Name: הזרקת אינסולין ו Extraction Hemolymph כדי למדוד את הרגישות לאינסולין אצל מבוגרים תסיסנית melanogaster /em (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: למד כיצד למדוד רגישות לאינסולין ב-Drosophila melanogaster מבוגרים באמצעות הזרקת אינסולין ואקסטרקציית המולימף. שיטה זו מאפשרת חקר מטבוליזם גלוקוז והבנת מנגנוני סוכרת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של NIA כדי YW.CF (AG21068, AG31086).

1. פתרון אינסולין הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן אינסולין טרי פתרון שור ידי המסת אינסולין PBS כדי להשיג את הריכוז של 0.01 מ"ג / מ"ל. שניהם אינסולין / PBS ושליטה פתרונות PBS חייב להישמר על הקרח לאורך הליך ההזרקה. פתרונות אלה צריכים להיות מוכנים עם 0.5% (V / V) FD &amp; C Blue לא. 1 מזון צביעה. </li></ol> 2. מחט הכנה הזרקת הקמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מחטים זכוכית נימי באמצעות puller.The micropipette הבאים הגדרות חולץ לייצר מחטים באיכות מספיק להזרקה: חום, 345; משוך, 210;, מהירות 100, זמן, 200 (100ms). מחטים משך טרי חייב להיות קהה על ידי לחיצה על קצה דרך רקמות Kimwipe. תהליך זה מסיר להקהות את חוד מוארך עמידות גבוהה ומייצרת טיפ יותר שמן עם נקבוביות בקוטר גדול יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום המחטים הקהה טיפ למעלה בצינור microcentrifuge המכיל את אינסולין / PBS פתרון או PBS לבד. נימי תוצאות הפעולה גב מילוי כל מחט. שים את קצה המחט תחת stereomicroscope, כדי לוודא ששום בועות אוויר פסולת או להופיע בקצה. מחק כל מחטים שלא למלא נקייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מלא מחטים לתוך מחזיק microinjector ידני מחט עמדת בעל מחט עם micromanipulator כך חוד המחט גלוי דרך stereomicroscope. להפעיל לחץ חיובי על הטור נוזל המחט על ידי סיבוב ידית ידנית מיקרומטר microinjector המצורפת הבוכנה על המזרק microinjector. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי הלחץ מספיק עקירה נוזל הוחל על ידי נגיעה Kimwipe אל קצה המחט, המאשר זרימת הנוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המחט הוכן הזרקה, להדביק תרשים כיול לפיר מחט עם סרט ברורה, ולהביא את קצה המחט אל המוקד באמצעות stereomicroscope בהגדלה 20X. </li></ol> 3. טוס הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עשרה ימים בת זבובים הנקבה משמשים לניסויים ההזרקה. איסוף זבובים בתוך 24 שעות של eclosion. הרדימי זבובים עם CO 2 humidified על כרית גז, למיין את הזכרים וזבובים המקום הנשי בתוך מבחנות המכילות סטנדרטי או דיאטה טיפול. שמור על זבובים הנשי על דיאטות ניסיונית למשך 10 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום העשירי לאחר eclosion והפרדה על דיאטות ניסיוני, העברת זבובים צלוחיות מזון המכילים שלהם בקבוקונים המכילים תקע 5 מ"ל של אגר 2% ולהרעיב אותם במשך 12-16 ח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת זבובים רעב בקבוקונים המכילים מסנני גלוקוז 10% ספוג שעה 1 לפני הזרקת אינסולין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה להרדים הזבובים עם 2 CO humidified לאחר האכלה גלוקוז ואז קר לשתק אותם על הקרח. </li></ol> 4. הזרקת נוהל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לתפוס זבוב קר משותק עם זוג מלקחיים בסדר להחזיק אותו קרוב קצה המחט, כך קצה צמוד באזור הקדמי של הצד השמאלי של בית החזה של הזבוב. תביאו גם את קצה המחט החזה של הזבוב אל המוקד תחת stereomicroscope. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להזיז את לעוף לכיוון קצה המחט כך חוד המחט נוגעת מרכז בליטה של ​​האזור prescutum השמאלי של בית החזה של הזבוב (איור 1). לאחר לטוס מכוונת כראוי מיושר עם קצה המחט, להמשיך לקדם את זבוב על המחט כך המחט נועצת את מרכז prescutum. