דור Multivirus ספציפיים תאים T כדי למנוע / לטפל זיהומים נגיפיים לאחר השתלת allogeneic תא גזע hematopoietic
27 במאי 2011
פרוטוקול מהיר, פשוט וחסכוני עבור הדור של התורם הנגזרות multivirus ספציפי ההרג (rCTL) עבור עירוי כדי allogeneic hematopoietic בתאי גזע להשתלה (HSCT) מקבלי בסיכון לפתח זיהומים CMV, עו"ד או EBV. תהליך הייצור GMP תואמי וצריך להבטיח את יישום רחב יותר של חיסוני T-cell מעבר במרכזים מיוחדים.
המטרה הכללית של הפרוצדורה הבאה היא לייצר במהירות לימפוציטים T ציטוטוקסיים ספציפיים לנגיף (CTLs) המופקים מתורם, המתאימים להעברה אדופטיבית למקבלי השתקת תאי גזע המטופוייטים (HSCT) אלוגנית. זאת מושגים תחילה על ידי ביצוע נוקליאקציה לתאי דנדריטיים (DCs) באמצעות פלסמידים המקודדים לאנטיגנים ויראליים, כדי להכין את התאים להצגת אנטיגנים. כשלב שני, התאים הדנדריטיים שעברו נוקליאקציה משמשים לעידוד תאי T ספציפיים לאנטיגן, אשר מורחבים לאחר מכן בנוכחות IL-4 ו-IL-7 במכשיר תרבית חדיר לגזים הנקרא GASPAK.
בשלב הבא, לאחר שבעה ימי תרבית, התאים מופרדים ומועברים למצע חדש, והמדיה שלהם מוחלפת כדי לשמר התרחבות מקסימלית של CTL in vitro. לבסוף, ביום ה-12, התאים נאספים ונבדקים לטוהר, יעילות ובטיחות, ואז הם נשמרים בהקפאה (cryopreservation) לשימוש קליני עתידי. בסופו של דבר, ניתן להפיק שורות CTL בעלות ספציפיות למספר נגיפים ובמינימום ריאקטיביות אלוגנית, כפי שעולה מצביעת סייטוקינים תוך-תאית, ייצור interferon gamma וציטוטוקסיות.
ייצור של קווי תאי T ציטוטוקסיים ספציפיים למספר נגיפים הוא תהליך גוזל זמן ומסורבל. הוא דורש שימוש בקווי תאי B שעברו טרנספורמציה באמצעות נגיף EP Epstein bio ווקטורים אדנו-ויראליים, וההליך נמשך כשלושה חודשים. השיטה החדשה שלנו אינה משתמשת בווקטורים ויראליים.
התאים גדלים בצמיחה מעריכית בתרבית עם אובדן מינימלי של תאים, ולכן הפרוצדורה היא מהירה וחסכונית. המדגימה של פרוצדורה זו היא Eureka Gerdeman, עמיתה קלינית במעבדה. קצרו dcs המופקים ממונוציטים, אשר הופקו במצע Cellgenic, מועשר ב-IL four ו-G-M-C-S-F, ולאחר מכן הבשילו במשך 24 שעות בציטוקינים להבשלה על ידי רספנסיה עדינה בעזרת פיפטת העברה של שלושה מיליליטר. השתמשו ב-trian blue לספירת ה-dcs ולאחר מכן העבירו אותם לשלוש מבחנות של 15 מיליליטר, כך שיהיו בכל מבחנה לא פחות מ-0.5 times 10 to the sixth ולא יותר מ-two times 10 to the sixth תאים.
בשלב הבא, סבבו את ה-DCS בצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-200 ×g. במהלך זמן זה, הכינו שישה מיליליטרים של מצע cell genix מועשר עם אותו תפריט ציטוקינים להבשלת DC כפי שנעשה קודם לכן, ופזרו שני מיליליטרים בשלוש בארות של פלטת תרבית רקמות בעלת 12 בארות; מלאו את הבארות שאינן בשימוש בשני מיליליטרים של מים סטריליים. העבירו את הפלטה לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם 5% CO2 לחימום מוקדם.
לאחר סיום סבב הצנטריפוגה של התאים, שאבו את העילאיים והוסיפו לכל מבחנה את פלסמידי ה-DNA הרלוונטיים בריכוז סופי של 5 µg DNA למבחנה. בשלב זה, הפלסמיד המקודד ל-IE1 pp65 מתווסף למבחנה מספר אחת, ה-penton למבחנה מספר שתיים, ו-EBNA1 LMP2 BZ F1 למבחנה מספר שלוש. השעו את ה-DCS וה-DNA ב-100 µL של תמיסת transfection גרעינית.
