Assay חינם Cell מערכת הערכת קיבולת נטרול של נוגדן GM-CSF באמצעות קולטן מסיס רקומביננטי GM-CSF

המטרה הכללית של ניסוי זה היא לבסס בדיקה נטולת תאים (cell-free assay) המכמתת את יכולת הניטרול של נוגדן עצמי ל-G-M-C-S-F. אנו מתחילים בהשגת תולעי משי טרנסגניות. נחדיר את הגן האנושי SGMR alpha כדי לייצר SGMR alpha רקומביננטי, ונמשיך בסימון ה-G-M-C-S-F האנושי הרקומביננטי באמצעות bioTE.

בשלב הבא נבחן את המתאם בין המערכת נטולת התאים לבין ביו-סמיה (bioassay) רגילה, באמצעות מחקר על עיכוב של קישור G-M-C-S-F ל-SGMR alpha על ידי נוגדנים עצמיים ל-G-M-C-S-F. התוצאות שהתקבלו מדגימות מתאם משמעותי בין עיכוב הגדילה בביו-סמיה לבין עיכוב הקישור במערכת נטולת התאים על ידי פракציות IgG מסרום ונוגדנים עצמיים מופקים ל-G-M-C-S-F. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון TF one bioassay, הוא שלמערכת זו יש רגישות גבוהה עם הדירות טובה למדידת קיבולת הנטרול של נוגדנים עצמיים ל-GM CSF.

מאחר שנוגדן עצמי ל-GM CSF גורם לפרוגנוזה ראשונית אוטואימונית כללית, השלכותיה של טכניקה זו משתרעות אל עבר האבחון. ניתן ליישמה גם בבדיקות קישור תחרותיות באמצעות קולטני ציטוקינים רקומביננטיים, כגון קולטנים ל-BEGF ול-TNFA. הדגמה של הפרוצדורה תוצג על ידי ano, סטודנט לדוקטורט מהמעבדה שלי. הוא פיתח תחילה את המערכת זו, שהיא ללא pH.

סרטון זה מציג את תולעת השש המשמשת לייצור של SGMR alpha רקומביננטי. השלב הראשון הוא הגברה של CDNA עבור SGMR Alpha מספריית CD NA של שליה אנושית באמצעות תגובת שרשרת פולימראז (PCR), וקבלת האמפליקון של ה-PCR. בצעו PCR שני כדי להוסיף רצף 5' UTR בן 50 בסיסים של poly heatron של נגירוס ULA לקצה ה-5'.

וכדי לתג תג R RRGs לקצה ה-3', שבט את תוצר ה-PCR המוגבר של ה-R לתוך הפלסמיד P MSG one one mg. הזרק יחד את המבנה PS GMR slash M1 one mg יחד עם וקטור העזר PHA three pig לביצי תולעת משי מזן PNDW one. גדל את ה Larvae מדור G0 שנבחו עד לשלב ה-moths בטמפרטורה של 25 °C. לאחר מכן, סרוק עוברים מדור G1, בין אם על ידי הזדווגות בין אחים ובין אם עם PNDW one, באמצעות ביטוי MG FP בעיניים, המעיד על תולעי משי טרנסגניות הנושאות את התג.

את הגן SGMR alpha ממשיכים להפיק כ-SGMR alpha רקומביננטי מקנקני תולעי משי טרנסגניים עם בופר פוספט המכיל 500 millimolar sodium chloride, תוך ערבוב בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. סנטריפוג את הדגימות ב-20,000 GS למשך 15 דקות. להסרת משקעים, העבר את הנוזל העליון לעמודת זיקה לניקל.

שטפו את העמודה ודללו את החלבונים באמצעות גרדיאנט ליניארי של ole מ-10 millimolar עד 250 millimolar. איספו את הפראקציות המכילות SGMR alpha מנוקה ובצעו דיאליזה מול phosphate puffed saline. ראשית, בצעו דיאליזה לדגימות עם PBS.

כדי להסיר סורביטול מהתכנית של G-M-C-S-F, הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת סודיום מטא-דאט קרה בריכוז 20 מילימולארי והדגרימו את הדגימה במשך 30 דקות על קרח בחושך. כעת הוסיפו גליצרין עד לריכוז סופי של 15 מילימולארי ובצעו דיאליזה כנגד בופר סודיום אצטט 100 מילימולארי. להמשך, הוסיפו ביוטין-אזיד לתמיסה עד לריכוז סופי של חמישה מילימולארי וערבבו במשך שעתיים בטמפרטורת החדר.