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל לחץ חיובי כנדרש על ידי קידום על הבוכנה מזרק עם ידית micromanipulator של microinjector עד 0.1 μl של נוזל כבר מוזרק לטוס. זרם של נוזל לתוך hemocoel של הזבוב יהיה להקנות צבע כחול בצד שמאל של בית החזה הקדמי. לעיתים יש לחזור ולקדם מספר פעמים כדי לסלק כל חסימה קצה מחט ולאפשר זרימת הנוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר זבובים מוזרק להתאושש צלוחיות אגר 2% עבור נקודות זמן המיועד לפני מיצוי hemolymph. </li></ol> 5. Hemolymph אוסף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה להרדים זבובים עם CO 2 humidified במוצב הזרקת נקודות הרצוי בזמן כל עמדה לטוס הגב בצד למטה על קלטת דו צדדית מודבקת על פני השטח של כרית CO 2. סדר זבובים אפילו שורות עם קפסולות ראש מיושר. אפשר להשתמש במקל המוליך עץ גזומים ללחוץ כנפיהם לתוך דבק קלטת להבטיח immobilization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זבובים קבועים לקלטת, לתפוס חוטם כל זבוב עם מלקחיים בסדר בעדינות למשוך אותו לכיוון האזור הגחוני ואז האחורי של הזבוב, כך הקדמי של הקפסולה בראש גלוי מבעד למיקרוסקופ סטריאו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם היד השנייה ובזמן חוטם מחזיק בעמדה, לנקב את מרכז הקפסולה הראש מעל תפר ptilinal באמצעות מחט טונגסטן חדה (איור 2). יש להיזהר לא להכניס את המחט עמוק מדי כמו קל אגרוף קצה המחט דרך הצד השני של הקפסולה ראש ולאחר מכן לאבד גontrol של זרימת hemolymph. לנקב את כל הזבובים בקבוצה זריקה לפני איסוף hemolymph. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הקפסולה הראש כבר ניקב, השתמש במקל המוליך עץ גזומים בעדינות כדי להפעיל לחץ על הבטן של הזבוב. זה עשוי להיות מועיל לגלגל את לטוס מעל כך שהוא נשען על הצד הגחוני שלה כפי שאתה להפעיל לחץ. הליך זה יהיה לייצר טיפה של hemolymph מאתר הקפסולה ראש לנקב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגע קצה אחד של צינור microcapillary 1μl כדי אגל hemolymph המתעוררים מאתר הקפסולה ראש לנקב. Hemolymph ייכנסו לפעולה באמצעות צינור נימי. קבע ולהקליט את כמות hemolymph שנאספו על ידי בדיקת נוזל עמוד בתוך הצינור microcapillary נגד תרשים נפח בוגרת. </li></ol> 6. גלוקוז Hemolymph קביעת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצאת דגימות hemolymph לתוך microplate בארות המכיל 100 μl של גלוקוז מגיב אינפיניטי. שמור על צלחת על הקרח בעת טעינת דגימות hemolymph. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקמת עקומת סטנדרט ידי טעינת בנפרד 1 μl כל המניות של פתרונות גלוקוז ב 50mm, 25mm, 12.5mm, 6.25mM ו 3.125mM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי ספיגת ב 340 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשבון עבור נפח hemolymph אסף לקבוע ריכוז הגלוקוז מדגם המבוססת על עקומת רגיל עם ריכוזי הגלוקוז ידוע. </li></ol> 7. נציג תוצאות תגובה טיפוסית סבילות לאינסולין מזוהה האינסולין מוזרק זבובים היכן ירידה במחזור רמות הגלוקוז מזוהה 15 דקות לאחר ההזרקה. לעומת זאת, תגובה כזו לא ראיתי אצל זבובי PBS מוזרק (איור 3). זו התגובה סילוק הגלוקוז ההיקפי ממשיך להזריק אינסולין זבובים עד 30 דקות לאחר ההזרקה. אנו שגרתי לחלץ 0.2-0.5 μl של hemolymph לכל 4-5 זבובים בכל קבוצה ההזרקה. שלוש קבוצות הזרקת כלולים כל ניסוי. <img src="/files/ftp_upload/2722/2722fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. בצד שמאל של בית החזה תסיסנית מראה הכניסה מחט באתר (השתנה מ Demerec, 1950) 7. הכנס את המחט דרך מרכז prescutum על האזור הקדמי של הגב בצד שמאל של החזה. <img src="/files/ftp_upload/2722/2722fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. התצוגה פרונטלי של ראש תסיסנית מראה מיקום לנקב להפקת hemolymph (השתנה מ Demerec, 1950) 7. לנקב את הקפסולה עם ראש בדיקה טונגסטן חידד דק במרכז הקפסולה הראש מעל תפר ptilinal. <img src="/files/ftp_upload/2722/2722fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. אינסולין טיפוסי סובלנות בתגובה זוהה מבוגר לשלוט זבובים. בקרת זבובים w 1118 הוזרקו אינסולין שור (1 ננוגרם ב PBS) או PBS בלבד. זבובים בקבוצות לשכפל הורשו אז להתאושש במשך דקות 0, 15 או 30 רמות הגלוקוז במחזור נמדדו.

