תפוקה גבוהה הקרנת ו biosensing עם פלורסנט ג elegans מתחים

סרטון זה מדגים שיטה לתרבית ולהפצה של זנים פלואורסצנטיים של CL gans לצורך סריקה בסביבה של תפוקה גבוהה (high throughput screening) של ספריות כימיות או זיהוי מזהמים סביבתיים, כדי להעריך את ההשפעה של חומרים כימיים או סוכנים סביבתיים על פעילות של חלבונים ספציפיים. ב-CL elgan, תרביות חיידקים מוכנות תחילה כמקור מזון לתולעים, ולאחר מכן מתורבתים תולעים סינכרוניים טרנסגניים ל-GFP.

לאחר מכן אוספים, שוטפים ומחלקים בין 0.5 ל-2 מיליוני תולעים לתוך 3 פלטות מיקרוטיטר בעלות 84 בארות, ואז מוסיפים לתולעים מולקולות קטנות מספרייה כימית או דגימות בדיקה כגון מים, מזון או קרקע. לבסוף, נמדדת הפלורסצנציה של התולעים באמצעות קורא מיקרופלטות.

ניתוח נתונים של עוצמות פלואורסצנציה חושף מולקולות קטנות המודולות מסלולים שעתוקיים הניתנים להשראה או מאפשרות זיהוי של מזהמים סביבתיים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון בדיקות in vitro ובדיקות המבוססות על תרביות תאים, הוא שלא יבוזבז זמן על תרכובות שהן רעילות או אינן פעילות in vivo. שיטה זו, בעלת תפוקה גבוהה, יכולה לסייע בזיהוי מולקולות קטנות המודולות מסלולים הניתנים להשראה במגוון רחב.

למרות שפיתחנו שיטה זו לסריקה בשקיפות גבוהה של ספריות מולקולות קטנות, ניתן ליישמה גם לביו-סנסור של מזהמים בדגימות מזון וסביבה. את הפרוצדורה ידגימו אנדרו דיין, טכנאי במעבדה שלי, וקו לונג, פוסט-דוקטורנט במעבדה שלי. הכינו מזון בקטריאלי לתולעים מראש.

התחל על ידי הדבקת 500 מיליליטר של terrific broth, המועשר ב-50 מיקרוגרם למיליליטר של streptomycin, עם חמישה מיליליטר של e coli OP 50 רווי. הנח את התרבית על שייקר וגדל אותה למשך הלילה ב-37 degrees Celsius.

ביום למחרת, חלק את התרבית ל-10 מבחנות של 50 milliliters. לאחר מכן, הנח את המבחנות בצנטריפוגה מקוררת וסבב במהירות של 2,500 RCF למשך 20 דקות. לאחר הסבוב, השהה כל משקע חיידקי ב-10 milliliters של מצע גידול נומטודות נוזלי או NGM.

נער את התרחיפים באופן אופקי. השתמש במנער רצפתי למשך 15 דקות כדי להחזיר את החיידקים למצב של סספנזיה. לאחר מכן, סבב את תרבית החיידקים בצנטריפוגה ב-2,500 RCF בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

שפכו את ה-NGM ושקלו את משקע החיידקים. לאחר מכן, הוסיפו נפח שווה של בופר NGM והשעו מחדש את המשקעים באמצעות וורטקס. לבסוף, חלקו שלוש מיליליטר של תרבית החיידקים שהושעתה מחדש למבחנות של 15 מיליליטר ואחסנו אותן במינוס 20 מעלות צלזיוס עד למועד השימוש.

בהדגמה זו, יימדד כדוגמה השפעת הלוואין Xeno Duke המשרה סטרס על גורם השעתוק Sskn one. ידוע כי Sskn one מפעיל גנים ציטופרוטקטיביים במהלך סטרס חמצוני וסטרס של חומרים זרים (xenobi stress). תורגש תרבית רחבה של שורת ה-Trenchgenic c gans VP 5 96, הנושאת שני מבנים פלואורסצנטיים.