לבסוף, הסירו את החומר שאינו תגובתי באמצעות דיאליזה כנגד PBS, וצפו פלטת מיקרוטיטר ב-50 µL של נוגדן מונוקלונלי anti polyhis למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C. שטפו חמש פעמים עם PBST. לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של תמיסת חסימה והדגירו למשך שלוש שעות בטמפרטורה של 4 °C.

שוב, שטפו חמש פעמים עם PBST. הוסיפו 50 µL של SGMR alpha בתמיסת החסימה והדגרירו למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C לאחר חמישה שטיפות עם PBST. הוסיפו 25 µL מהדגימות המכילות נוגדן עצמי ל-G-M-C-S-F ואז 25 µL של G-M-C-S-F biotinylated והדגרירו למשך שעה אחת בטמפרטורה של 4 °C.

כדי להוות את הקומפלקס SGMR alpha G-M-C-S-F, המשיכו לשטוף חמש פעמים עם PBST ולאחר מכן הוסיפו 50 µL של alkaline phosphatase streptavidin למשך שעה אחת בטמפרטורה של 4 °C כדי לזהות את G-M-C-S-F הביוטינילי שקשור ל-SGMR alpha. שטפו חמש פעמים עם PBST והוסיפו 50 µL של chemiluminescence substrate לתמיסה; דגרו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר וקבעו את פעילות הכמילומינצנציה באמצעות קורא לוחות (plate reader). בניתוח SDS page, ה-SDMR alpha רקומביננטי המופק מתולעתm silk נמצא גם בצורות מונומריות וגם בצורות DME בתנאים שאינם מחזרים, אך רק בצורה מונומרית בתנאים מחזרים.

תערובת רקומביננטית זו של מונומרים ודימרים מקושרים בדיסולפיד של SGMR alpha תפקודית במבחן קישור תחרותי. הקומפלקס של G-M-C-S-F ביוטינילי עם SGMR alpha מראה ספציפיות, שכן ניתן להפרידו על ידי הוספת ריכוזים שונים של נוגדן נטרולי, אך לא של נוגדן שאינו נטרולי. יתרה מכך, ריכוזים עולים של נוגדנים נטרוליים ל-G-M-C-S-F נמצאים במתאם חיובי עם עלייה באחוז עיכוב הקישור באופן התלוי במינון.

כפי שצפוי, עיכוב הקישור של נוגדנים לא-מנטרלים ל-G-M-C-S-F לא היה תלוי במינון. מערכת תא-חופשית זו מדגימה מתאם הדוק בין עיכוב הקישור של G-M-C-S-F ל-SGMR alpha על ידי אוטו-נוגדנים ל-G-M-C-S-F לבין ערכים מחושבים של r השווה ל-0.988 ו-P value של 0.002. עיכוב הקישור עלה באופן תלוי מינון על ידי אוטו-נוגדנים ל-G-M-C-S-F.

באופן דומה, עיכוב הקשירה נמצא במתאם משמעותי עם עיכוב הצמיחה של הייבוא. לבדיקה זו יש תועלת בניתוח של פראקציות IgG מסרום של חולים עם PAP אוטואימוני, כפי שהודגם כאן על ידי הקשר בין ה-IC 50 לאחוזי עיכוב הקשירה לבין אחוזי עיכוב הצמיחה על ידי פראקציות ה-IgG מהסרום. יתרה מכך, מקדם השונות בין הניסויים מצביע על יתרון של המערכת נטולת-התאים על פני הבדיקה הביולוגית של עיכוב הצמיחה.

ברגע שהמערכת מוכנה, ניתן להשלים בהצלחה בדיקה זו של קישור ליגנד לקולטן GSF גנטי מושבב ללא תאים תוך 38 שעות. חשוב לזכור לשמור על טמפרטורת התגובה וזמן הדגירה. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הסריקה של פעילויות ביולוגיות של תרופות נוגדנים חדשניות במקום בדיקות ביולוגיות קונבנציונליות.