<ol><li>Rulifson, E. J., Kim, S. K., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+insulin-producing+neurons+in+flies%3A+growth+and+diabetic+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes.</a> Science. 296, 1118-1118 (2002).</li>
<li>Kim, S. K., Rulifson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+mechanisms+of+glucose+sensing+and+regulation+by+Drosophila+corpora+cardiaca+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conserved mechanisms of glucose sensing and regulation by Drosophila corpora cardiaca cells.</a> Nature. 431, 316-316 (2004).</li>
<li>Broughton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longer+lifespan%2C+altered+metabolism%2C+and+stress+resistance+in+Drosophila+from+ablation+of+cells+making+insulin-like+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Longer lifespan, altered metabolism, and stress resistance in Drosophila from ablation of cells making insulin-like ligands.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 3105-3105 (2005).</li>
<li>Haselton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+ablation+of+adult+Drosophila+insulin-producing+neurons+modulates+glucose+homeostasis+and+extends+life+span+without+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Partial ablation of adult Drosophila insulin-producing neurons modulates glucose homeostasis and extends life span without insulin resistance.</a> Cell Cycle. 9, 3063-3063 (2010).</li>
<li>Haselton, A. T., Fridell, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+Drosophila+melanogaster+as+a+model+for+the+study+of+glucose+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+%28Albany+NY%29%22%5BJournal%5D)">Adult Drosophila melanogaster as a model for the study of glucose homeostasis.</a> Aging (Albany NY). 2, 523-523 (2010).</li>
<li>Belgacem, Y. H., Martin, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+insulin+pathways+alters+trehalose+level+and+abolishes+sexual+dimorphism+in+locomotor+activity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Disruption of insulin pathways alters trehalose level and abolishes sexual dimorphism in locomotor activity in Drosophila.</a> J Neurobiol. 66, 19-19 (2006).</li>
<li>Demerec, M. Biology of Drosophila. , John Wiley & Sons. New York. (1950).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הטכניקה שתוארו בדו&quot;ח זה הוא שימושי באופן פוטנציאלי בכל מחקר החוקר תהליכים פיזיולוגיים וכתוצאה מכך לגילוי שינויים בהרכב hemolymph תסיסנית. על ידי שילוב של הזרקה ואיסוף hemolymph באופן זה, ניתן לקבוע את ההשפעות רלוונטי מבחינה פיזיולוגית מיידית של טיפול ניסיוני מניפולציה מסוימת. היתרון העיקרי של הטכניקה הזו &quot;הקזת דם&quot; באוסף hemolymph לעומת טכניקות קודמות מעורבים 2 עריפת ראש היא כי טכניקה זו ממזערת הזיהום של דגימות hemolymph עם בטן טיפול contents.If נ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב / ציוד </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> שור אינסולין </td><td> סיגמא </td><td> I5500 </td></tr><tr><td> אינפיניטי מגיב גלוקוז </td><td> Thermo Electron Corporation </td><td> TR1541 </td></tr><tr><td> ידני microinjector </td><td> סאטר Instrument </td><td></td></tr><tr><td> P-87 Flamming / בראון micropipette חולץ </td><td> סאטר Instrument </td><td></td></tr><tr><td> חבית בודדת נימי זכוכית בורוסיליקט </td><td> AM מערכות </td><td> 626000 </td></tr><tr><td> FD &amp; C Blue מס &#39;1 </td><td> מקורמיק &amp; Company </td><td></td></tr><tr><td> 1 צינורות microcapillary μl </td><td> דראמונד </td><td></td></tr><tr><td> שלושה צירים ידני micromanipulator ובסיס </td><td> העולם מכשירי דיוק </td><td></td></tr></tbody></table>

