Name: תא חי סידן הדמיה בשילוב עם השתקת siRNA מתווכת גין מזהה Ca 2 + ערוצי דליפה בקרום ER ו מנגנוני ויסות שלהם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 40 s
Description: חקור מנגנוני ויסות של ערוצי דליפת סידן ברשתיתיתית תוך שימוש בהשתקת siRNA ודימוי תאים חיים. השיטה מאפשרת ניתוח חלבוני ממברנה בסביבתם הטבעית ללא טיהור.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SL נתמך על ידי מענק של DFG (בית הספר למוסמכים מחקר 845). עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של DFG (SFB 530/C1 &amp; עבור 967) ועל ידי HOMFOR.

1. ההכנה של פתרונות מניות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן סידן ללא חיץ (140 mM NaCl, KCl 5 mM, 1 mM MgCl 2, 0.5 mM EGTA, 10 גלוקוז מ"מ 10 mM HEPES-KOH, (pH 7.35)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Solubilize FURA 02:00 ב-DMSO להשיג 1 מניות פתרון מ"מ. מערבבים בעזרת מערבולת עד הפתרון הוא צהוב בהיר homogenously. הגן על כוס מן האור. לדלל את FURA, 02:00 פתרון המניה שונה לתוך 1 מ"ל של נשר Dulbecco בינוני (DMEM) המכיל 10% בסרום שור העובר (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין לריכוז סופי של 4 מיקרומטר לטעינה של תאים הלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 12.5 mM puromycin מניות פתרון במים מזוקקים (pH 7.0). חנות aliquots ב -20 ° C. לדלל את puromycin 12.5 mM מניות פתרון במאגר סידן ללא ריכוז סופי של puromycin 500 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים thapsigargin ב DMSO לקבל 1 במלאי פתרון מ"מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Solubilize 1 מ"ג ophiobolin בכלורופורם 20 μl, ולאחר מכן, לערבב עם DMSO 25 μl. צינור microcentrifuge נשאר פתוח עד כלורופורם הוא התאדה. כך ophiobolin הסופי הריכוז הוא 100 מ"מ. חנות aliquots ב -20 ° C. לפני השימוש, לדלל פתרונות מניות למאגר, סידן חופשי ריכוז סופי של 100 מיקרומטר. לפיכך, הריכוז הסופי DMSO הדמיה תא חי אינו עולה על 0.1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים trifluoperazine ב DMSO לריכוז של 10 מ"מ aliquots חנות ב -20 ° C. מדולל פתרונות מניות למאגר, סידן חופשי ריכוז סופי של 10 מיקרומטר לפני השימוש. לכן ריכוז DMSO הסופי הדמיה תא חי, כמו עבור ophiobolin, אינו עולה על 0.1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את siRNAs (SEC61A1 siRNA, SEC61A1 UTR-siRNA ו siRNA שליטה) במים RNase חינם להכין 20 המניות פתרון מיקרומטר. מערבבים בעזרת מערבולת ולבחון solubilization לפי העין. חנות 50 aliquots μl ב -20 ° C. </li></ol> 2. Gene השתקה בתאים הלה על מנת לחקור את התרומה של חלבון מסוים ER Ca 2 + בזרימת, הגן בהתאמה יש השתיק ביעילות עם שני siRNAs שונה (איור 1). בנוסף, את ההשפעה של השתקה יש להתגבר על הביטוי של הגן סוג בהתאמה בטבע. בדרך כלל אנו משתמשים siRNAs כי מכוונים נגד קידוד ללא קידוד (UTR) באזור, בהתאמה, של הגן של עניין. העסקת UTR מכוונת siRNA מספקת דרך נוחה השלמה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Seed 5.2 x 10 5 הלה תאים (ATCC לא. CCL-2) בצלחת תרבות 6 ס"מ עם תלוש 25 מ"מ המכסה (טרום שטופלו 200 μl של פולי-L-ליזין (1 מ"ג / מ"ל) עבור 1 ח) ב שונה Dulbecco הנשר בינוני (DMEM) המכיל 10% בסרום שור העובר (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין ו לדגור על 37 ° C בסביבת humidified עם 5% CO 2 (נפח סופי 3.9 מ"ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect התאים עם SEC61A1 siRNA, SEC61A1 UTR-siRNA, או siRNA שליטה שלילי באמצעות HiPerFect מגיב בהתאם להוראות היצרן (הריכוז הסופי של siRNA: 20 ננומטר). בקיצור, להכין siRNAs טרי צינור microcentrifuge נפרד לפני הליך transfection בפועל: הוסף 20 μl transfection מגיב HiPerFect ל μl 4 של siRNA כל (20 מיקרומטר), כי הוא מומס 80 μl של OptiMEM. תערובת זו vortexed בעדינות מודגרות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. מוסיפים את תערובת siRNA (104 μl) dropwise של 5.2 seeded x 10 5 תאים הלה (3.9 מ"ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות, שנה את בינונית (3.9 מ"ל) ו transfect התאים בשנית עם תערובת siRNA זהה (104 μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכת ההשתקה על ידי ניתוח כתם המערבי. זה צריך להיות מעל 80%. שטפו תאים בצלחת