Name: שיטות להעריך מתווכת בטא מוות של תאים על ידי לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: חקור שתי שיטות מעבדה להערכת הרג תאי בטא פנקריאטיים על ידי לימפוציטים T ציטוטוקסיים מסוג CD8+. השיטות כוללות מבחן שחרור כרומיום 51 ודימות תאים חיים לצפייה בזמן אמת במוות של תאי בטא.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות DK074656 ו AI56374 (CEM), כמו גם את הקרן למחקר סוכרת נעורים.

1. הכנת התאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא היעד תרבות: תרבות של בטא עכבר שורות תאים, ניט-1 ו אנבה-4, היה 1,2 תיאר בעבר DMEM בתוספת 10% FBS, BSA 0.02%, שאינן חיוניות חומצות אמינו, 15mm HEPES, 16.5mM Glocose ו פניצילין / סטרפטומיצין. במשך 51 תיוג Cr, בתאי הזרע צלחת שטוחה לתחתית-96 גם בתרבות ב 5X10 4 תאים / טוב בינוני 200 μl תרבות. עבור מיקרוסקופיה ניסויים בתאי הזרע 8-היטב Lab-טאק II החדרים coverglass ב 5x10 4 לכל תא בינוני 500 μl תרבות, ולאפשר לגדול במשך 48 שעות לפני השימוש בניסויים cytotoxicity. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקרת קו T תרבית תאים: השתמש שורת תאים Jurkat (ATCC, CD3 + תא אנושי קו לימפוציטים) כביקורת שלילית. Jurkat התרבות תאים RPMI1640 בתוספת 10% FBS, 2 מ"מ L-גלוטמין, 1.5 גר '/ L סודיום ביקרבונט, HEPES 10 מ"מ 1.0 נתרן pyruvate מ"מ. </li></ol> 2. אוסף והפעלה של מפעיל autoreactive CD8 + T תאים NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4a] ו NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4b] נרכשו מן המעבדה ג'קסון (בר הרבור, ME) ו העכבר הוליד במתקן שלנו. הצאצאים היברידית F1 מ הזדווגויות של NOD-AI4a עם NOD-AI4b [NOD-AI4a / b] לפתח סוכרת ב 3-5 שבועות. כל העכברים שוכנו הפתוגן ללא מתקנים ספציפיים שאושרו על ידי טיפול בבעלי חיים של מוסד רלוונטי ועדת שימוש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים 3-4 בן שבוע NOD-AI4a / b בעכברים באמצעות ה-CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף spleens מעכברים. בעכברים מורדמים מוכנים עם תרסיס אתנול ופתח מתחת למכסה המנוע כירורגית. Spleens יוסרו לשים חיץ קרים כקרח HBSS מיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים הטחול באמצעות 7 מ"ל זכוכית homogenizer. שניים עד שלושה spleens כל שמים 5 מ"ל של HBSS קר הומוגני עם 7 מ"ל זכוכית homogenizer. Homogenate נאסף centrifuged ב 1200rpm במשך 5 דקות ב 4 ° C באמצעות צנטריפוגות Sorvall RT7 +. כדורי תא נאספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כדוריות הדם האדומות באמצעות טיפול פתרון hypotonic. פתיתי מטופלים עם 5 מ"ל hypotonic פתרון / הטחול על קרח למשך 5 דקות, ואז לנטרל על ידי הוספת נפח שווה של HBSS. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה, כאמור לעיל, ו resuspend ב 50 HBSS מ"ל. Pass התאים מושעה דרך מסננת התא לספור באמצעות hemocytometer עם מכתים TrypanBlue. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעלת התאים. תאים Resuspend ב 5x10 6 / mL ולהפעיל באמצעות התרבות 3 יום עם 0.1 מיקרומטר AI4 mimotope (רצף החומצות האמיניות YFIENYLEL) ו 25 U / mL IL-2 ב RPMI1640 בתוספת 10% FBS, 2 מ"מ L-גלוטמין, 1.5 גר '/ L סודיום ביקרבונט, HEPES 10 מ"מ 1.0 נתרן pyruvate מ"מ. </li></ol> 3. Assay 51 Cr לשחרר לבחון CML <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היעד תאים לייבל: הוסף 51 Cr למקד תאים ב 1 μCi / היטב בתרבות במשך 3 שעות, 3 פעמים ולשטוף עם המדיום לתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות מפעיל תאים במדיום 1640 RPMI כאמור בשלב 2.5 כך הנפח הסופי נוספו גם כל 200 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף הסופי של התאים היעד שכותרתו, להוסיף תאים מפעיל מופעל על התא תרבויות היעד ב מפעיל הרצוי היעד (E: T) יחסי. אנחנו בדרך כלל להשתמש E: יחסי T על 0.4:1, 01:01, 02:01, 05:01, 10:01, 20:01 ו - 50:1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טרי שונה RPMI 1640 בינוני (ראה שלב 2.5) עד 6 בארות של תאים מטרה לשמש שליטה תמוגה ספונטנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיתוף התרבות תאים מפעיל היעד במשך 16 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף supernatant ב 6x50 מ"מ צינורות זכוכית ליים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse תאים על ידי הוספת SDS 2% 100μl ו pipetting מספר פעמים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף lysate תא קבוצה נוספת של 6x50 מ"מ ליים צינורות זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בארות פעם עם נקי H 2 O ולהוסיף את לשטוף את הצינורות lysate התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרוזן supernatants ו lysates תא באמצעות מונה גמא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב תמוגה ספציפיים כדלקמן: <img src="files/ftp_upload/2724/2724eq1.jpg" alt="משוואה 1"></li></ol> 4. מכתים של תאים עבור דימות תא חי בין הנפוצות ביותר צבעים קרום המיטוכונדריה פוטנציאל, תערוכות TMRM את הרעילות לפחות המיטוכונדריה. 