הזרקת אינסולין ו extraction hemolymph כדי למדוד את הרגישות לאינסולין אצל מבוגרים תסיסנית melanogaster</em

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

שימור מנגנוני חישה התזונתיים הקיימים בין יונקים זבוב הפירות שבו פפטידים הדומה אינסולין גלוקגון יונקים, בהתאמה פונקציה לשמור על הומאוסטזיס הגלוקוז 1,2 במהלך שלבי התפתחות הזחל. מחקרים בעיקר שלאחר mitotic זבובים בוגרים חשפו ההפרעות של הומאוסטזיס הגלוקוז כתוצאה אבלציה הגנטי של פפטיד דמוי אינסולין (ILP) לייצר תאים (IPCs) 3. לפיכך, זבובי פירות בוגרים לקיים הבטחה גדולה כמערכת מודל מתאים גנטי הפרעות מטבוליות, כולל סוכרת מסוג II. על מנת להמשיך ולפתח את המערכת זבוב הפירות, מבחני השוואה פיזיולוגית למדידת סבילות לגלוקוז והרגישות לאינסולין אצל יונקים יש להקים. לשם כך, יש לנו תיאר לאחרונה הליך חדשנית למדידת גלוקוז העמסת תגובה לטוס מבוגרים הראו את החשיבות של IPCs מבוגרים בשמירה על הומאוסטזיס הגלוקוז 4,5. הנה, יש לנו נוהל שונה שתואר קודם להזרקת אינסולין 6 בשילוב עם שיטת השאיבה רומן hemolymph למדוד את הרגישות לאינסולין הפריפריה הזבוב הבוגר. באופן ייחודי, פרוטוקול שלנו מאפשרת מדידות פיזיולוגיות ישירה של היכולת לעוף של מבוגר להיפטר עומס הגלוקוז היקפית על הזרקת אינסולין, מתודולוגיה שעושה את זה אפשרי לאפיין מוטנטים אינסולין איתות התערבויות העשויים להשפיע על הסבילות לגלוקוז והרגישות לאינסולין הזבוב הבוגר.

איתות אינסולין נשמרת המסלולים נמצא זבוב הפירות<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; להפוך את האורגניזם כלי פוטנציאל דוגמנות והפרעות מטבוליות כולל סוכרת מסוג II. לשם כך, חיוני להקים מבחני פיזיולוגיים ביעילות למדוד את פעילות האינסולין מערכתי סילוק הגלוקוז הפריפריה הזבוב הבוגר.

הזרקת אינסולין ו Extraction Hemolymph כדי למדוד את הרגישות לאינסולין אצל מבוגרים תסיסנית melanogaster</em