תרבית תאים של פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) וקציר אותם DMEM. ספירת התאים על ידי העסקת מונה אוטומטי הרוזנת Cell. Lyse התאים חיץ תמוגה התא (10 mM NaCl, 10 mM טריס-HCl, pH 8.0, 3 מ"מ MgCl 2, 0.5% NP40) בתוספת קוקטייל פרוטאז-מעכב (3 מיקרוגרם / מ"ל Pepstatin, 3 מיקרוגרם / Leupeptin מ"ל, 3 מיקרוגרם / מ"ל ​​Antipain, 3 מיקרוגרם / Chymastatin מ"ל) ומערבבים עם חיץ SDS-המדגם (60 מ"מ טריס-HCl, pH 6.8, SDS 2%, גליצרול 10%, 5% β-mercaptoethanol, 0.01% bromphenol כחול ) על מנת לקבל ריכוז סופי של 10.000 תאים / μl. דגימות מחממים על 56 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולאחר מכן, להוסיף קצת גלאס חרוזים מערבולת של 20 דקות ל-DNA שבר. Μl 20 נפרדת של כל דגימה על ידי Laemmli מסוג SDS-PAGE (בדרך כלל 15% polyacrylamid עבור ג'ל המפריד). העברת חלבונים מופרדים על ידי קרום PVDF electroblotting ("כתם רטוב") בשעה mA 400 קבוע למשך 3 שעות או לילה חיץ העברה (100 מ"מ Glycin, 12.5 מ"מ טריס-HCl). לאחר מכן, בלוק עם 5% (w / v) נמוך חלב מיובש שומן PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן לחשוף את הכתם על הנוגדן הראשוני כנגד הסופית-C של Sec61α מ ארנב אנטי β-אקטין הנוגדנים מהעכבר. לשטוף את כתם ב-PBS TritonX-100 (0.05%) ו-twice ב PBS 5 דקות, בהתאמה. דמיינו את הנוגדנים ראשוני באמצעות ECL Plex עזים נגד ארנב IgG-Cy5 או ECL עזים אנטי עכבר Plex IgG-Cy3-המצומד ומערכת טייפון-Trio הדמיה בשילוב עם תמונה קוואנט TL תוכנה 7.0. במקרה של הגן SEC61A1, אפקט השתקה מקסימלית נתפסת בדרך כלל 96 שעות לאחר transfection הראשונה. הניסוי נציג מוצג באיור. 2. </li></ol> 3. השלמה של תאים הלה על מנת להציל את הפנוטיפ של השתקה SEC61A1, cDNA SEC61A1 היה מוכנס לתוך האתר שיבוט מרובים (MCS) של האתר pCDNA3-פנימי ערך ריבוזומלי (IRES)-GFP-וקטור המכיל את ציטומגלווירוס (CMV) האמרגן, MCS, IRES, בתוספת חלבון fluoresecent ירוק (GFP) רצף קידוד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 48 שעות לאחר transfection siRNA הראשון, חילופי בינוני (3.9 מ"ל) בפעם השנייה ולהפוך את התאים עם וקטור או ריק או SEC61A1 ביטוי פלסמיד באמצעות Fugene HD על פי פרוטוקול של היצרן (יחס הסופי של וקטור Fugene HD הוא 4 מיקרוגרם וקטור 16 μl Fugene HD). בקיצור, להכין פלסמידים טרי צינור microcentrifuge נפרד לפני הליך שינוי: הוסף 16 μl מגיב Fugene HD טרנספורמציה ל 4 מיקרוגרם של כל פלסמיד זה מומס 80 μl של OptiMEM. מערבולת זו בעדינות לערבב דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. מוסיפים את תערובת פלסמיד (0.1 מ"ל) dropwise את seeded 5.2 x 10 5 תאים הלה (3.9 מ"ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 48 שעות של ביטוי פלסמיד, מנות תרבות כפוף מיקרוסקופ פלואורסצנטי לפני הדמיה סידן קציר. אם יש צורך להחליף DMEM ידי PBS עבור אותות הקרינה יותר טוב. הקלטת תמונות פלואורסצנציה על מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במצלמת CCD מקורר. יעילות טרנספורמציה ניתן לקבוע על ידי חלוקת מספר התאים המציגים GFP הקרינה על ידי תאים נספר במצב brightfield ויש מעל 80%. תוצאה אופיינית היא באיור. 3. </li></ol> 4. תא חי סידן הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני המדידה, להעביר את תלוש לכסות מצופה transfected תאים הלה צלחת נפרדת תרבות 3.5 ס"מ. טען את התאים עם 4 מיקרומטר FURA, 02:00 ב 1 מ"ל DMEM 45 דקות במהירות של 25 ° C ב 11,12 כהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן 25 מ"מ לכסות להחליק בתא מתכת iMIC ולשטוף תאים פעמיים דגירה של חיץ, סידן חינם (בכל פעם 300 μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל באיסוף נתונים על מיקרוסקופ iMIC צבעוני עם V על ידי מרגש לסירוגין 340 nm ו 380 nm ומדידת הקרינה הנפלטת ב 510 ננומטר (מערכת סינון: beamsplitter, 565 nm;, פולט ננומטר 605/70). לדוגמה תמונות המכיל 20-50 תאים / כל מסגרת 3 s. שיא FURA-2 אותות כמו יחסי F340/F380, שם F340 ו F380 מתאימות עוצמת הקרינה, הרקע מופחתים ב 340 ו 380 ננומטר, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דקות 1, לטפל בתאים עם puromycin (500 מיקרומטר) במאגר, סידן חופשי או עם חיץ זהה. לחילופין, לטיפול בתאים עם מעכבי מולקולה קטנה (כגון trifluoperazine 10 מיקרומטר או 100 מיקרומטר ophibolin) או עם חיץ סידן חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי מדידות ratiometric מבוצעות עבור 2 או 10 דקות, להוסיף thapsigargin (1 מיקרומטר) ולהמשיך את המדידות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של דבר, cytoslic [Ca 2 +] מוערך ממדידות יחס לפי שיטת כיול הוקמה. 