3 לפיכך, אנו בוחרים TMRM אלה בדיקות הדמיה לחיות התא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 40 המניות mM פתרון TMRM ב DMSO ולאחסן ב -20 ° C. הפוך [25 nM] פתרון עובד טרי פנול אדום ללא DMEM עם כל תוספי לתרבות ניט 1 תא 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם היעד ניט-1 תאים עם TMRM 25 ננומטר למשך 30 דקות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את התקשורת עם התקשורת טרי המכיל 5 nM TMRM לשמור על חלוקת משקל של 4 צבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרוזן מופעל מפעיל AI4 בתאי T באמצעות hematocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם מופעל מפעיל AI4 בתאי T עם μl 1 / mL Picogreen עבור5 דקות בטמפרטורת החדר לשטוף עם פנול אדום ללא בינוני תרבות 3 פעמים. </li></ol> 5. הערכת תא T לימפוציטים בתיווך מוות בטא באמצעות דימות תא חי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר coverglass החדרים עם תאים ניט מוכתם על הבמה של מיקרוסקופ LSM 510 Zeiss confocal. הסר את הכרטיסייה עם dremmel וגז לעקר את הכוס החדרים עם תחמוצת etheline. השלב מצויד תא חי תא הדמיה כי יש טמפרטורה מבוקרת על 37 ° C ו 5% CO 2 עם לחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מופעל בתאי T מוכתמות לתאי המיועד ב E שונים: יחסי טי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוסף אותו מספר של תאים Jurkat מוכתם לתאי הבקרה. </li></ol> 6. קבלת תמונות תא חי המיקרוסקופ מצויד הבמה ממונע שאפשר לנו שוב ושוב לרכוש תמונות במקומות שונים מתאי זהה או שונה באופן אוטומטי במשך זמן הניסוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות עדשה שמן 63x אובייקטיבי, לקחת תמונות בהפרש של כל 3 דקות עבור סכום כולל של 300 מסגרות לשנייה מיקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי מכתים TMRM באמצעות גל עירור באורך של 543 ננומטר להגדיר מסנן פליטה 565-619 ננומטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי מכתים Picogreen באמצעות עירור 488 ננומטר ומערכת סינון עבור פליטת 500-630 ננומטר. הסרטון נוצר באמצעות תוכנה Zeiss LSM. </li></ol> 7. וידאו המרה לפרסום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתוכנה LSM Zeiss, ליצור קובץ דחוס סרט בפורמט AVI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמיר את הוידאו לפורמט שפורסם, לייבא את הווידאו לתוך חבילת תוכנה פיג'י ( <a href="http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji">http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji</a> ), ImageJ ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info. nih.gov / ij /</a> ) הפצה, באמצעות תוסף Bioformats מ לוקוסים ( <a href="http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats">http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats</a> ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הגדרות הבהירות והניגודיות כדי לאזן את אותות ירוק ואדום ואת מסגרת הדולר נקבע 2 מסגרות / שנייה באמצעות תפריט אפשרויות אנימציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך את הווידאו 512 x 512 פיקסלים ולייצא כקובץ לא דחוס אבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח קובץ AVI ב Quicktime תוכנה 7 (Apple Computer, בקופרטינו, קליפורניה) ו לדחוס ולייצא את פורמט קובץ פתוח וידאו H264/MPEG-4 ב 1200 kbs / שנייה. </li></ol> 8. נציג תוצאות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התוצאה נציג assay 51 CML Cr. איור 1 מציג תוצאה נציג assay CML שם תמוגה אחוז מסוים (ציר Y) מגדילה את מפעיל: יחס יעד (ציר X) עולה. תאים היעד העיקרי הם איים מבודדים NOD immunodeficient Rag1-/ -. עכברים שכותרתו עם 51 Cr. Splenocytes מן העכברים הטרנסגניים NOD.AI4α / β מבודדות הופעל כמתואר בשלב 2 לעיל. מטרות effectors היו שיתוף תרבותי במשך 16 שעות. תמוגה אחוז מסוים מחושב כמתואר צעד 3.11 לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני (חיוביות ושליליות) נציג תוצאות של תא בתיווך T בטא פיזור קרום התא המיטוכונדריה פוטנציאל מוצגים. תאים הם מוכתמים ותגובות נרשמות כמתואר 4 שלבים, 5 ו -6 לעיל, קבצי וידאו נוצרים כמו בשלב 7. וידאו 1: בטא עכבר התא קו ניט-1 היה מוכתם פוטנציאל קרום המיטוכונדריה TMRM צבע (אדום). הופעל, autoreactive CD8 + T התא AI4 (ירוק ויטראז עם Picogreen) היו שיתוף תרבותי עם אלה ניט-1 תאים ב E: T יחס של 50:1. ניט-1 פוטנציאל קרום המיטוכונדריה התפוגגה בהדרגה במהלך משך 400 דקות, אבל רק אשכולות שהיו באינטראקציה עם AI4 ותאי T. וידאו 2: כמו בניסוי שליטה, ניט-1 תאים הוכתמו TMRM ושיתוף בתרבית עם תאים Picogreen Jurkat מוכתם ב E: T יחס של 50:1. תאים Jurkat הם קו התא האנושי T כי היא MHC תואמים. ניט-1 התאים נשמר פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה במהלך כל תקופת 400 דקות שיתוף תקופת הדגירה. תאים Jurkat לא אינטראקציה עם ניט-1 אשכולות ולכן, לא לגרום הרג. </li></ol><img src="files/ftp_upload/2724/2724fig1.jpg" alt="איור 1"> איור 1 תוצאה נציג CML כמו איים באמצעות תאים היעד העיקרי שבודד immunodeficient NOD.Rag1-/ -. עכברים splenocytes מן העכברים הטרנסגניים NOD.AI4α / β. מטרות effectors היו שיתוף תרבותי במשך 16 שעות. תמוגה אחוז מסוים מגבירה את מפעיל: יחס מגביר יעד. 1. בטא עכבר וידאו התא קו ניט-1 היה מוכתם הקרום המיטוכונדרי פוטנציאל TMRM צבע (אדום). הופעל autoreactive CD8 + T התא AI4 (ירוק ויטראז עם Picogreen) היו שיתוף תרבותי עם אלה-1 ניט תאים ב E: היחס T של 50:1. ניט-1 המיטוכונדריה פוטנציאל הממברנה dissipaטד בהדרגה במהלך משך 400 דקות, אבל רק אשכולות שהיו באינטראקציה עם ירוק AI4 ותאי T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2724/video.mov">לחץ כאן כדי לצפות בווידאו</a> . וידאו 2. אנבה-1 התאים היו מוכתמים אותו כמתואר וידאו 1 ושיתוף תרבותי עם Picogreen Jurkat מוכתם האדם קו T התא. ניט-1 התאים היו מסוגלים לשמור על פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה מחשבה משך 400 דקות. תאים Jurkat לא אינטראקציה עם ניט-1 אשכולות ולכן לא לגרום הרג. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2724/Video2.mp4">לחץ כאן כדי לצפות בווידאו</a> .