מנגנונים שמורים של חישת רכיבי תזונה קיימים בין יונקים לזבוב הפירות, כאשר פפטידים הדומים לאינסולין ולגלוקגון של יונקים, בהתאמה, מתפקדים...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא למדוד את השפעותיה של אינסולין מוזרקת על רמות הגלוקוז בהמולימפה של זבובים בוגרים מסוג drosophila melanogaster. דבר זה מושג תחילה על ידי מתן תמיסת גלוקוז רכזת לבליעה עבור זבובים שהורעבו. השלב השני של הפרוצדורה הוא הזרקת אינסולין לזבובים שהוזנו בגלוקוז.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא איסוף דגימת המולימפה שאינה מזוהמת. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא קביעת ריכוז הגלוקוז בהמולימפה. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות כי אינסולין אקסוגני מקדם פינוי גלוקוז ב-Esof la Melan gaster באמצעות ספקטרומטריה.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון דימום באמצעות עריפת ראשים בבוגרים, הוא שההליך זה ממזער את תכולת המעי. זיהום של דגימת ההמולימפה. אספו את הזבובים תוך 24 שעות מהחסימה על ידי הרדמתו באמצעות פחמן דו-חמצני מלחח. מינו את הזבובים הנקבות והניחו אותם במבחנות המכילות תזונה סטנדרטית.הניחו לזבובים להזדקן במשך 10 ימים. לאחר 10 ימים, העבירו את הזבובים למבחנות המכילות פקק של 5 ml של 2% agarose והרעיבו אותם למשך 12 עד 16 שעות. לפני הזרקת האינסולין, העבירו את הזבובים המורעבים למבחנות המכילות נייר סינון ספוג ב-10% glucose למשך שעה אחת. להכנת תמיסת האינסולין להזרקה, המססו bovine insulin ב-phosphate buffered saline עד לריכוז סופי של 0.01 mg/mL.הכינו בנוסף תמיסת ביקורת המכילה PBS בלבד. הוסיפו צבע מאכל כחול הן לתמיסת האינסולין והן לתמיסת הביקורת עד לריכוז סופי של 0.5%, ושמרו את שתי התמיסות על קרח לאורך כל הפרוצדורה. השתילו את קצותיהן של מחטי זכוכית שנמשכו זה עתה על ידי לחיצה עליהן דרך נייר ניגוב מסוג Kim wipe.כדי ליצור חוד חסון עם קוטר פתח גדול יותר, הניחו את המחט הקה כאשר החוד פונה כלפי מעלה בתוך מבחנה למיקרוצנטריפוגה המכילה את תמיסת האינסולין או את תמיסת הביקורת, ואפשרו לפעולת נימיות למלא את המחט לאחור. בדקו כל מחט לאיתור בועות תחת מיקרוסקופ סטריאו והשליכו כל מחט שלא התמלאה באופן נקי. הכניסו את המחטים המלאות למחזיק המחטים של המיקרו-מזרק הידני ומקמו את המחזיק באמצעות מיקרו-מניפולטור כך שחוד המחט יהיה גלוי תחת מיקרוסקופ סטריאו.הפעיל לחץ חיובי על עמוד הנוזל במחט על ידי סיבוב כפתור המיקרומטר המחובר לבוכנה במזרק המיקרו-הזרקה. הצמד נייר ניגוב למעבדה (chem wipe) לקצה המחט כדי לוודא שיש לחץ מספיק לזרימת הנוזל. לאחר שהמחט הוכנה להזרקה, הצמד טבלת כיול לגוף המחט בעזרת סרט שקוף והבא את קצה המחט למצב פוקוס באמצעות מיקרוסקופ סטריאו בהגדלה של 20x.