2 ניתוח נתונים של Excel 2007 ומוצא 6.1. </li></ol> 5. נציג תוצאות: עד כה, אנו התייחס לשאלה האם ההשתקה של הגן SEC61A1 משפיע סידן (Ca 2 +) דליפה של ER (איור 1). הגן SEC61A1 הושתק על ידי שני siRNAs שונה בתאים הלה למשך 96 שעות. בעוד השתקה צמיחת תאים מושפע כמעט ואת הכדאיות, תחבורה חלבון לחדר מיון של חצי permeabilized תאים כמעט לחלוטין עכבות. יתר על כן, התאים השתיק SEC61A1 הושפעו קשות לגבי זליגת Ca + 2 מ ER. ההשפעה של השתקת הגן התהפכה על ידי הביטוי של הגן SEC61A1. לפיכך, Sec61 קומפלקסים שנמצאים בקרום ER של התאים בעלי הגרעין טופס Ca 2 + ערוצי דליפה כי ניתן לצפות לשחק תפקיד מכריע Ca 2 + הומאוסטזיס. עם זאת, נוכחות גדולה, נקבוביות המלאות במים עם חדירות יונים לא מבוקרת, כפי שנוצר על ידי Sec61 מתחמי בקרום ER, היה ברצינות להפריע לשחרור מוסדר של Ca 2 + מ לומן ER לתוך cytosol, מנגנון חיוני תאיים איתות. זיהינו מוטיב (רמ"א) calmodulin מחייב הסופית N-cytosolic של Sec61α יונקים כי CAM קשור אבל לא Ca 2 + ללא apocalmodulin עם זיקה nanomolar וספציפיות רצף. ברמה התאית, שני היריבים CAM שונים מגורה Ca (איורים 4 ו -5). זו האחרונה לא נצפתה כאשר Sec61 ערוצי נכחו שהכיל מוטציות מוטיב IQ של Sec61α. לפיכך, Ca 2 +-CAM מעורב הגבלת Ca 2 + דליפה של ER (איור 6). <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. תרשים זרימה. ראו טקסט לקבלת פרטים. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. ניתוח נתונים עבור השתקה יעילות. השתקת הוערך על ידי ניתוח כתם המערבי באמצעות נוגדנים אשר כוונו נגד Sec61α ו β-אקטין (טעינה מלאה). נוגדנים העיקריים היו דמיינו באמצעות ECL נוגדנים Plex משני דימות פלואורסצנטי. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. ניתוח נתונים על יעילות transfection. תמונות נרשמו על מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במצלמת CCD מקורר. יעילות טרנספורמציה ניתן לקבוע על ידי חלוקת מספר התאים המציגים GFP הקרינה על ידי תאים נספר במצב brightfield. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. צילומי מסך מתוך הדמיה סידן לחיות התא של תאים הלה בנוכחות מלאה או SEC61A1-siRNA לבין קיומו או אי קיומו של Cam-אנטגוניסט ophiobolin תאים א הלה טופלו siRNA כנגד SEC61A1 (ב) או siRNA בקרה שלילית (א) עבור 96 שעות כפי שצוין. תאים אלה היו עמוסות מחוון סידן FURA, 02:00 ו מודגרות ב Ca 2 + חיץ חופשי המכיל 0.5 mM EGTA, אז חיץ או ophiobolin (Ophio) במאגר נוספה הדגירה התחדשו. לאחר 10 דקות, Ca 2 + שחרורו יזם יישום thapsigargin (TG) בהעדר Ca 2 + חיצוני ו הדגירה נמשכה. צילומי מסך מתוך הדמיה סידן מתמשכת נלקחו במועדים המצוין. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig5.jpg" alt="איור 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 5"> איור 5. ניתוח נתונים עבור לחיות סידן ניסויים תא הדמיה. (א) ניתוח כמותי קינטי של סדרת ניסויים כמתואר באיור. 4A. Cytoslic [Ca 2 +] נאמד ממדידות יחס לפי שיטת כיול הוקמה 2. ההשפעה של thapsigargin מוצג בתרשים הבר. (BD) תאים שטופלו siRNA שליטה או המצוין SEC61A1-siRNA למשך 48 שעות ולאחר מכן הפך עם וקטור או שליטה (ג), או ביטוי SEC61A1 פלסמיד (ג), או ביטוי מוטנטי SEC61A1 פלסמיד (ד) כפי שצויין. לאחר 48 שעות, הדמיה ניסויים סידן בוצעו כמו תאנים 4 ו - 5 א. ניתוח סטטיסטי של השינויים cytosolic Ca 2 + ריכוז לאחר תוספת של thapsigargin בניסויים כגון שהוצגו מוצגים. ערכי p &lt;0.001 הוגדרו משמעותי על ידי מבחן t מזווג ו מסומנים על ידי שלוש כוכביות (***), ns, לא משמעותי. המספרים של תאים נותחו מסומנים. ערכים ממוצע מקבלים, ברים שגיאה מייצגים סטיות התקן של אמצעי (SEM). נציין כי דוגמאות אלה הותאמו מ נ"צ. 13. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig6.jpg" alt="איור 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 6"> איור 6. נתונים אלו מעידים כי שחרורו של רשתות המתהווה מתסביך Sec61 אכן גורמת לשחרור סידן מן ER ויצירת nanodomain סידן סביב הפה cytosolic של מורכבות Sec61. סידן זה הוא מחויב calmodulin וסידן-calmodulin סוגר את מורכבות Sec61 ".