<ol><li>Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIT-1%2C+a+pancreatic+beta-cell+line+established+from+a+transgenic+NOD%2FLt+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse.</a> Diabetes. 40, 842-849 (1991).</li>
<li>Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mt-Nd2a+modifies+resistance+against+autoimmune+Type+1+diabetes+in+NOD+mice+at+the+level+of+the+pancreatic+beta+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell.</a> Diabetes. , (2010).</li>
<li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophys J. 76, 469-477 (1999).</li>
<li>Lemasters, J. J., Ramshesh, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+mitochondrial+polarization+and+depolarization+with+cationic+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging of mitochondrial polarization and depolarization with cationic fluorophores.</a> Methods Cell Biol. 80, 283-295 (2007).</li>
<li>Abel, M., Krokowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+immune-mediated+%28type+1%29+diabetes+mellitus%3A+potential+for+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22BioDrugs%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of immune-mediated (type 1) diabetes mellitus: potential for immunotherapy.</a> BioDrugs. 15, 291-301 (2001).</li>
<li>Mathews, C. E., Graser, R. T., Savinov, A., Serreze, D. V., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unusual+resistance+of+ALR%2FLt+mouse+beta+cells+to+autoimmune+destruction%3A+role+for+beta+cell-expressed+resistance+determinants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Unusual resistance of ALR/Lt mouse beta cells to autoimmune destruction: role for beta cell-expressed resistance determinants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , 235-240 (2001).</li>
<li>Szabadkai, G., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+mediated+cell+death+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Mitochondria mediated cell death in diabetes.</a> Apoptosis. 14, 1405-1423 (2009).</li>
<li>Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+membrane+potential+%28deltapsi%28m%29%29+in+apoptosis%3B+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial membrane potential (deltapsi(m)) in apoptosis; an update.</a> Apoptosis. 8, 115-128 (2003).</li>
<li>Dudek, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T-cells+from+T-cell+receptor+transgenic+NOD8.3+mice+destroy+beta-cells+via+the+perforin+and+Fas+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T-cells from T-cell receptor transgenic NOD8.3 mice destroy beta-cells via the perforin and Fas pathways.</a> Diabetes. 55, 2412-2418 (2006).</li>
<li>Pakala, S. V., Chivetta, M., Kelly, C. B., Katz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+autoimmune+diabetes+the+transition+from+benign+to+pernicious+insulitis+requires+an+islet+cell+response+to+tumor+necrosis+factor+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">In autoimmune diabetes the transition from benign to pernicious insulitis requires an islet cell response to tumor necrosis factor alpha.</a> J Exp Med. 189, 1053-1062 (1999).</li>
</ol>

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי אוניברסיטת פלורידה Animal Care מוסדיים ועדת שימוש.

