תפוקה גבוהה הקרנת ו biosensing עם פלורסנט ג elegans מתחים

סרטון זה מדגים שיטה לתרבית והפצה של זנים פלואורסצנטיים של CL gans לסינון תפוקה גבוהה של ספריות כימיות או זיהוי מזהמים סביבתיים כדי להעריך את ההשפעה של גורמים כימיים או סביבתיים על פעילות חלבון ספציפית. ב-CL elgan, תרביות חיידקים מוכנות תחילה כמזון לתולעים ול-GFP טרנסגני. תולעים מסונכרנות עוברות תרבית.

לאחר מכן נאספים בין 0.5 ל-2 מיליון תולעים, נשטפים ומחולקים ל-3,84. ובכן לוחות מיקרוטיטר, ואז מולקולות קטנות מספרייה כימית או דגימות בדיקה כגון מים, מזון או אדמה מתווספות לתולעים. לבסוף, הקרינה של התולעים נמדדת באמצעות קורא מיקרו-לוחות.

ניתוח נתונים של עוצמות הקרינה חושף מולקולות קטנות המווסתות מסלולי שעתוק הניתנים להשראה או מאפשרים זיהוי של מזהמים סביבתיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כמו בדיקות מבוססות מבחנה ותרביות תאים, הוא שלא יבזבז זמן על תרכובות רעילות או לא פעילות in vivo. שיטת תפוקה גבוהה זו יכולה לסייע בזיהוי מולקולות קטנות המווסתות מסלולים מעוררים מגוונים.

למרות שפיתחנו שיטה זו לסינון תפוקה גבוהה של ספריות מולקולות קטנות, ניתן ליישם אותה גם על חישה ביולוגית של מזהמים בדגימות מזון וסביבה. מי שידגים את ההליך יהיה אנדרו דיין, טכנאי במעבדה שלי וקיו לונג פוסט-דוקטורנט במעבדה שלי. הכינו מזון תולעים חיידקיות מבעוד מועד.

התחל בחיסון 500 מיליליטר מרק נהדר, בתוספת 50 מיקרוגרם למיליליטר סטרפטומיצין עם חמישה מיליליטר אי קולי רווי. אופ 50. מניחים את התרבית על שייקר וגדלים בן לילה בחום של 37 מעלות צלזיוס.

למחרת, חלקו את התרבות ל -10 צינורות של 50 מיליליטר. לאחר מכן מניחים את הצינורות בצנטריפוגה מקוררת ומסובבים בחום של 2, 500 RCF למשך 20 דקות. לאחר הספין Resus, השעו כל כדור חיידקי ב-10 מיליליטר של מצע גידול נמטודות נוזלי או NGM.

נענע את המתלים אופקית. שייקר רצפה למשך 15 דקות להשעיית החיידקים. לאחר מכן, צנטריפוגה של תרבית החיידקים ב -2, 500 RCF בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

רוקנים את ה-NGM ושוקלים את הגלולה החיידקית. לאחר מכן הוסף נפח שווה של מאגר NGM והשהה מחדש את הכדורים על ידי מערבולת. לבסוף, יש להוציא שלושה מיליליטר מתרבית החיידקים המושעה לצינורות של 15 מיליליטר ולאחסן אותם במינוס 20 מעלות צלזיוס עד שהם נחוצים.

בהדגמה זו, השפעת הלחץ המעורר הלוואת Xeno Duke על גורם השעתוק Sskn 1 תימדד כדוגמה. Sskn one ידוע כמפעיל גנים ציטו-פרוטקטיביים במהלך עקה חמצונית וקסנובי. מכינים תרבית בקנה מידה גדול של קו Trenchgenic c gans VP 5 96, הנושא שני מבנים פלואורסצנטיים.

תולעים VP 5 96 מבטאות הן את מקדם ה-GST ארבע המניע GFP, המשמש לניטור הפעילות של גורם השעתוק. Sskn אחד ו-DOP שלושה אמרגן נוהגים. RFP משמש כתקן לנורמליזציה של מספר תולעת.