<ol><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling.</a> Cell. 131, 1047-1058 (2007).</li>
<li>Lomax, R. B., Camello, C., Van Coppenolle, F., Petersen, O. H., Tepikin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+and+physiological+Ca2%2B+leak+from+the+endoplasmic+reticulum+of+pancreatic+acinar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Basal and physiological Ca2+ leak from the endoplasmic reticulum of pancreatic acinar cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 26479-26485 (2002).</li>
<li>Van Coppenolle, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome-translocon+complex+mediates+calcium+leakage+from+endoplasmic+reticulum+stores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Ribosome-translocon complex mediates calcium leakage from endoplasmic reticulum stores.</a> J. Cell Sci. 117, 4135-4142 (2004).</li>
<li>Flourakis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+calcium+leak+via+translocon+is+a+first+step+for+iPLA2-pathway+regulated+store+operated+channel+activation%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Passive calcium leak via translocon is a first step for iPLA2-pathway regulated store operated channel activation.</a> FASEB J. 20, 1215-1217 (2006).</li>
<li>Giunti, R., Gamberucci, A., Fulceri, R., Banhegyi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+translocon+and+a+cation+channel+are+involved+in+the+passive+Ca2%2B+leak+from+the+endoplasmic+reticulum%3A+a+mechanistic+study+on+rat+liver+microsomes%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Both translocon and a cation channel are involved in the passive Ca2+ leak from the endoplasmic reticulum: a mechanistic study on rat liver microsomes.</a> Arch. Biochem. Biophys. 462, 115-121 (2007).</li>
<li>Ong, H. L., Liu, X., Sharma, A., Hegde, R. S., Ambudkar, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Ca2%2B+release+via+the+ER+translocon+activates+store+operated+calcium+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch.+Eur.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular Ca2+ release via the ER translocon activates store operated calcium entry.</a> Pflugers Arch. Eur. J. Physiol. 453, 797-808 (2007).</li>
<li>Amer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocon+closure+to+Ca2%2B+leak+in+proliferating+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Translocon closure to Ca2+ leak in proliferating vascular smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 296, 910-916 (2009).</li>
<li>Tu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilins+form+ER+Ca2%2B+leak+channels%2C+a+function+disrupted+by+familial+Alzheimer%27s+disease-linked+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Presenilins form ER Ca2+ leak channels, a function disrupted by familial Alzheimer's disease-linked mutations.</a> Cell. 126, 981-993 (2006).</li>
<li>Hamman, B. D., Hendershot, L. M., Johnson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BiP+maintains+the+permeability+barrier+of+the+ER+membrane+by+sealing+the+lumenal+end+of+the+translocon+pore+before+and+early+in+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">BiP maintains the permeability barrier of the ER membrane by sealing the lumenal end of the translocon pore before and early in translocation.</a> Cell. 92, 747-758 (1998).</li>
<li>Alder, N. N., Shen, Y., Brodsky, J. L., Hendershot, L. M., Johnson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+mechanism+underlying+BiP-mediated+gating+of+the+Sec61+translocon+of+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The molecular mechanism underlying BiP-mediated gating of the Sec61 translocon of the endoplasmic reticulum.</a> J. Cell Biol. 168, 389-399 (2005).</li>
<li>Aneiros, E., Philipp, S. E., Lis, A., Freichel, M., Cavalie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Ca2%2B+signalling+by+Na%2B%2FCa2%2B+exchangers+in+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Modulation of Ca2+ signalling by Na+/Ca2+ exchangers in mast cells.</a> J. Immunol. 174, 119-130 (2005).</li>
<li>Gross, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPC5+is+a+Ca2%2B-activated+channel+functionally+coupled+to+Ca2%2B-selective+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">TRPC5 is a Ca2+-activated channel functionally coupled to Ca2+-selective ion channels.</a> J. Biol. Chem. 284, 34423-34432 (2009).</li>
<li>Erdmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+calmodulin+with+Sec61a+limit+Ca2%2B+leakage+from+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Interaction of calmodulin with Sec61a limit Ca2+ leakage from the endoplasmic reticulum.</a> EMBO J. 30, 17-31 (2011).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בתאי יונקים, reticulum endoplasmic (ER) משחקת תפקיד מפתח biogenesis חלבון וכן איתות סידן. הנה, יש לנו תיאר מערכת ניסויית המאפשרת לנו ישירות לכתובת תפקיד של אחד פוטנציאל ערוץ Ca + 2 לדלוף לאפיין את מנגנוני ויסות המשוערת שלה 13. זו מערכת ניסיונית נותן לנו את הזדמנויות ייחודי i) להעריך את התרומה של חלבונים שונים על ממברנת ER פסיבי Ca 2 + בזרימת מ ER של סוגי תאים שונים, ii) לאפיין את חלבונים מנגנונים המגבילים את Ca 2 + בזרימת פסיבי, ו ג) לחקור את ההשפעות של מוטציות מחלה מקושר המרכיבים הרלבנטיים. נציין כי רק תאים קיימא צריך להיות מנותח כי הכדאיות הכללית צריכה להיות מעל 80%. לכן, הכדאיות תא מוערך שגרתי העסקת גרעיני-ID כחול / ירוק הכדאיות התא מגיב על פי פרוטוקול של היצרן. יתר על כן, ניתוח סטטיסטי של השינויים cytosolic Ca 2 + בריכוז היא חובה. לכן, הניסויים צריך להתבצע במשך ארבע קבוצות שונות של תאים ושני coverslips עם לפחות 20 תאים צריך להיות מנותח עבור כל תנאי בניסוי יחיד. נציין כי הניסויים השונים צריכים להתבצע בעת ובעונה אחת אחרי זריעת על תלושי לכסות.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> DMEM + GlutaMAX </td><td> Invitrogen </td><td> 31966 </td></tr><tr><td> OptiMEM + GlutaMAX </td><td> Invitrogen </td><td> 51985 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Biochrom </td><td> S0115 </td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td></tr><tr><td> HiPerFect </td><td> Qiagen </td><td> 301707 </td></tr><tr><td> Fugene HD </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 04709713 </td></tr><tr><td> גרעיני-ID כחול / ירוק מגיב כדאיות התא </td><td> אנזו מדעי החיים </td><td> ENZ-53004 </td></tr><tr><td> FURA, 02:00 </td><td> Invitrogen </td><td> F-1221 </td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> סיגמא </td><td> P 7255 </td></tr><tr><td> Thapsigargin </td><td> Invitrogen </td><td> T-7459 </td></tr><tr><td> Ophiobolin </td><td> אנזו מדעי החיים </td><td> ALX-270-109 </td></tr><tr><td> Trifluoperazine </td><td> סיגמא </td><td> T 6062 </td></tr><tr><td> הרוזנת ® מונה תא אוטומטי </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> טייפון-Trio הדמיה מערכת </td><td> GE Healthcare </td><td></td></tr><tr><td> TE2000-S מיקרוסקופ עם מצלמה DS-5Mc </td><td> ניקון </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ עם iMIC צבעוני V </td><td> עד Photonics </td><td></td></tr></tbody></table>