ציטוטוקסיות T בטא בתיווך התא מוות של תאים הוא פתופיזיולוגיה העיקרי של T1D 5. מבחני CML באמצעות שחרור 51 Cr לאפשר לנו ללמוד את מידת התגובה היעד מפעיל-6. עם זאת, תהליך מפורט מסלולים המוות T התא בתיווך תא הבטא עדיין לא הבינו באופן מלא. מאז המיטוכונדריה הן קריטיות לתפקוד התא בטא ומוות 7, התמקדנו שינויים המיטוכונדריה במהלך CML חזותית. פיזור מיטוכונדריאלי פוטנציאל הממברנה היא צעד מוקדם ובלתי הפיך במהלך שינויים פונקציונליים המיטוכונדריה המוביל ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> CR-51 </td><td> פרקין אלמר </td><td> NEZ030500IMC </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-60 </td><td></td></tr><tr><td> Tetramethyl Rhodamine מתיל אסתר (TMRM) </td><td> Invitrogen </td><td> T668 </td><td></td></tr><tr><td> Picogreen </td><td> Invitrogen </td><td> P7581 </td><td></td></tr><tr><td> AI4 mimotope </td><td> mimotopes.com </td><td> רצף חומצות אמינו: YFIENYLEL </td><td></td></tr><tr><td> IL-2 </td><td> R &amp; D </td><td> 485-MI </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11885 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> HyClone </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr><tr><td> שור סרום אלבומין </td><td> סיגמא </td><td> A8412 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Cellgro </td><td> 25-060-Cl </td><td></td></tr><tr><td> ממ שאינם חיוניים חומצות אמינו </td><td> GIBCO </td><td> 11140 </td><td></td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> מזל תאומים </td><td> 400-109 </td><td></td></tr><tr><td> פנול אדום ללא DMEM </td><td> סיגמא </td><td> D5303 </td><td></td></tr><tr><td> החממה CO2 </td><td> תרמו פישר </td><td> HeraCell 150i </td><td> שמרו סטרילי עבור תרבית תאים </td></tr><tr><td> בטיחות ביולוגית הממשלה </td><td> תרמו פישר </td><td> פורמה 1440 </td><td></td></tr><tr><td> תרבות צינורות פנויה, 6x50 מ&quot;מ זכוכית ליים </td><td> דיג </td><td> 14-958-A </td><td></td></tr><tr><td> גמא מונה </td><td> פרקין אלמר </td><td> אשף אוטומטי 1470 מונה גמא </td><td></td></tr><tr><td> Confocal מיקרוסקופ </td><td> Zeiss </td><td> LSM 510 Meta Confocal </td><td> עם הבמה ממונע תא תא חי </td></tr><tr><td> פיפטה (1ml, 200μl, 20μl, 10μl, 2μl) </td><td> Eppendorf </td><td></td><td></td></tr><tr><td> צינורות (אמבר) </td><td> דיג </td><td> 50819772 </td><td></td></tr><tr><td> סרכזת </td><td> Sorvall מקרא RT + </td><td> 75004377 </td><td></td></tr><tr><td> Hemacytometer </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 267110 </td><td></td></tr><tr><td> זקוף מיקרוסקופ </td><td> Zeiss </td><td> Axioskop40 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ עכברים </td><td> ג&#39;קסון מעבדה </td><td> 004347 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ עכברים </td><td> ג&#39;קסון מעבדה </td><td> 004348 </td><td></td></tr><tr><td> NOD-AI4α / עכברים F1 β </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Bred במתקן חיה UF </td></tr></tbody></table>

שיטות להעריך מתווכת בטא מוות של תאים על ידי לימפוציטים מסוג t ציטוטוקסיות

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

סוכרת מסוג 1 (T1D) הוא תא T בתיווך מחלה אוטואימונית. במהלך בפתוגנזה, חולים הופכים בהדרגה insulinopenic יותר כמו ייצור אינסולין הוא איבד, ככל הנראה זו תוצאה של הרס תאים בטא בלבלב על ידי ותאי T. הבנת מנגנוני מוות של תאים בטא במהלך הפיתוח של T1D יספק תובנות כדי ליצור תרופה יעילה למחלה זו. Cell בתיווך (CML) מבחני lymphocytotoxicity השתמשו בעבר כרום רדיונוקלידים 51 (51 Cr) לתייג התאים היעד. מטרות אלו נחשפים מכן מפעיל תאים ושחרור של 51 Cr מתאי המטרה היא לקרוא כאינדיקציה המוות הלימפוציטים בתיווך התא. מעכבי תוצאה של התא למוות לשחרר ירידה של 51 Cr. כמו תאים מפעיל, השתמשנו האוכלוסייה מופעל המשובטים autoreactive של CD8 + ציטוטוקסיות לימפוציטים מסוג T (CTL) מבודד מהונדס עכבר המניות אלפא וגם שרשראות בטא של קולטן T AI4 תא (TCR). הופעל AI4 בתאי T היו שיתוף תרבותי עם 51 Cr שכותרתו ניט תאים היעד במשך 16 שעות, שחרור של 51 Cr נרשמה לחשב תמוגה ספציפי המיטוכונדריה להשתתף באירועים רבים פיזיולוגיים חשובים כגון הפקת אנרגיה, ויסות איתות התמרה, ו אפופטוזיס. המחקר של בטא שינויים התא המיטוכונדריה תפקודית במהלך הפיתוח של T1D הוא אזור הרומן של המחקר. שימוש המיטוכונדריה פוטנציאל הממברנה לצבוע Tetramethyl Rhodamine מתיל אסתר (TMRM) הדמיה confocal מיקרוסקופיים תא חי, אנחנו במעקב פוטנציאל קרום המיטוכונדריה לאורך זמן בתור תא בטא ניט-1. עבור בדיקות הדמיה, מפעיל AI4 בתאי T תויגו עם פלורסנט גרעיני מכתים צבע Picogreen. ניט-1 ותאי T היו שיתוף בתרבית החדרים coverglass ועלה על הבמה מיקרוסקופ המצויד בתא תא חי, מבוקר על 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO 2, ו humidified. במהלך ניסויים אלה התמונות נלקחו של כל אשכול כל 3 דקות עבור 400 דקות. במהלך של 400 דקות, צפינו את פיזור פוטנציאל קרום המיטוכונדריה ניט-1 אשכולות התא שבו AI4 בתאי T צורפו. בניסוי שליטה בו זמנית איפה ניט-1 התאים היו שיתוף תרבותי עם MHC אי - התאמה האדם תאים לימפוציטים Jurkat, פוטנציאל ממברנת המיטוכונדריה נותרו על כנן. טכניקה זו ניתן להשתמש כדי לצפות בזמן אמת שינויים בפוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה בתאים תחת מתקפה של לימפוציטים, ציטוקינים ציטוטוקסיות, או ריאגנטים ציטוטוקסיות אחרות.