DOP 3 הוא המקדם של קולטן דופמין ומתבטא באופן מכונן בתאי עצב בכל הגוף. בדוגמה, בהינתן הקסנובי לון מפעיל חזק את sskn one ומגדיל את כמות ה-GFP המתבטאת ממקדם GS T ארבע להכנת תרביות מתחילות בשילוב של 150 מיליליטר של מאגר N NGM, 1.5 מיליליטר של LB 150, מיקרוליטר של כולסטרול מולארי אחד ו-75 מיקרוליטר של 100 מיליגרם למיליליטר. סטרפטומיצין. הוספת ה-LB מסייעת למנוע מהתולעים להידבק לכלי הזכוכית ולכלי הפלסטיק, אך כמות זו אינה מספיקה כדי לתמוך בצמיחת חיידקים.

מסננים כדי לעקר את התערובת, ואז מעבירים אותה לבקבוק סטרילי של ליטר אחד ומניחים את הבקבוק בצד כדי לשחרר את הביצים מתולעים בוגרות GR. שטפו את החיידקים מהתולעים על ידי צנטריפוגה והחלפת מדיום ה-NGM עד שהשכיבה צלולה. שטפו את התולעים בפעם השנייה על ידי Resus ותלו אותן בצנטריפוגת מים סטרילית שוב לאחר הסיבוב.

הסר את הסופינט ומלא את הצינור ב -3.75 מיליליטר מים סטריליים. הוסף מיליליטר אחד של אקונומיקה ביתית ו -250 מיקרוליטר של 10 נתרן הידרוקסיד רגיל מעורבב מיד בהיפוך חמש עד שש פעמים. הנח את הצינור במסובב לאחר שהתולעים נחשפו לאקונומיקה במשך ארבע דקות.

הנח את הצינור מתחת למיקרוסקופ סטריאו. רוב המבוגרים צריכים להיות שקרים. נער את הצינור במרץ 15 עד 20 פעמים כדי לעזור לשקר את כל התולעים הבוגרות שנותרו לאחר הליזיס במשך חמש דקות בסך הכל, הוסף מים סטריליים עד שהצינור מלא.

מערבבים בהיפוך חמש עד שש פעמים כדי לאסוף את הביצים. צנטריפוגה את הצינור למשך דקה אחת ב -500 RCF. שוטפים את הביצים שלוש פעמים על ידי Resus, מכופפים אותן ב -10 מיליליטר מים סטריליים, מסובבים ומסירים את הספינאט.

לאחר מכן, יש לדלל דגימה של 100 מיקרוליטר מהביצים פי 100 על ידי הוספת 10 מיליליטר של מאגר NGM. לאחר מכן פיפטה שלוש אליקוטות של חמישה מיקרוליטר על מכסה צלחת פטרי תחת מיקרוסקופ. ספרו את מספר הביצים בשלוש נקודות נפרדות של חמישה מיקרוליטר.

כדי להעריך את המספר הכולל של הביצים. הוסף 200,000 עד 2 מיליון ביצים לבקבוק עם מאגר NGM ונער את התרבית ב-100 סל"ד ב-20 מעלות צלזיוס. לפחות 16 שעות לאחר הוספת הביצים לבקבוק, משתמש בפיפטה סרולוגית סטרילית כדי להסיר כ-0.5 מיליליטר מתרבית התולעים התלויה.

פיפטה שלוש טיפות של חמישה מיקרוליטר על המכסה הסטרילי של צלחת פטרי. הכניסו את המכסה למקפיא של מינוס 20 מעלות למשך דקה עד שתיים כדי לשתק את התולעים לאחר שהתולעים משותקות. ספרו את המספר הממוצע של תולעים חיות שבקעו לחמישה מיקרוליטר בעזרת מיקרוסקופ סטריאו כדי להעריך את המספר הכולל.

הפשירו את תרבית החיידקים הקפואה OP 50 שהוכנה קודם לכן על ידי הנחתה על ספסל למשך מספר דקות. לאחר מכן הוסף שלושה מיליליטר של 50% OP 50 לכל 500,000 תולעים שבקעו. לנער את הבקבוק 100 סל"ד ב-20 מעלות צלזיוס.