תא חי סידן הדמיה בשילוב עם השתקת sirna מתווכת ג&#39;ין מזהה ca 2 + ערוצי דליפה בקרום er ו מנגנוני ויסות שלהם

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

בתאי יונקים, reticulum endoplasmic (ER) משחקת תפקיד מפתח biogenesis חלבון וגם סידן איתות 1. מתחם heterotrimeric Sec61 בקרום ER מספק נתיב מימית עבור פוליפפטידים החדש מסונתז לתוך לומן של ER. מחקר שנערך לאחרונה ממעבדות שונות הציע מורכבת זו heterotrimeric עלולות להיווצר Ca 2 + חולף ערוצי דליפה 2-8. תצפית מפתח רעיון זה היה כי שחרורו של פוליפפטידים המתהווה מן הריבוזום ו Sec61 מורכבים על ידי puromycin מוביל לשחרור זמני של Ca 2 + מ המיון. יתר על כן, לא נצפו במבחנה כי luminal ER חלבון BIP עוסקת במניעת חדירות יונים ברמה של Sec61 9,10 מורכבים. הקמנו מערכת ניסויית המאפשרת לנו לפנות ישירות את תפקיד מורכב Sec61 כמו פוטנציאל ערוץ Ca + 2 לדלוף לאפיין את מנגנוני ויסות המשוערת שלה 11-13. מערכת זו משלבת בתיווך siRNA להשתקת הגן ואת תא חי Ca 2 + הדמיה 13. תאים מטופלים עם siRNAs כי מכוונים נגד קידוד האזור מתורגמים (UTR), בהתאמה, של הגן SEC61A1 או siRNA בקרה שלילית. בניתוח השלמה, התאים הם שיתוף transfected עם וקטור IRES-GFP המאפשר siRNA עמידים הביטוי של הגן SEC61A1 wildtype. ואז התאים נטענים עם ratiometric Ca 2 +-אינדיקטור FURA-2 לפקח בו זמנית שינויים cytosolic Ca 2 + ריכוז במספר התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מדידה רציפה של cytosolic Ca 2 + מאפשרת גם להעריך את ההשפעה של גורמים שונים, כגון puromycin, מעכבי מולקולה קטנה, ואת thapsigargin על Ca 2 + דליפה. זו מערכת ניסיונית נותן לנו את הזדמנויות ייחודי i) להעריך את התרומה של חלבונים שונים על ממברנת ER פסיבי Ca 2 + בזרימת מ ER של סוגי תאים שונים, ii) לאפיין את חלבונים מנגנונים המגבילים את Ca 2 + בזרימת פסיבי, ו ג) לחקור את ההשפעות של מוטציות מחלה מקושר המרכיבים הרלבנטיים.

Reticulum endoplasmic ממלא תפקיד מרכזי ב biogenesis חלבון ו הומאוסטזיס הסידן. הקמנו מערכת ניסויית המאפשרת לנו כתובת תפקידו של ערוצי Ca2 + לדלוף לאפיין את מנגנוני ויסות המתרברבים שלהם. מערכת זו כוללת בתיווך siRNA להשתקת הגן ואת תא חי Ca2 + הדמיה.

תא חי סידן הדמיה בשילוב עם השתקת siRNA מתווכת ג&#39;ין מזהה Ca 2 + ערוצי דליפה בקרום ER ו מנגנוני ויסות שלהם

בתאי יונקים, הרשת האנדופלזמית (ER) ממלאת תפקיד מרכזי בביוגנזה של חלבונים וכן באיתות סידן1. קומפלקס ה-Sec61 ההטרוטרימרי...