Cell בתיווך (CML) מבחני lymphocytotoxicity ניתן להשתמש כדי לבדוק את התגובות autoreactive מנגנוני המחקר של מוות של תאים במבחנה. עם זאת, שימוש לחיות תאים confocal טכניקות הדמיה מיקרוסקופית עם צבעי ניאון, סוג קינטיקה של מוות של תאים, כמו גם את המסלולים מנוצל ניתן ללמוד ביתר פירוט.

שיטות להעריך מתווכת בטא מוות של תאים על ידי לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיות

סוכרת מסוג 1 (T1D) היא מחלה אוטואימונית המתווכת על ידי תאי T. במהלך הפתוגנזה, המטופלים הופכים למחסורתיים יותר באינסולין ככל שהאינסולין...

סוכרת מסוג 1 היא מחלה אוטואימונית שבה תאי בטא בלבלב, המפרישים אינסולין, מושמדים על ידי תאי T אוטוריאקטיביים. הבנת המנגנונים המעורבים תספק תובנות לפיתוח מרפא יעיל למחלה זו. כאן מוצגות שתי שיטות לצפייה בתהליך השמדה של תאי בטא בלבלב in vitro המתווך על ידי תאי T חיוביים ל-cd8: בדיקת ציטוטוקסיות לימפוציטרית המתווכת על ידי תאים (CML) המבוססת על כרום 51 ובדיקת CML ויזואלית לשתי השיטות.תאי T effector חיוביים ל-CD8 מוכנים תחילה מטחלי עכבר לביצוע בדיקת CML. תאי בטא מטרה מסוג knit one או knit four מסומנים ב-chromium 51 ומגודלים יחד עם תאי effector. כאשר תאי הבטא מטרה נהרגים, ה-chromium 51 משתחרר. לאחר מכן נאספים העל-נוזלים (supernatants) והליסאטים של התאים, ורמות הרדיואקטיביות המעידות על היקף מוות התאים נמדדות באמצעות מונה גמא. לביצוע בדיקת CML ויזואלית, תאי בטא מטרה מסוג Knit one ו-knit four מסומנים בצבע פוטנציאל מיטוכונדריאלי TM RM, ותאי effector מסומנים ב-pico green.התאים משולבים ומבוצע דימוי של תאים חיים כדי לבחון את קצב מוות התאים, המודגם על ידי התפזרות הפוטנציאל של ממברנת המיטוכונדריה. היתרון העיקרי של בדיקה זו על פני בדיקות מסורתיות, כגון בדיקת שחרור כרום, הוא היכולת לצפות במוות של תאי בטא בזמן אמת. יתרונות נוספים כוללים את היכולת לקבוע האם מוות של תאי בטא המתווך על ידי תאי CD8 T תלוי במגע, וכן ניתן להרחיב בדיקה זו באמצעות אינדיקטורים פלואורסצנטיים כדי למפות את מסלולי מוות תאי הבטא.שיטה זו יכולה להשיב על שאלות מפתח בפתוגנזה של כל מחלה שבה תאי T ציטוטוקסיים ממלאים תפקיד. ההשלכות של טכניקה זו פונות לכיוון הטיפול ואולי אף לאבחון, מכיוון שתפקוד מיטוכונדריאלי חיוני הן להישרדות תאי בטא והן לפיזיולוגיה שלהם. ג'ינג צ'ן ואני נדגים הליך זה.התאים המטרות המשמשים בהדגמה זו הם קווי תאי בטא של עכבר, knit one ו-knit four. קו תאי לימפוציטים אנושיים CD3+ המשמשים כביקורת שלילית אינם מזהים ואינם הורגים תאי בטא של עכבר. התאים האפקטוריים המשמשים כאן הם תאי T autoreactive CD8+ שהופקו מהטחול של עכברי nod AI four alpha beta F1 בני שלושה עד ארבעה שבועות. כדי להשיג את התאים, התחילו בהנחת הטחול במערבל דהומה (Dounce homogenizer) זכוכית של 7 ml המכיל 5 ml של HBSS קר. הומוגניזו את הטחול באמצעות מערבל דהומה, לאחר מכן העבירו את תרחיף התאים לפרועת קונית וסובבו בצנטריפוגה ב-250 Gs למשך חמש דקות. לאחר הסבב, השליכו את הנוזל העליון. כדי להסיר את כדוריות הדם האדומות, השביו את המשקע ב-5 ml של תמיסה היפוטונית עבור כל טחול. דגרו למשך חמש דקות על קרח.