ערבבו היטב והעבירו את התערובת לכוויות נוקלאופקציה של NU. מקמו את הכוויות במכשיר נוקלאופקטור D. בחרו בתוכנית CB1 50 ולחצו על התחל מיד לאחר הנוקלאופקציה.
הוסיפו 500 µL של מצע הבשלה CELLGENIC DC שחומם מראש לכל תערובת תאים, ערבבו בעדינות על ידי פיפטאג מעלה ומטה פעמיים עד שלוש פעמים, והעבירו את ה-DCs שעברו טרנספקציה ללוח 12 בארות המוכן המכיל את 1.5 mL הנותרים של מצע הבשלה DC שחומם מראש. העבירו את הלוח למדגרה ל-12 עד 18 שעות נוספות, קצרו, ספרו ולאחר מכן קרנו את ה-DCs שעברו טרנספקציה. שטפו את התאים פעם אחת עם 10 mL של מצע CTL ולאחר מכן השעיו אותם בריכוז של 3×10⁵ DCs למילילטר מצע. איספו כמות מינימלית של 7.5×10⁵ (או 2.5 mL) וכמות מקסימלית של 15×10⁵ (או 5 mL) של DCs מכל שלוש הטרנספקציות, והעבירו את ה-DCs המאוחדים שעברו טרנספקציית פלסמיד למכשיר ה-G Rex.
לאחר מכן, מקמו את המכשיר באינקובטור להכנת תאי המגיבים. השתמשו בתאים חד-גרעיניים שאינם נצמדים שנותרו לאחר בחירת ה-DC. העבירו את המגיבים לתמיסת תרבית שחוממה מראש.
שטפו אותם פעם אחת עם מצע CTL reus. תלו את התאים במצע CTL. ספרו את התאים והביאו אותם לריכוז של 2*10⁶ תאים למיליליטר.
קחו 15 × 10⁶ תאים או 7.5 מיליליטרים והוסיפו את הציטוקינים IL-4 ו-IL-7. העבירו 7.5 מיליליטרים של PBMC ל-G REX ומלאו את הביוראקטור במדיום CTL עד לנפח כולל של 30 מיליליטרים. לבסוף, הכניסו את ה-G REX לאינקובטור למשך שישה עד שבעה ימים; ביום השישי או השביעי, שאבו 10 מיליליטרים מהמדיום.
לאחר מכן, ערבבו את 20 המיליליטרים הנותרים של המצע באמצעות פיפטת 10 מיליליטר. השתמשו ב-trian blue לספירת התאים אם ישנם פחות מ-50 × 10⁶ תאים. רעננו את התרבית באמצעות מצע טרי וציטוקינים.
אם קיימים יותר מ-50 $\times$ 10⁶ תאים, יש להוציא 10 milliliters של תגסוס התאים, להעביר את התאים ל-G rex חדש ולאחר מכן להזין את שני ה-G rexes במצע CTL טרי ובציטוקינים; יש לתרבית את התאים למשך ארבעה עד שישה ימים נוספים כדי להרחיב את התאים למספר מספיק, לקצור ולספור אותם. לאחר מכן, יש להקפיא את כל התאים שאינם משמשים לאנליזות פנוטיפיות או תפקודיות לשימוש עתידי. תוצאות מייצגות המראות כי פלסמידי DNA מולטי-סיוניים משרים T cells ספציפיים למולטי-וירוס, כפי שנמדד על ידי interferon gamma ELISpot, וכי שכיחות התאים הריאקטיביים גבוהה מזו של שורות שהופקו באמצעות פלסמידי PHU קונבנציונליים המבטאים את אותם אנטיגנים.