בתאי יונקים, הרשת האנדופלזמית או ה-ER ממלאת תפקיד חשוב בביוגנזה של חלבונים ובסיגנל Calcium. קומפלקס Sec61 ההטרוטרימרי בממברנת ה-ER מספק נתיב מימי עבור פוליפפטידים שסונתזו זה עתה אל תוך הלומן של ה-ER. נתונים עדכניים מצביעים על כך ש-Sec61 עשוי להוות גם תעלות זליגה זמניות של Calcium, כדי לבחון באופן ישיר את תפקידו של קומפלקס Sec61 כתעלת זליגה פוטנציאלית של Calcium.וכדי לאפיין את מנגנוני הבקרה המשוערים שלו, התאים מטופלים תחילה ב-siRNAs המכוונים נגד הגן sex 61 A one. בניתוח קומפלמנטציה, התאים עוברים טרנספקציה משולבת עם וקטור iris GFP המאפשר ביטוי של הגן sex 61 A one מסוג הבר (wild type) העמיד ל-irna. לאחר מכן, התאים נטענים עם המחוון הרציומטרי לסידן RO two, והשינויים בריכוז הסידן הציטוסולי מנוטרים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה.במהלך מדידת רמות הסידן, מבוצעים שינויים בתמיסה כדי להעריך את ההשפעה של חומרים שונים, כגון אנטגוניסטים לקלמודולין ו-fabs argon, על דליפת סידן. ניתוח כמותי של התמונות שהתקבלו חושף שינויים בזרימת סידן שנגרמו כתוצאה מהשתקת sex 61 A one. בסרטון זה יוצג מודל לתפקידו של sex 61 A one בזרימת סידן, לאחר הדגמת הפרוצדורה והצגת התוצאות.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ניסויי שפופרות ליפידיות או מדידות בערוץ בודד, הוא שניתן לנתח חלבוני ממברנה מועמדים בסביבתם הטבעית, ללא צורך בתהליכי טיהור מורכבים ובשחזור תפקודי שלרוב אינו יעיל. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום השליחה העצבית של סידן, כגון, למשל, מהי התרומה של חלבוני ממברנה ספציפיים של ה-ER לזרימת הסידן מה-ER בסוגי תאים שונים וכיצד הם מבוקרים? את הפרוצדורה ידגימו sway ו-NICO, שני סטודנטים מוכשרים לתואר שני מהמעבדות שלנו. התחילו את הפרוצדורה בהכנת התמיסות והריאגנטים שבהם תשתמשו. ראשית, הכינו באפר נטול סידן בהתאם להוראות בפרוטוקול הכתוב המצורף.בשלב הבא, יש לדלל תמיסת מלאי של אינדיקטור סידן. דללו למשך 2:00 AM לתוך מיליליטר אחד של DMEM המכיל 10%FBS ו-1% פניצילין סטריפטומייסין לריכוז סופי של ארבעה micromolar; דללו תמיסת מלאי של Apso Garin בריכוז one millimolar בבופר נטול סידן לריכוז סופי של שלושה micromolar. כמו כן, יש להכין 200 micromolar olein A ו-20 micromolar כדי להפחית את הסיכון להשפעות של מטרות שגויות (off-target effects) של irna מסוים. שני irna שונים משמשים להשתיקה של כל גן כדי להעריך תופעות לוואי אפשריות של הליך הטרנספקציה.siRNAs של ביקורת שלילית, המורכבים מרצף אקראי של נוקלאוטידים, מוחדרים (transfected) במקביל ל-siRNAs הניסיוניים. חשוב שניתן יהיה להבטיח שהשפעת ההשתקה המתווכת על ידי siRNA תבוטל (rescued) באמצעות ביטוי של CD NA מסוג פראי (wild type). לכן, ה-siRNAs המשמשים לניסוי נבחרים באופן ספציפי כך שפלסמיד ההצלה (rescue plasmid) לא יושפע מה-siRNAs. בניסוי זה, ה-siRNAs מכוונים הן נגד האזור המקודד והן נגד האזור הבלתי מקודד, או האזור שאינו מתורגם, המכונה UTR, של הגן הנבדק.כאשר ה-siRNAs מכוונים נגד ה-UTR rescue, ניתן להשתמש בפלסמידים ללא ה-UTR האנדוגני כדי לבצע טרנספקציה בתאי hela. הכינו את התאים לטרנספקציה על ידי הנחת כיסוי זכוכית (cover slip) בקוטר 25 מילימטרים מצופה ב-polyol lysine בתוך צלחת תרבית תאים של שש סנטימטרים עבור כל טרנספקציה; לאחר שעה, הוסיפו 5.2 × 10⁵ תאי hela ומצע DMEM מועשר לכל צלחת. לצורך טרנספקציית התאים, סמנו מבחנה אחת למיקרו-צנטריפוגה.עבור כל תגובת טרנספקציה בכל מבחנה, הוסף 4 µL של S irna בריכוז 20 µM המומס ב-80 µL של optimum here. SEC 61 A one, sex 61 A one UTR ו-irna של בקרה שלילית הוכנו בכל מבחנה. הוסף 20 µL של hyper perfect transfection reagent, ערבב בעדינות באמצעות וורטקס, ולאחר מכן דגור את התגובות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. כדי לבצע טרנספקציה לתאים, הוסף את תערובת ה-irna, בנפח כולל של 104 µL, בטיפות לתאי ה-heli שהתיישבו, וסובב בעדינות את הצלחת כדי להבטיח פיזור אחיד של קומפלקסי הטרנספקציה.דגרו ב-37 degrees Celsius בסביבה לחית עם 5% carbon dioxide. לאחר 24 שעות, החליפו את המצע ב-3.9 milliliters של מצע טרי. לאחר מכן, כדי להעלות את יעילות הטרנספקציה, בצעו את הטרנספקציה פעם שנייה, תוך שימוש באותה תערובת irna כדי להעריך את ההשתקה, בצעו אנליזת western blot.ההשתקה צריכה להיות מעל 80%, כפי שמוצג כאן עבור sex 61 A one. אפקט ההשתקה המקסימלי נראה בדרך כלל 96 שעות לאחר הטרנספקציה הראשונה, 48 שעות לאחר הטרנספקציה הראשונה שהוכנה כדי להציל את הפנוטיפ הנובע מהשתקה של sex. 61. התחילו את התהליך באמצעות סימון של מבחנה מיקרו-צנטריפוגה חדשה.עבור כל תגובה, התאים יעברו כעת טרנספקציה עם וקטור ריק או עם פלסמיד ביטוי של sex 61 A one מסוג wild type. פלסמיד הביטוי מסוג wild type ששימש כאן נוצר על ידי הכנסת cDNA של sex 61 A one לאתר השבט המרובה (multiple cloning site) של pcd.וקטור GFP עם רצף כניסה ריבוסומלית פנימית משולשת (three internal ribosomal entry) המכיל את מקדם ה-cytomegalovirus, את ה-iris פלוס את רצף הציפוי של החלבון הפלואורסצנטי הירוק. הכין את ריאגנט הטרנספקציה על ידי הוספת 4 µg מכל פלסמיד מומס ב-80 µL של optimum לכל מבחנה. לאחר מכן, הוסף לכך 16 µL של ריאגנט טרנספקציה FU gene HD, ערבב בעדינות באמצעות וורטקס והדגה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.לאחר החלפת המצע, הוסיפו בטיפות את תערובת הפלסמיד לתאי ה-HEK293-A9 שהושקעו, וסובבו בעדינות את הצלחת כדי להבטיח פיזור אחיד של קומפלקסי הטרנספקציה. הניחו את התאים בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2 והדגרימו למשך 48 שעות נוספות. כדי לקבוע את יעילות הטרנספקציה, העריכו את ביטוי ה-GFP באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.