לאחר הדגירה, שטפו את משקע התאים פעמיים עם 10 milliliters של HBSS קר במיגירה באמצעות צנטריפוגה. בין כל שטיפה, השעיקו מחדש את התאים ב-10 milliliters של HBSS קר. לאחר מכן, השתמשו בהמוסייטומטר לספירת התאים, ולאחר מכן קבעו את מספר התאים.סבב שוב בצנטריפוגה, לאחר מכן השהה מחדש את התאים ב-RPMI 1640 מועשר בריכוז של 5×10⁶ תאים למילליליטר. זרע את התאים בריכוז של 5×10⁶ למילליליטר בבקבוק T 75. לבסוף, כדי להפעיל את התאים, הוסף לבקבוק AI4 myope ו-IL2 בריכוזים סופיים של 0.1 µM ו-25 units/mL בהתאמה. הדגר את הבקבוק באינקובטור 5%CO2 בטמפרטורה של 37 °C למשך שלושה ימים. ניתן כעת להשתמש בתאים המופעלים עבור בדיקת CML מבוססת ACROMIUM 51 או עבור בדיקת CML ויזואלית.בדיקת הציטוטוקסיות הלימפוציטרית התלויה בתאים (CML) המוצגת כאן משתמשת בשחרור של chromium 51 מתאי מטרה כאינדיקטור למוות של תאי בטא המתווך על ידי CD8. כדי לסמן תאי בטא מטרה מסוג knit one או knit four ב-chromium 51, התחילו בזריעתם בצפיפות של 5×10⁴ תאים לבאר בלוח של 96 בארות, ב-200 µL של DMEM מועשר; דגרו ב-37 °C ו-5% CO2 למשך 24 שעות. למחרת, דללו chromium 51 ב-DMEM מועשר לריכוז של 1 µCi ל-20 µL.בשלב הבא, הוסף 20 µL של כרומיום 51 מדולל לכל באער המכילה את תאי בטא המטרה, כדי להגיע לריכוז של 1 µCi לבאער. הנח את הפלטה באינקובטור לח עם טמפרטורה של 37 °C ו-5%CO2 והדגר למשך שלוש שעות לאחר האינקובציה. שאב את המצע ושטוף את התאים שלוש פעמים עם מצע תרבית טרי.בשלב הבא, הוסף מצע לתאי האפקטור המופעלים החיוביים ל-CD8 כך שהנפח הסופי שיתווסף לכל באר יהיה 200 µL. שלב את תאי האפקטור עם תרביות תאי בטא מטרה ביחסי E:T הרצויים; לצורך הכנת בקרות ליזיס ספונטני, נעשה שימוש ביחסים של 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1 ו-0.25:1. הוסף מצע טרי לשישה בארות של תאי בטא מטרה.לאחר מכן, העבירו את הפלטה לאינקובטור ובצעו תרבית משותפת (co-culture) של תאי effector ותאי target למשך 16 שעות. למחרת, השתמשו בפיפט רב-ערוצי כדי להעביר את הנוזל העליון (supernatant) לשש מבחנות זכוכית של 50 מילימטר. לאחר מכן, כדי לlysis את התאים, הוסיפו לפלטה 100 µL של 2% SDS ובצעו פיפטור עדין למעלה ולמטה מספר פעמים.העבירו את ליסאט התאים לסדרה חדשה של שש מבחנות זכוכית בנפח 50 מילימטר. לאחר מכן, כדי להבטיח שכל ליסאט התאים נאסף, העבירו באמצעות פיפטינג (pipette up and down) 100 µL של מים סטריליים לכל באר והוסיפו אותם למבחנות ליסאט התאים כדי לקבוע את מידת ההרס של תאי הבטא. מדדו את הרדיואקטיביות בסופרנטנט ובליסאט באמצעות מונה גמא לאחר ביצוע הספירות.קבעו את הליזיס הספציפי על ידי חיסור אחוז הספירות במעלי-סמיכיות (supernatants) של בקרת ליזיס ספונטני מאחוז הספירות במעלי-סמיכיות של הדגימות הניסיוניות, כפי שמוצג במשוואה זו. לבחינת מוות של תאי בטא המתווך על ידי תאי T בזמן אמת. פוטנציאל ממברנת המיטוכונדריה מנוטר באמצעות דימוי תאים חיים של תרביות משולבות של תאי מטרה ותאי אפקטור.כדי להכין את הדגימות למיקרוסקופיה, זרע תאי בטא מטרה על כיסוי זכוכית עם שמונה תאים, שעבר מודיפיקציה וסטריליזציה, בריכוז של 5×10⁴ תאים לכל תא. הנח את השקופיות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2, ואפשר לתאים לגדול במשך 48 שעות. ביום הניסוי, הוסף את הצבע למדידת פוטנציאל ממבנה המיטוכונדריה, tetraethylrhodamine methyl ester (TMRM), בריכוז 25 nM, בתוך מצע DMEM מועשר וללא phenol red, והדגר במשך 30 דקות.