היחס האופטימלי בין DC ל-PBMC חשוב עבור סטימולציה חזקה של תאי T, כפי שמוצג באיור זה, שבו יחס של 1 ל-50 מביא להפעלה מחדש תת-אופטימלית בהשוואה ליחס של 1 ל-20 בין סטימולטור למגיב. תרבית CTL ב-G rex, כפי שנראה באיור זה, תומכת בהתרחבות עדיפה של תאי T בהשוואה ללוחיות 24 באריים קונבנציונליות. הוספת IL-4 ו-IL-7 לתרביות מגדילה את הרפרטואר ואת הספציפיות של התאים שהתרחבו, כפי שמוצג כאן, כאשר נבדקה התדירות של תאי T המגיבים לפפטיד NLV מ-CMV PP 65 המוגבל ל-HLA A2 בתרביות שנוצרו בנוכחות או בהיעדר IL-4 ו/או IL-7. איור זה מציג דגימה מייצגת של הפנוטיפ של תאי ה-CTL המתרחבים במהירות נגד מספר וירוסים, שהם פוליקלונליים וכוללים תערובת של תאי T חיוביים ל-CD4 וחיוביים ל-CD8, שרובם מבטאים את סמני הזיכרון CD45RO ו-CD62L. תאי ה-CTL שהתרחבו ספציפיים לכל האנטיגנים המעוררים והם פולי-פונקציונליים, כפי שניתן להעריך כאן באמצעות צביעה תוך-תאית של ציטוקינים לזיהוי ייצור של interferon gamma ו-TNF alpha לאחר סטימולציית אנטיגן, כפי שנבדק באמצעות בדיקת שחרור כרום.
ה-CTL המורחבים מסוגלים להרוג באופן ספציפי מטרות ויראליות, אך לא הראו פעילות לא-ספציפית נגד מטרות עם אי-התאמה של HLA שאינן ויראליות, מה שנחשב לשיקול בטיחותי מכריע. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לייצר במהירות שורות של תאי T ציטוטוקסיים ספציפיים למספר וירוסים, שהם תואמים ל-GNP ומתאימים להעברה אדופטיבית לחולים עם מחלות הקשורות לווירוסים. הפישוט של הליך זה אמור להקל על הרחבתו מעבר למתקני ייצור מתמחים ולאפשר להליך להפוך לטיפול סטנדרטי עבור חולים עם מערכת חיסון מוחלשת הרגישים מאוד למחלות הקשורות לווירוסים.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול מהיר וחסכוני לייצור לימפוציטים T ציטוטוקסיים (CTLs) ספציפיים למספר וירוסים המופקים מתורם, להזרקה למקבלי השתלת תאי גזע המטופואטיים אלוגנאיים. השיטה תואמת לתקני GMP ומטרתה לשפר את היישום של אימונותרפיה באמצעות תאי T.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- אימונולוגיה
- תרפיה תאית
- המטולוגיה
רקע
- תאי CTL ממלאים תפקיד מכריע במלחמה בזיהומים נגיפיים לאחר השתלה.
- שיטות קונבנציונליות להפקת תאי CTL הן מורכבות וגוזלות זמן.
- קיים צורך בפרוטוקולים יעילים יותר שניתן ליישם במסגרות קליניות שונות.
- מחקר זה מציג גישה יעילה ומפושטת להפקת תאי CTL.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול מהיר ליצירת CTLs ספציפיים למספר נגיפים.
- הבטחת עמידה של הפרוטוקול בתקני GMP.
- הנגשת אימונותרפיה בתאי T למספר רב יותר של מקבלי HSCT.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- נוקלאופקציה (Nucleofection) של תאי דנדריטיים עם פלסמידים המקודדים לאנטיגנים ויראליים.
- סטימולציה והרחבה של תאי T ספציפיים לאנטיגן במכשיר תרבית חדיר לגזים.
- איסוף ובדיקת CTLs לרמת הניקיון והעוצמה שלהם.
- שימור בהקפאה (Cryopreservation) של CTLs לשימוש קליני.
תוצאות עיקריות
- יצירה מוצלחת של תאי CTL ספציפיים למספר נגיפים עם מינימום של תגובתיות אלוגנית.
- הרחבה משופרת של תאי T בהשוואה לשיטות קונבנציונליות.
- הוכחת יעילות של הפרוטוקול החדש בייצור תאי CTL פונקציונליים.
- זוהו יחסי DC ל-PBMC אופטימליים לגירוי יעיל של תאי T.
מסקנות
- הפרוטוקול החדש מפחית משמעותית את הזמן ואת המורכבות של ייצור CTL.
- הוא מספק אפשרות מעשית לאימונותרופיה של תאי T במקבלי HSCT.
- מחקרים עתידיים עשויים לבחון את היישום הקליני של תאי CTL אלו במניעת זיהומים נגיפיים.