התולעים יתפתחו ל-L ארבעה זחלים ולשלבים בוגרים צעירים תוך כ-51 שעות. עקוב אחר כמות החיידקים לאורך הדגירה על ידי בדיקה חזותית. הוסף עוד חיידקים אם המדיה מתבהרת.

השתמש בפיפטה סרולוגית סטרילית כדי להעביר כ-0.5 מיליליטר מתרבית התולעים המרחפת לצלחת אגר NGM רגילה. צפו בתולעים במיקרוסקופ סטריאו כדי לוודא שרובם הם זחלי L ארבעה ובוגרים צעירים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר, ל-L ארבעה זחלים תהיה נקודה שקופה גחונית באמצע הגוף. מבוגרים צעירים יהיו מעט גדולים יותר ולא תהיה להם נקודה ברורה.

לאחר מכן, משוך את תרבית התולעים לצינורות סטריליים של 50 מיליליטר. הנח את המבחנות במתלה מבחנה במכסה המנוע ואפשר להן ליישב ביצים שלא בקעו או תולעים שאינן מתפתחות. מתיישב לאט יותר מתולעים מפותחות.

לאחר 10 דקות, הסר את הספינאט, המכיל תולעים שלא בקעו ולא פותחו על ידי שאיבה בכ-10 מיליליטר של חיץ NGM לכל כדור והשהה את התולעים על ידי סיבוב עדין של הצינורות. אסוף את כל התולעים לצינור יחיד של 50 מיליליטר. סובב את צנטריפוגת הדלי המתנדנדת ב-500 RCF למשך 30 שניות.

לאחר מכן השעו מחדש את התולעים ב-50 מיליליטר של NGM עם 1% פאונד כדי לשטוף אותן. חזור על זה, שטוף שלוש עד ארבע פעמים כדי להסיר את החיידקים לאחר הכביסה. מלאו את הצינור במאגר NGM בתוספת LB עד 50 מיליליטר.

יוצקים את זה לבקבוק חלוקת תולעים מותאם אישית בבר ערבוב ומניחים אותו על צלחת ערבוב. יש צורך במינימום של כ-20 מיליליטר או 60,000 תולעים כדי למלא את החלל המת בבקבוק החלוקה ובקלטת המתקן. ספרו את מספר התולעים בשלוש טיפות של חמש מיקרוליטר כפי שהוצג קודם לכן.

לאחר ספירה ב-NGM פלוס LB לריכוז של 12 עד 15 תולעים לכל טיפה של חמישה מיקרוליטר כל צלחת של 3 84 בארות דורשת כ-35,000 תולעים או 11.5 מיליליטר של תולעים תלויות. טען קלטת חלוקה של 10 מיקרוליטר לתוך המתקן ועיקר אותה על ידי תחול עם 70% אתנול. שטפו את האתנול על ידי תחול במים סטריליים.

הכנס את קצה קלטת החלוקה לבקבוק כך שיהיה ממש מעל מוט הערבוב מבלי להפריע לתנועתו. וודאו שהתולעים נשארות תלויות לאורך כל הבקבוק. תכנת את המתקן להוציא תולעים במהירות נמוכה עם שני פולסים מקדימים ולהפעיל לפחות 10 מיליליטר של תולעים תלויות.

מלאו את לוחות המיקרוטיטר, שכבר אמורים להכיל תרכובות בדיקה במהירות כדי למנוע מהתולעים להתיישב בצינור. כאן אמורה להיות תרכובת הבדיקה שהוטענה בעבר על לוחית המיקרוטיטר. זוהר. אטמו את הצלחות בעזרת סרט נושם כדי למנוע הצטברות אבק בבארות.

הניחו את הצלחות על משטח טלטול בחממה בטמפרטורה המתאימה לבדיקה. אין לערום את הצלחות מכיוון שהדבר עלול להגביל את זרימת האוויר. הנח את לוחית המטרה בקורא מיקרו-פלטות כדי למדוד את עוצמת הקרינה של כל באר עם אורכי גל הפליטה והעירור המתאימים כאן.