לאחר שצבעו את התאים ב-TMRM, החליפו את המצע במצע טרי המכיל חמישה nanomolar TMRM כדי לשמור על התפלגות שיווי המשקל של הצבע. לאחר מכן, ספרו את תאי ה-effector AI four T הפעילים או את תאי הבקרה jerk it באמצעות המוציטומטר (hemocytometer) וסספנדו מחדש את התאים ב-DMEM מועשר ללא phenol red בתוך מבחנות קוניות של 15 milliliter בריכוז המתאים. לאחר מכן, הוסיפו pico green לתאי ה-effector הפעילים או לתאי הבקרה jerk it עד לריכוז סופי של one microliter ל-milliliter.עטפו את המבחנה בנייר אלומיניום כדי להגן עליה מאור, ולאחר מכן דגרו למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר לאחר הדגירה. שטפו את התאים שלוש פעמים על ידי הוספת DMEM ללא phenol red, ערבוב קצר וסבב בצנטריפוגה ב-250 GS למשך חמש דקות. כדי לאסוף את התאים לצורך דימוי, הניחו את שקופית התא (chamber slide) על השולחן של מיקרוסקופ קונפוקאלי המצויד בשולחן ממוטור and בתא דימוי לתאים חיים עם לחות ב-37 °C ו-5% CO2.הוסיפו לתאים את תאי האפקטור המופעלים שצבעו ב-pico green לתאים ביחס האפקטור למטרה (ET ratio) המיועד לבדיקה. יחס ה-ET שצולם הוא 50 ל-1; הגדירו את תוכנת הדימות לאסוף תמונות מארבעה בארות, עם שלושה מיקומים בכל בארה, בכל שלוש דקות, עם 300 פריימים למיקום, תוך שימוש בערכות המסננים המתאימות עבור TMRM ו-Pico Green. לאחר איסוף כל התמונות, יש להמיר אותן לצורך פרסום.Fiji ו-Image J משמשים עם תוסף bio formats מבית loci. פרטים נוספים בנוגע להמרת וידאו ניתן למצוא בטקסט הכתוב הנלווה. בדיקה של ציטוטוקסיות לימפואידית ממתווכת-תאים, או בדיקת CML, בוצעה באמצעות chromium 51 כפי שמתואר בסרטון זה.כפי שמוצג כאן, אחוז הליזיס הספציפי המוצג בציר Y עולה ככל שיחס effector ל-target המוצג בציר X עולה. כדי להעריך מוות תאי באמצעות דימוי תאים חיים, קו תאי הבטא של עכבר knit one נצבע בצבע פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלית TMRM המוצג באדום; תאי T חיוביים ל-CD8 אוטוראקטיביים מופעלים I four נצבעו בירוק באמצעות pico green, ושני סוגי התאים תורבדו יחד ביחס E to T של 50 ל-1, כפי שניתן לראות כאן. הפוטנציאל הממברנלי המיטוכונדריאלי של knit one התפזר בהדרגה במהלך משך זמן של 400 דקות, אך רק בצבירים שהיו באינטראקציה עם תאי T של AI four בירוק. כניסוי בקרה, תאי knit one צבועים תורבדו במקום זאת עם תאי T אנושיים מסוג jerk שאינם תואמי MHC וצבועים ב-pico green, כפי שניתן לראות כאן.תאי Knit one הצליחו לשמור על פוטנציאל ממברנת המיטוכונדריה לאורך משך של 400 דקות. תאי Circuit לא ביצעו אינטראקציה עם צבירי Knit one ולכן לא גרמו להריגה. לאחר השליטה בתהליך.טכניקה זו אורכת כחמישה ימים, כולל הכנת התאים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של האופן שבו פוטנציאל ממב círculo של תאי בטא משתנה כאשר הם תחת התקפה של תאי T autoreactive. זכרו כי עבודה עם רדיו-איזוטופים עלולה להיות מסוכנת, ויש להסמיך על הכשרה מתאימה ולנקוט באמצעי זהירות בעת ביצוע הליך זה.