הרדמו קצרות את הזבובים שהוזנו גלוקוז באמצעות פחמן דו-חמצני מוצמד ולחות, והניחו אותם על פד על קרח להמשך הרדמה תחת מיקרוסקופ סטריאו.דלפו זבוב באמצעות פינצטה עדינה והחזיקו אותו קרוב למחט כך שהקצה יהיה סמוך לאזור הקדמי של הצד השמאלי של הזבוב. התאימו את המיקוד כך שגם קצה המחט וגם החזה של הזבוב יהיו במיקוד.הזז בעדינות את הזבוב לעבר קצה המחט כך שקצה המחט יגע במרכז הבליטה של אזור ה-presum השמאלי של הזבוב. המשך להניע את הזבוב קדימה על המחט כך שהמחט תחדור למרכז ה-presum. הפעל לחץ חיובי על ידי דחיפת בוכנת המזרק באמצעות כפתור המיקרו-מניפולטור של המיקרו-אינז'קטור עד ל-0.1.מיקרוליטר של תמיסת אינסולין או של תמיסת הביקורת הוזרקו לזבוב. ההזרקה תעניק גוון כחול לצד השמאלי של החזה הקדמי. יש לאפשר לזבובים המוזרקים להתאושש ב-2% Aros בקבוצות חזרות למשך אפס, 15 ו-30 דקות לפני מיצוי ההמולימפה; הצמידו פיסת סרט דביק דו-צדדי לפד הפחמן הדו-חמצני לצורך התזמון.הרדימו את הזבובים מקבוצת הביקורת וסדרו אותם על הסרט כאשר צדם הגבי (dorsal) פונה כלפי מטה, בשורות שוות כאשר קפסולות הראש שלהם מיושרות. לאחר שהזבובים מקובעים לסרט, אחזו בבוז (proboscis) של הזבוב באמצעות פינצטה עדינה ומשכו אותו בעדינות לכיוון האזור הבטני (ventral) ולאחר מכן לאזור האחורי (posterior), כך שחלקו הקדמי של קפסולת הראש יהיה גלוי. תוך כדי החזקת הבוז במקומו, נקבו את קפסולת הראש מעל התפר הלנאלי (lenal suture) באמצעות מחט טונגסטן חדה, תוך הקפדה לא לדקור את הראש עד למעבר מלא.לאחר שכל הזבובים נדקרו, השתמשו במקל אפליקטור מעץ מקוצץ כדי להפעיל לחץ עדין על בטנו של הזבוב. פעולה זו תגרום להופעת טיפה קטנה של hemolymph באתר הדקירה של קפסולת הראש. געו עם קצהו של צינור מיקרו-קפילרי של 1 µL בטיפת ה-hemolymph.קבעו ורשמו את כמות ההמולימפה שנאספה על ידי בדיקת עמודת הנוזל בתוך צינור המיקרו-קפילריה אל מול טבלת נפחים מדורגת; באמצעות ספקטרופוטומטר, מדדו את הבליעה באורך גל של 340 nanometers וקבעו את ריכוז הגלוקוז, כאשר זבובים שהוזרק להם תמיסות אינסולין בקר (bovine insulin) הראו רמות גלוקוז נמוכות יותר בהמולימפה בנקודות הזמן של 15 ו-30 דקות לאחר ההזרקה בהשוואה לזבובים שהוזרקה להם תמיסת ביקורת. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו מזריקים נפחים קטנים של תמיסה לזבובי דרוזופילה (drosophila) בוגרים, כיצד מחלצים המולימפה מזבובי דרוזופילה בוגרים, וכיצד קובעים את ריכוז הגלוקוז בהמולימפה של זבובי דרוזופילה בוגרים לאחר ביצוע הליך זה.ניתן לבצע ניסויים נוספים, כגון קביעת ריכוז חלבונים וקביעת ריכוז טריגליצרידים בהימולימפה, כדי לענות על שאלות כגון: כיצד משפיע אינסולין על היבטים קשורים של מטבוליזם של חומרים מזינים ב-drosophila בוגרת?