לאחר 48 שעות, לפחות 80% מהתאים צריכים להיות טרנספקטים. לפני הדימות, השתמשו בפינצטה כדי להעביר את לביבות הזכוכית (cover slips) עם תאי ה-hela הטרנספקטים לכלי תרבית תאים חדש בקוטר 3.5 centimeter והוסיפו one milliliter של DMEM עם ארבע micromolar.דגרו למשך 45 דקות ב-25 degrees Celsius בחושך. לצורך ביצוע הדמיה, העבירו את כיסוי הזכוכית עם לפחות שני תאים טעונים לתא הקלטה מתכתי וקבעו אותו במקומו על ידי הברגת שני חלקי התא זה לזה. באמצעות פיפט, הוסיפו והסירו 300 microliters של בופר נטול סידן מהתאים כדי לשטוף אותם.חזור על הפעולה, ולאחר מכן התקן את תא ההקלטה על מיקרוסקופ I MIC עם polychrome five cremator. באמצעות סט מסננים עבור URA two, מצא שדה המכיל לפחות 20 תאים על מנת להעריך את הפלואורסצנציה הבלתי תלויה בסידן של FU A two. אורך גל העירור המשמש בשלב זה הוא 360 nanometers.לאחר בחירת שדה מתאים, הגדירו את תוכנת הדימוי לעוררות באורכי גל של 340 nanometers ו-380 nanometers ולמדידת הפלואורסצנציה הנפלטת ב-510 nanometers בכל שלוש שניות; הגדירו את זמן החשיפה כך שיתקבלו עוצמות פלואורסצנציה של כ-1000 arbitrary units עבור המערך המוצג כאן. נקבע זמן חשיפה של five millisecond. בנוסף, סמנו את אזורי העניין או ה-ROIs עבור אזור רקע נטול תאים ועבור עד 20 קווי מתאר של תאים.הפעלו את הדמיית התאים החיים בזמן שהניסוי רץ; המערכת תציג תמונות רציומטריות עבור שני אותות לפחות, וכן את יחסי F340/F380 בזמן אמת עבור כל ROI מסומן בתרשים קו, כאשר F340 ו-F380 מתאימים לעצימות הפלואורסצנציה בתוך ה-ROIs ב-340 ו-380 ננומטרים בהתאמה. לאחר דקה אחת, הוסיפו תמיסות בדיקה לתא ההדמיה כדי לבחון פרמטרים ניסיוניים שונים. בניסויים אלו, נבדקים האנטגוניסט של Calmodulin, tri fluorine ו-bollin A לאחר ביצוע מדידות רציומטריות למשך 10 דקות נוספות.עבור אנטגוניסטים מודולריים של CAL, הוסיפו DSA gargan והמשיכו במדידות. רשמו 400 תמונות מזווגות לכל ניסוי. לאחר איסוף התמונות, עברו על התמונות וסמנו את ה-ROIs עבור לפחות 20 תאים בכל שדה ראייה.לאחר מכן, השתמש באפשרות הניתוח הקינטי בתוכנה כדי ליצור רצף של תמונות יחס עם הפחתת רקע, וגרף המציג את קינטיקת יחס הסידן עם הפחתת רקע. לבסוף, ייצא עבור כל ROI את הנתונים ל-excel ול-origin באמצעות שיטת כיול מבוססת. ניתן לחשב את ריכוז הסידן בציטוזול ממדידות היחס כדי לבחון האם הגן sex 61 A one משפיע על דליפת סידן מה-er.הגן Sex61A1 הושתק באמצעות שני סוגים שונים של RNA בתאי HeLa למשך 96 שעות. השתיקה הוערכה באמצעות אנליזה של Western blot של מספרים דומים של תאים בשלוש חזרות; כפי שמוצג כאן, נראה אות Sex61&alpha; חזק בנתיבים 1 עד 3, ואות חלש משמעותית בנתיבים 4 עד 6 ובנתיבים 7 עד 9, המקבילים לתאים שבהם הושתק Sex61A1. כדי לכמת את התוצאות, אותות ה-Sex61&alpha; נורמלו לאותות של beta actin; הושגה השתקה של למעלה מ-80% כדי לבחון את תפקידו של calmodulin בזרימת סידן ב-ER.דימוי URA של תאי helo שעובדו עם sir A בוצע בנוכחות או בהיעדר האנטגוניסט של Cal Modin, Bollin A. סרטון זה מציג תאי ביקורת שעובדו עם bollin a במשך 10 דקות לאחר הטיפול ב-bollin A. שחרור סידן הופעל על ידי יישום של FSO Gargan, מעכב circa שחשף שחרור סידן מה-ER בהיעדר סידן חיצוני, כפי שניתן לראות כאן.הוספת FSA argon הובילה לעלייה חולפת אך משמעותית בפלואורסצנציה, המעידה על זרם סידן F מה-er. לעומת זאת, זרם סידן F בעקבות הוספת FSO garin בעצם PHE, בתוך תאים שקטים מהמין sex 61 A שעובדו עם A, פחות בולט באופן ניכר, כפי שניתן לראות כאן. הבדל זה נראה בבירור בדיאגרמה זו, המציגה את רמות הסידן המוערכות בציטוזול לאורך זמן בסדרה של סרטים; התוצאות הכמותיות המוצגות כאן מאשרות זרם סידן מוגבר בתאי ביקורת בתגובה ל-thic argon בנוכחות offi bolin A, כפי שניתן לראות בדיאגרמת העמודות זו.אותה תופעה נצפתה עבור אנטגוניסט triazine שני של cam. עם זאת, השפעותיהם של האנטגוניסטים של cam לא נצפו כאשר קומפלקס sex 61 רוקן מהתאים על ידי כל אחת משתי ה-siRNAs הספציפיות ל-sex 61 A one. הצלה חלקית של פנוטיפ זה ניתן לראות כאשר תאים שבהם sex 61 A one מושתק עברו טרנספקציה עם sex.פלסמיד ביטוי של SEC61 כפי שניתן לראות כאן. זרימת סידן בתגובה לאגוניסטים של Calmodulin שוקמה חלקית באמצעות טרנספקציה של פלסמיד מסוג פראי (wild type) שאינו רגיש ל-irna. תוצאות אלו מרמזות כי Calmodulin מעורב בהגבלת זרימת סידן מה-ER ברמת קומפלקס SEC61 בתאים.אם כן, טרנספקציה של גן Sec61$\alpha$1 עם מוטציה כפולה באתר הקישור של Calmodulin לא אמורה להציל את הפנוטיפ המושרה על ידי ה-irna. ואכן, כאשר תאים עברו טרנספקציה באמצעות פלסמיד ביטוי של Sec61$\alpha$1 עם מוטציה כפולה במניע ה-IQ, לא נצפתה הצלה של הפנוטיפ במקביל. נתונים אלו מעידים כי שחרור של שרשראות ראשוניות (nascent chains) מקומפלקס ה-Sec61 אכן מוביל לשחרור סידן מה-ER ולהיווצרות של ננו-דומיין סידן מסביב לפתח הציטוזולי של קומפלקס ה-Sec61.סידן זה נקשר על ידי Calmodulin, וסידן Calmodulin סוגר את קומפלקס ה-61. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעל你们 הבנה טובה כיצד לשלב השתקה גנטית מתווכת siRNA בתאים אנושיים עם דימוי סידן בשיטת lifestyle בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון ביטוי של cDNAs עם מוטציות הקשורות למחלה, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון ההשפעה הפוטנציאלית של מוטציות הקשורות למחלה ברכיבים לא רלוונטיים.ואל תשכחו שעבודה עם תרופות כגון tap, שוב, עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון שימוש בכפפות, בעת ביצוע הליך זה.