methods-to-assess-beta-cell-death-mediated-by-cytotoxic-t-lymphocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

Assay שחרור הכרום, assay משותף לאיתור פעילות תא T ציטוטוקסי, יש מספר מגבלות. השימוש באנטיגן ספציפי CD8 תאי T וקו האנושי של סרטן שד גידול, SKBR3, במאמר הנוכחי, גישה מבוססת עכבה נבדקה ליכולת של גילוי הרג תא.

קביעת פעילות ציטוטוקסית אופטימלית של CD8 תאי T ספציפי אדם Her2neu על ידי השוואת Assay שחרור Cr51 למערכת xCELLigence

הסרטון מציג בדיקה מבוססת ציטומטריה של זרימה להערכת דומיננטיות חיסונית בלימפוציטים ציטוטוקסיים מסוג T או בתגובות CTL. תאי מטרה פלואורסצנטיים מוזרקים מציגים פלואורסצנטיות משתנה המתאימה לאפיטופים אימונוגניים. איסוף ומיון לאחר הטחול חושפים ירידה בתאים פלואורסצנטיים בעוצמה גבוהה, מה שמאשר דומיננטיות חיסונית בתגובות CTL.

בדיקה להערכת דומיננטיות חיסונית בתגובות לימפוציטים ציטוטוקסיים מסוג T

סרטון זה מדגים שיטה מבוססת הדמיה לדמיין תאי בטא מושתלים המבטאים לוציפראז בעכבר שאינו סובל מהשמנת יתר. הכנסת טחול מעכבר סוכרתי מובילה להרס מתקדם של תאי בטא, המאושר חזותית על ידי ירידה בעוצמת האור לאחר החדרת המצע.

הדמיה של תאי בטא טרנסגניים בעכבר מדוכא חיסון המאותגר בטחול סוכרתי

פרוטוקול זה מתאר בדיקת ציטוטוקסיות רגישה מבוססת תאים. על ידי ספירת הירידה בתדירות של תאי CD4+ T מטרה חיים בנוכחות מספר הולך וגדל של תאי CD8+ T אפקטיביים, בדיקה זו מאפשרת הערכה ישירה של הפעילות הציטוליטית של תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן.

בדיקת ציטומטריית זרימה מבוססת תאים למדידת פעילות ציטוטוקסית

היכולת לעקוב אחר תגובות תא T בפירוט in vivo היא חשובה לפיתוח ההבנה של התגובה החיסונית שלנו. כאן אנו מתארים את השימוש במערכי ניאון יעד (FTAs) בin vivo assay תא T שמעריך&gt; 250 פרמטרים בו זמנית על ידי cytometry זרימה.

השימוש במערכי יעד פלורסנט להערכה של תגובות תא T<em&gt; בvivo</em

נתאר כאן פרוטוקול לחקור cytotoxicity של טרום הופעל CD8+ T תאים נגד תאים סרטניים על ידי גילוי אפופטוטיים להיפגע סרטן תאים באמצעות בזמן אמת מיקרוסקופ. פרוטוקול זה יכול לחקור מנגנונים מאחורי מיאלואידית הנוצרות על-ידי תאי T cell דיכוי והערכת תרכובות שמטרתה חידוש תאי T באמצעות המצור של תאים חיסוניים מיאלואידית מדכאים.

זיהוי בזמן אמת של הגידול Vitro תאים אפופטוזיס שנגזרות CD8+ T תאים ללמוד פונקציות החיסונית מדכא גידולים הסתננות התאים מיאלואידית

אנו מתארים כאן הזרימה cyvivo try מבוסס בתוך שיטת ההרג המאפשרת לבדוק את החיסונית של האימונוטוקסיט T לימפוציטים (CTL) התגובות של הגידול מודל אנטיגן. אנו מספקים דוגמאות לאופן השימוש בבחינה אלגנטית זו למחקרים מכניסטיים ולבדיקת יעילות בסמים.

תפירה Vivo ציטורעילות Assays ללמוד אימונומימינינס ב-CD8 התגובות הספציפיות לגידול של תאים

מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור הדור של תאים CD8 T ספציפיים אנטיגן, ואת התרחבות שלהם בתוך מבחנה, עם מטרה של מספר גבוה מניב של תאי T פונקציונלי לשימוש מבחנה ובvivo.

יעילות גבוהה הדור של העכבר העיקרי של אנטיגן בתאי T ציטוטוקסיים לבדיקות פונקציונליות במודל סוכרת אוטואימוניות

פרוטוקול זה מתאר את הדור כירורגי של גידולים הלבלב אורתודפית ואת העיכול המהיר של גידולים מבודדים מבודד מורטין הלבלב. לאחר העיכול, אוכלוסיות קיימא תאים החיסונית יכול לשמש ניתוח נוסף במורד הזרם, כולל לשעבר גירוי vivo של תאים T לאיתור ציטוקינים תאיים ידי הזרימה cy, try.

הדור של הלבלב אורתוטואט גידולים ואפיון Vivo Ex של תאים הסתננות של הגידול תא T

מחקר זה משתמש בסמנים מבוססי פלואורסצנטיות מרובי כתמים של מוות תאים ואפופטוזיס בשילוב עם מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להעריך אפופטוזיס המושרה על ידי ציטוקינים ומוות ספציפי לתאי β באיי הלבלב. הוא חושף שינויים מרחביים וזמניים במוות תאים ואפופטוזיס בתגובה לגירויים חוץ-תאיים.

טיפול באי לבלב מבודד ומדידת אפופטוזיס

חקור שתי שיטות מעבדה להערכת הרג תאי בטא פנקריאטיים על ידי לימפוציטים T ציטוטוקסיים מסוג CD8+. השיטות כוללות מבחן שחרור כרומיום 51 ודימות תאים חיים לצפייה בזמן אמת במוות של תאי בטא.

שיטות להעריך מתווכת בטא מוות של תאים על ידי לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיות

גלה סרטונים נוספים