insulin-injection-hemolymph-extraction-to-measure-insulin-sensitivity

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Hemocytes תסיסנית לפזר מעל מכלול של העובר המתפתח. פרוטוקול זה מדגים כיצד הר התמונה באמצעות העברות אלה עוברים עם hemocytes שכותרתו fluorescently.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

סרטון זה מתאר כיצד לבצע הזרקה של זבובים בוגרים חיים וכולל פרוטוקול לדוגמה שבו חלקיקים מסומנים וטריפאן כחול מוזרקים בבטן הזבוב כדי להעריך פגוציטוזה.

הזרקה של זבובי דרוזופילה בוגרים: שיטה של משלוח תרכובת או תווית

המולימפה של דרוזופילה משמשת הן כדם והן כנוזל אינטרסטיציאלי, המסתובב בכל הגוף במהלך שלבי הזחל והבוגרים. סרטון זה מתאר פרוטוקול לאיסוף המולימפה של הזחלים על מנת לכמת את התאים במחזור.

הפרעה בקוטיקולה: שיטה לאיסוף המולימפה מזחלי דרוזופילה

מאמר זה מתאר שיטה למדידת חמצון דלק ב-Drosophila melanogaster שבה כמויות זעירות של מצעים מטבוליים ספציפיים המסומנים ברדיו מוזנות לזבובים. ה-CO2 הנשוף המסומן ברדיו שהוא מיוצר מחמצון דלק נאסף ונמדד.

מדידת ייצור פחמן דו-חמצני מן radiolabeled מצעים ב<em&gt; תסיסנית</em

בדיקת FEeder (CAFE) היא שיטה פשוטה, ידידותית לתקציב ואמינה ביותר לחקירת מנגנונים העומדים בבסיס צריכת מזון. בשימוש עם אורגניזם המודל הגנטי הרב-תכליתי Drosophila melanogaster, הוא מספק אמצעי רב עוצמה להשגת תובנות חדשות לגבי מנגנוני ויסות צריכת מזון.

את assay נימי מזין מודד צריכת המזון ב<em&gt; תסיסנית</em

שיטה זו מדגימה כיצד להמחיש הפתוגן הפלישה לתוך תאים חרקים עם דגמים תלת ממדיים (3D). Hemocytes של הזחלים דרוזופילה נדבקו בנגיף פתוגנים נגיפי או חיידקי, או vivo לשעבר או ויוו. Hemocytes נגוע היו לאחר מכן קבועה, צבעונית עבור הדמיה עם מיקרוסקופ קונפוקלי, עוקבות שיחזור תאי תלת-ממד.

החילוץ של Hemocytes של הזחלים דרוזופילה melanogaster זיהום מיקרוביאלי וניתוח

מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור ex-vivo סידן הדמיה של המוח דרוזופילה . בשיטה זו, תרכובות טבעי או סינתטי ניתן להחיל את המאגר כדי לבחון את היכולת שלהם להפעיל את המסוים הנוירונים במוח.

לשעבר Vivo הדמיית סידן להמחשת התגובות המוח איתות האנדוקרינית ב דרוזופילה

פרוטוקול זה מתאר וזמינותו של phagocytosis ויוו ב מבוגרים דרוזופילה melanogaster לכמת פגוציט הכרה ואישור של זיהומים חיידקים.

הערכת התגובה החיסונית הסלולר של זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, שימוש ב Vivo Phagocytosis Assay

שלמות מכשול הדם במוח. היא קריטית לתפקוד מערכת העצבים בדרוזופילה מלאנוסטר, מכשול המוח בדם נוצר על ידי תאי גלאל במהלך הembryogenesis המאוחרות. פרוטוקול זה מתאר שיטות לטיפול בתפקוד ותחזוקה של מחסומי מוח בדם בד. מלאנוגסטר עוברים והזחלים השלישי.

שיטת שלמות המוח בדם בדרוזופילה מלאנוסטר

פרוטוקול זה מתאר בvivo של פאיגוציטוזה המשמש להערכת ולכמת את היכולת של דרוסופילה מלאנוזוזה בגיל צעיר ומיושן לחיידק הפאגוציטוז.

הערכת היכולת הייחודית ביותר לגיל מיוחד למבוגרים דרוזופילה מלאנוטציטים באמצעות שיטת בVivo פגוציטוזה

זבובים בוגרים של Drosophila melanogaster נוצלו בהרחבה כאורגניזמים מודל כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס התגובות החיסוניות המולדות של המארחים ואסטרטגיות זיהום מיקרוביאליות. כדי לקדם את שלב הזחלים D. melanogaster כמערכת מודל נוספת או חלופית, מתוארת טכניקת הזרקת זחלים.

Drosophila melanogaster פרוטוקול הזרקת זחלים

למד כיצד למדוד רגישות לאינסולין ב-Drosophila melanogaster מבוגרים באמצעות הזרקת אינסולין ואקסטרקציית המולימף. שיטה זו מאפשרת חקר מטבוליזם גלוקוז והבנת מנגנוני סוכרת.

הזרקת אינסולין ו Extraction Hemolymph כדי למדוד את הרגישות לאינסולין אצל מבוגרים תסיסנית melanogaster

גלה סרטונים נוספים