live-cell-calcium-imaging-combined-with-sirna-mediated-gene-silencing

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הקרינה מבוסס מדידה הכניסה חנות המופעל הסידן בתאים חיים: מתא הסרטן תרבותי כדי סיב שריר שלד

ממוקד ולין מושרה טעינת צבע (טד) תומכת בניתוח של דינמיקת חנות סיד תאיות על ידי דימות פלואורסצנטי. השיטה מתבססת על המיקוד של Carboxylesterase רקומביננטי לreticulum endoplasmic (ER), שבו משפר את הסרת המסכות המקומית של סינטטי נמוכה זיקת...

הדמיה ישירה של סידן ER עם ממוקד esterase מושרה טעינת צבע (טד)

כאן אנו מציגים טכניקות להדמיית אירועי Ca2+ מקומיים בתיווך IP3 באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בתאי יונקים שלמים הטעונים באינדיקטורים Ca2+ יחד עם אלגוריתם שהופך את הזיהוי והניתוח של אירועים אלה לאוטומטיים.

ההדמיה המקומית Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בתאי יונקים בתרבית

הומאוסטזיס סידן ברטיקולום אנדופלזמי מופרע בפתולוגיות מגוונות.  ניתן להשתמש במדווח חלבון ניטור סידן מופרש (SERCaMP) כדי לזהות שיבושים במאגר הסידן של ER.   פרוטוקול זה מתאר את השימוש ב-Gaussia luciferase SERCaMP לבחינת הומאוסטזיס סידן ER במבחנה וב-vivo.

ניטור הומאוסטזה סידן endoplasmic reticulum שימוש<em&gt; Gaussia</em&gt; לוציפראז SERCaMP

נכון לעכשיו, רוב מדדי הסידן הזמינים משמשים לכימות מעברי סידן ציטופלזמיים כמדדים עקיפים של סידן המשתחרר מהרטיקולום הסרקופלזמי בתאי שריר חלק מתורבתים. פרוטוקול זה מתאר את השימוש באינדיקטור ספציפי מבוסס FRET המאפשר מדידה ישירה של אותות סידן בתוך לומן הרטיקולום הסרקופלזמי.

מדידת תנודות סידן בתוך הרטיקולום sarcoplasmic של בתאי שריר חלק בתרבית באמצעות מבוססי סריג הדמיה Confocal

אנו מציגים פרוטוקולים ליישום של מחוון סידן מקודד גנטית ממוקד גנטית (GECI) Catcher + לניטור מהיר trans סידן ב reticulum endoplasmic / sarcoplasmic (ER / SR) של HEK293 ו שלד שריר תאים C2C12 באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בזמן אמת. פרוטוקול למדידה באתרו K d וכיול נדון גם.

ניטור ER / SR סידן שחרור עם CA ממוקד<sup&gt; 2+</sup&gt; חיישן Catcher<sup&gt; +</sup

שיטה זו מספקת דרך לזוג אלקטרואופטיקה וחיישני סידן מקודד גנטית לתמונה בסיסית ציטוסולג רמות סידן ושינויים בארעיות הסידן מעורר בשרירי הגוף של האורגניזם מודל ג. אלגיה.

בשנת הדמיה Vivo סידן בג. אלגיה שרירי הגוף

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור Ca2 + הדמיה של נוירונים ותאי גלייה, המאפשרת את הקרע של Ca2 + אותות ברזולוציה subcellular. תהליך זה הוא החלים על כל סוגי תאים לאפשר הביטוי של Ca מקודדים גנטית2 + מחוונים.

דיסקציה של Ca מקומי2 + אותות בתאים בתרבית על ידי קרום, ממוקדות Ca2 + אינדיקטורים

השיטות הנוכחיות מתארות גישה לא רציומטרית להדמיית סידן ברזולוציה גבוהה, תת-מדורית in vivo ב- Caenorhabditis elegans באמצעות מדדי סידן מקודדים גנטית זמינים.

הדמיה תת-תאית של טיפול בסידן עצבי ב-Vivo

פרוטוקול זה מתאר גישה לביצוע הדמיית סידן באורגנואידים של מעיים אנושיים נגועים בנגיף, ומציע גישה לניתוח.

הדמיית סידן חיה של חד-שכבות אורגנואידים במעי אנושי נגועים בנגיף באמצעות מדדי סידן מקודדים גנטית

מאמר זה מציג שיטה לניטור כמותי בזמן אמת של ריכוזי יוני סידן (Ca2+) בתאים באמצעות הדמיה חד-תאית Ca2+ עם צבע Fura-2/AM. טכניקה זו מאפשרת העמסת צבע יעילה וחישוב מדויק של רמות Ca2+ באמצעות יחסי עוצמת פלואורסצנטיות, מה שהופך אותה לגישה פשוטה ומהירה ליישומי מחקר.

דימות סידן חד-תאי לחקר הפעלת תעלות יוני סידן

חקור מנגנוני ויסות של ערוצי דליפת סידן ברשתיתיתית תוך שימוש בהשתקת siRNA ודימוי תאים חיים. השיטה מאפשרת ניתוח חלבוני ממברנה בסביבתם הטבעית ללא טיהור.

תא חי סידן הדמיה בשילוב עם השתקת siRNA מתווכת ג'ין מזהה Ca^{2 +} ערוצי דליפה בקרום ER ו מנגנוני ויסות שלהם

גלה סרטונים נוספים