המסננים המשמשים ל-GFP הם עירור ב-4 85 ופליטה ב-5 28. המסננים ל-RFP הם עירור בחמש 40 ופליטה בחמש 90. לאחר קריאת הצלחת, חשב את היחס בין GFP ל-RFP ונרמל עם קריאות בארות הבקרה, שאינן מכילות את התרכובת המפעילה כדי לקבוע את הפרש הקיפול המדויק של עוצמת הקרינה הנגזרת מטיפולים בודדים.

בדיקת SSKN אחת המוצגת כאן משתמשת בדוח כפול משולב כרומוזומלי, זן כאשר התולעים נספרו ידנית במיקרוסקופ סטריאו. מספר התולעים תואם לנפח שחולק עם ערך R בריבוע של 0.94 וערך p של פחות מ-0.0001. זה מצביע על כך שניתן לשלוט במספר התולעים המוזרמות לכל באר על ידי התאמת הנפח המוזרם.

הקרינה הכוללת של GFP לבאר המוצגת משמאל והפלואורסצנציה של RFP לכל באר המוצגת מימין ניתנת לשחזור מבאר לבאר על פני צלחת באר של 3 84 באיורים אלה. XS מציין את הקרינה היחסית הנמדדת בכל באר. קווים מלאים מציינים את הממוצעים וקווים שבורים מצביעים על שלוש סטיות תקן מעל או מתחת לפלואורסצנטיות הממוצעת של כל הבארות היה מקדם שונות מתחת ל-9%כפי שמוצג באיור זה, הקרינה של GFP ממקדם ה-GST ארבע נמצאת בקורלציה ליניארית לפלואורסצנטיות RFP ממקדם DOP 3 על פני 3 84 בארות עם ערך R בריבוע של 0.62 וערך p של פחות מ-0.0001.

לכן, ניתן להשתמש במדווח ה-RFP שאינו ניתן להשראה כדי לנרמל את ההשראה. כתב GFP. כאשר מבטא יחס של GFP על פני RFP הקרינה הופכת להיות ניתנת לשחזור מאוד מבאר לבאר על פני צלחת 3 84 באר.

חישוב היחס בין GFP ל-RFP הפחית את מקדם השונות מתחת ל-6%, מה שמדגים את יכולתו של מדווח RFP שלושת מקדמי DOP להפחית את השונות כפי שמוצג כאן. האינדוקציה של GFP ביחס ל-RFP עם SK N אחד המפעיל קסנו ביוטי היא חזקה וניתנת לשחזור על פני צלחת של 3 84 בארות, יחסי הקרינה היחסיים הממוצעים של כל בארות הבקרה וה-GLO מסומנים בקווים מוצקים. שלוש סטיות תקן מעל ממוצע הבקרה ומתחת לממוצע dlo מסומנות בקווים שבורים.

לאחר השליטה, התחלת תרבית תולעים יכולה להיעשות כשעה ביום הראשון ואיסוף וחלוקה. ניתן לעשות תולעים כשעתיים אם עושים זאת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה חשוב לזכור להתחיל עם לפחות 60,000 תולעים ולהשאיר אותן תלויות בזמן החלוקה, בעקבות הליך זה ניתן לבצע מסכים עם אחרים, למשל, מחרוזות דיווח עבור מסלולים אחרים הניתנים להשראה על מנת לפתח מודולטורים למסלולים אחרים לאחר פיתוחו.

טכניקה זו יכולה לסלול את הדרך לחוקרים בתחומי סינון תפוקה גבוהה וחישה ביולוגית לזהות במהירות מודולטורים של מסלול מולקולות קטנות או לזהות מזהמים סביבתיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחלק ולמדוד זני אלגן פלואורסצנטיים לבדיקת תפוקה גבוהה אם מסלולי שעתוק הניתנים להשראה או בדיקת דגימות מרובות למזהמים סביבתיים.