שאלות נשאלות באופן שכיח
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ייצור מהיר של לימפוציטים T ציטוטוקסיים הספציפיים למספר וירוסים, בהתאם לתקני GMP, נותן מענה לבקבוק קריטי באימונותרפיה אדופטיבית עבור מטופלים עם מערכת חיסונית מוחלשת. על ידי קיצור זמן הייצור מ-10-14 שבועות ל-10 ימים והפחתת העלויות ביותר מ-90%, גישה זו מאפשרת ייצור של מוצרי CTL במדד הניתן להרחבה ובפורמט של מוצר מדף לשימוש מנע ומטפל לאחר HSCT. הפרוטוקול תומך בקידום תהליכי הפיתוח על ידי שיפור הביטחון החזוי בשחזור חיסוני ספציפי למטרה, תוך מזעור סיכוני אלוראקטיביות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של ספציפיות תאי T אנטי-ויראליים נגד אנטיגנים של EBV, CMV ו-Adv באמצעות צביעה תוך-תאית של ציטוקינים ובדיקות ציטוטוקסיות.
- ערך תפעולי: מספק מערכת ניתנת לשחזור להפחתת סיכונים בהיפותזות טיפוליות באמצעות ייצור מהיר של קווי CTL פוליקלונליים ופולי-פונקציונליים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: תומך בסריקת תאי T ספציפיים לאנטיגן באמצעות בדיקת ELISPOT לאינטרפרון-גמא ובדיקות שחרור כרום לכימות העוצמה והספציפיות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של מוכנות הבדיקה באמצעות יחסי DC:PBMC עקביים (1:20) והתרחבות מועשרת בציטוקינים (IL-4, IL-7) במכשירי G-Rex.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מדגים המשכיות תרגומית מהתרחבות של CTL ex vivo לפעילות אנטי-ויראלית in vivo, ובכך תומך במידול יעילות פרה-קליני.
- ערך תפעולי: מאפשר קבלת החלטות על קידום מבוסס ניהול סיכונים על ידי אישור מינימום של allo-reactivity והיעדר ציטוטוקסיות לא ספציפית נגד מטרות עם HLA-mismatch.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לייצור מהיר של תאי T ספציפיים לנגיף עבור מחקרים מכניסטיים והערכה של מועמדים טיפוליים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות של תפקוד תאי T אנטי-ויראליים באמצעות סטימולציה ספציפית לאנטיגן באמצעות תאי דנדריטיים שעברו נוקלאופקציה.
- סריקה: מספק אוכלוסיות CTL מורחבות, המוכנות לבדיקה, עם רפרטואר ותדירות יציבים להערכה מהימנה של תרכובות או משתנים.
- אנליטיקה: מייצר תוצאות כמותיות הכוללות ייצור של IFN-γ, צביעה של ציטוקינים תוך-תאיים ושחרור כרום לצורך ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין הגילוי לתיקוף פרה-קליני על ידי הדגמה של תאי CTL פולי-פונקציונליים בעלי פנוטיפ זיכרון וספציפיות לנגיפים מרובים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר ותואמת GMP, הניתנת להתאמה לאנטיגנים ויראליים נוספים מעבר ל-EBV, CMV ו-Adv.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי בשחזור חיסוני ספציפי למטרה והפחתת עמימות מכניסטית בתגובות אנטי-ויראליות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה באמצעות תרבית G-Rex במערכת סגורה ותנאי ציטוקינים מוגדרים.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות מסוג go/no-go, יעילות הונית והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בפיתוח אימונותרפיה.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מותאם-סיכון של מועמדי CTL בהתבסס על פרופילי סמיכות, טוהר ובטיחות.
שיקולי יישום
- מומחיות באימונולוגיה, תרפיה תאית וטכניקות לתרבית תאים התואמות לתקני GMP.
- שימוש במכשור הכולל nucleofector, התקני תרבית חדירי גז מסוג G-Rex, וציטומטריית זרימה לבדיקת פוטנציה.
- סטנדרטיזציה בין-צוותית של יחסי DC:PBMC, מינוני ציטוקינים ולוחות זמנים לתרבית.
- שיקולי התאמה להרחבה לאנטיגנים ויראליים נוספים או למערכות חלופיות של תאים מציגי אנטיגן.
- מגבלות מעשיות כוללות שונות בין תורמים ביבול של DC המופקים ממונוציטים וביעילות הטרנספקציה של פלסמידים.
