרק של שלושה מיליליטר, העבירו חתיכות מהריאות דרך מחט בגודל 18. שלוש פעמים מועכים את חתיכות הריאות ובלוטות הלימפה דרך מסנני תאים של 70 עד 100 מיקרון.
בעזרת הקצה האחורי של בוכנת מזרק מיליליטר אחד, שטפו את מסננות התאים עם 10 מיליליטר HBSS ללא צנטריפוגת סידן ומגנזיום. התא דוגם בכוח הכבידה פי 500 במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. ריס מכופף את הכדורים בחמישה מיליליטר של כדוריות דם אדומות, חוצץ ודוגר במשך שלוש דקות.
בטמפרטורת החדר, הוסף 10 מיליליטר HBSS ללא סידן ומגנזיום כדי להרוות את צנטריפוגת הליזיס את הדגימות בכוח הכבידה פי 500 למשך חמש דקות. העלו את בלוטות הלימפה המנקזות את הריאה והריאות, תרחיפי תאים בודדים ל -10 מיליליטר וחמישה מיליליטר בהתאמה. השתמש בהדרה כחולה טריאם בציטומטר המו כדי לספור תאים.
בשני האיורים הללו, עכברי AJ אותגרו עם 10 פעמים 10 עד נבגי הבזיליות השמינית, והריאות נותחו על ידי זרימה ציטומטרית 30 דקות לאחר ההדבקה. תרשימי נקודות אלה מציגים את אסטרטגיית השער. פאנלים אלה מראים את אחוז תאי הריאה החיוביים ל-CD 45 חיוביים ל-CD 11 C חיוביים לנבגי בצילוס אנתרקס.
באיור זה, עכברי AJ הוזרקו תוך קנה הנשימה ולאחר מכן נותחו בלוטות הלימפה המנקזות את הריאות שלהם. תרשימי נקודות מייצגים מראים את אחוז התאים הגבוהים CD 11 C בבלוטות הלימפה המנקזות את הריאה המכילות חרוזים פלואורסצנטיים המשורטטים על תעלה ריקה. הפאנל השמאלי מציג תוצאות מעכברים שהוזרקו להם PBS, והפאנל הימני מציג תוצאות מעכברים שהוזרקו להם חמש פעמים 10 לתשע הפלורה, מיקרוספירות ירוקות צהובות בהירות עם 10 מיקרוגרם של LPS.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום, כגון אילו אירועים מתרחשים במיוחד בריאות, וכיצד אנטיגנים נשאפים נסחרים לבלוטות הלימפה המנקזות מהריאות.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מאמר זה מציג שיטה לא ניתוחית להעברת חומרי בדיקה לריאות של עכברים מורדמים דרך קנה הנשימה. הטכניקה מאפשרת חשיפה לחומרים שונים ומקלה על ניתוח עוקב של תאי החיסון בריאות.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- אימונולוגיה
- ביולוגיה נשימתית
רקע
- הבנת תגובות החיסון בריאות חיונית לפיתוח טיפולים.
- שיטות מסורתיות עשויות לכלול פרוצדורות פולשניות.
- טכניקה זו מאפשרת בדיקות בטוחות ויעילות יותר.
- ציטומטריית זרימה היא כלי מרכזי לניתוח אינטראקציות של תאי חיסון.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה לא ניתוחית לחשיפת הריאות לחומרי בדיקה.
- לנתח את הקשר בין חומרי בדיקה לתאי חיסון בריאות.
- לחקור את ההעברה של תאי חיסון לבלוטות הלימפה מנקזות הריאות.
שיטות ששימשו
- הכנסת לרינגוסקופ זורח ומחט גביי כופפת לקנה הנשימה.
- החדרת חומר בדיקה לריאות דרך הלרינגוסקופ.
- חילוץ הריאות ובלוטות הלימפה המנקזות.
- עיבוד הרקמות לתליית תאים בודדים לצורך ניתוח.
תוצאות עיקריות
- העברה מוצלחת של חומרי בדיקה שונים לריאות.
- הקלה על ניתוח ציטומטרי זרימה של תאי חיסון בריאות.
- תובנות לגבי ההעברה של תאי חיסון לבלוטות הלימפה.
- הדגמה של גישה לא פולשנית למחקרי ריאות.
מסקנות
- השיטה מספקת כלי חשוב למחקר ריאות.
- היא משפרת את ההבנה של תגובות החיסון בריאות.
- גישה זו עשויה להוביל לאסטרטגיות טיפוליות משופרות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This non-surgical intratracheal instillation method enables precise delivery of test materials directly to the lungs, bypassing upper respiratory tract confounders. It supports mechanistic de-risking in immunology and respiratory drug discovery by enabling quantitative analysis of antigen trafficking and immune cell engagement. The approach enhances predictive confidence in target validation and preclinical model relevance for inhaled therapeutics and vaccines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating lung-specific immune responses from nasal-associated lymphoid tissue interference.
- Operational Value: Provides reproducible delivery of antigens or compounds to lungs for consistent target engagement assessment.
- Predictive Value: Supports functional validation of targets involved in antigen presentation and T-cell activation pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable flow cytometry readouts of test material association with lung immune cells and trafficking to draining lymph nodes.
- Operational Value: Standardizes tissue processing into single-cell suspensions for high-throughput immunophenotyping.
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening of immunomodulators or vaccine candidates.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Models human lung antigen exposure and immune cell migration to lymph nodes for preclinical efficacy testing.
- Mechanistic De-risking: Clarifies causal relationships between lung exposure and immune activation, reducing ambiguity in target mechanism.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions based on quantitative immune trafficking data from lungs to lymph nodes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical immunology studies, particularly for inhaled biologics and small molecules.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of lung-specific immune initiation and pathway clarification of antigen-presenting cell activation.
- Screening: Enables assay standardization and reproducible quantitative outputs for comparing test material immunogenicity.
- Analytics: Delivers flow cytometry-based measurements of cell-associated antigen and trafficking kinetics to inform comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects lung immune events to preclinical validation via lymph node trafficking, supporting biomarker-aligned advancement.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable lung exposure platform across immunology, infectious disease, and respiratory therapy programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in lung immune responses.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and scalability of lung exposure and immune analysis workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality, capital efficiency, and reduces late-stage biological risk in immunology pipelines.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on lung-specific immune trafficking and target engagement data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse anesthesia, surgical preparation, and tissue dissection for consistent tracheal access.
- Dependent on laryngoscopy equipment, bent gavage needles, and sterile inoculation supplies for reliable delivery.
- Necessitates standardized tissue digestion and flow cytometry protocols across teams for reproducible immune profiling.
- Adaptation considerations include varying inoculum volumes and digestion times across mouse strains or disease models.
- Practical limitations include technical skill dependency for tracheal visualization and potential variability in inoculum distribution.