תולעים מסוג VP 5 96 מבטאות הן את מקדם GST-4 המניע את GFP, המשמש לניטור הפעילות של גורם השעתוק Sskn-1, והן את מקדם DOP-3 המניע את RFP, המשמש כסטנדרט לנורמליזציה של מספר התולעים.

DOP three הוא הפרומוטור עבור קולטן דופמין והוא מבוטא באופן קונסטיטוטי בנוירונים ברחבי הגוף. בדוגמה, בהינתן שהקסנוביוטיק מפעיל בעוצמה את sskn one ומגדיל את כמות ה-GFP המבוטא מהפרומוטור GST four, כדי להכין תרביות יש להתחיל בשילוב של 150 milliliters של תמיפת N NGM, 1.5 milliliters של LB, 150 microliters של cholesterol בריכוז 1 molar ו-75 microliters של Streptomycin בריכוז 100 milligrams per milliliter. הוספת ה-LB מסייעת למנוע מהתולעים להידבק לכלי זכוכית ולכלים מפלסטיק, אך כמות זו אינה מספיקה כדי לתמוך בצמיחת בקטריות.

סננו את התערובת כדי לעקרה, לאחר מכן העבירו אותה לבקבוק סטרילי בנפח של one liter והניחו לבקבוק בצד כדי לשחרר את הביצים מתולעי GR בוגרים. שטפו את החיידקים מהתולעים על ידי סבב צנטריפוגה והחלפת מצע ה-NGM עד שה上澄み (הנוזל העליון) יהיה צלול. שטפו את התולעים פעם שנייה על ידי השעיה שלהן במים סטריליים וסבב צנטריפוגה נוסף לאחר הסיבוב.

הסיר את העלייה ומלא את המבחנה ב-3.75 milliliters של מים סטריליים. הוסף מיליליטר אחד של אקונומיקה ביתית ו-250 microliters של sodium hydroxide בריכוז 10 normal, וערבב מיד על ידי הפיכה חמש עד שש פעמים. הנח את המבחנה ברוטטור לאחר שהתולעים נחשפו לאקונומיקה במשך ארבע דקות.

הנח את המבחנה תחת מיקרוסקופ סטריאו. רוב הבוגרים צריכים להיות מלוססים. נער את המבחנה בעוצמה 15 עד 20 פעמים כדי לסייע בליסוס של תולעי בוגרים שנותרו. לאחר שהליסוס התבצע במשך חמש דקות בסך הכל, הוסף מים סטריליים עד שהמבחנה תהיה מלאה.

ערבבו על ידי הפיכה חמש עד שש פעמים כדי לאסוף את הביצים. סובבו את המבחנה בצנטריפוגה למשך דקה אחת ב-500 RCF. שטפו את הביצים שלוש פעמים על ידי Resus, על ידי סספנסיה שלהן ב-10 milliliters של מים סטריליים, סבב בצנטריפוגה והסרה של העלייה (supernatant).

בשלב הבא, דללו דגימה של 100 µL של הביצים בדילול של 100 פעמים על ידי הוספה של 10 mL של תמיפת NGM. לאחר מכן, העבירו בפיפטה שלוש מנות (aliquots) של 5 µL כל אחת אל מכסה של צלחת פטרי תחת מיקרוסקופ. ספרו את מספר הביצים בשלוש מנות נפרדות של 5 µL.

להערכת המספר הכולל של הביצים, יש להוסיף לבקבוק עם תמיפת NGM בין 200,000 ל-2 מיליון ביצים ולנער את התרבית במהירות של 100 RPM בטמפרטורה של 20 °C. לפחות 16 שעות לאחר הוספת הביצים לבקבוק, יש להשתמש בפיפט סרולוגי סטרילי כדי להוציא כ-0.5 milliliters של תרבית התולעים התלויה.

טפטפו באמצעות פיפטה שלוש טיפות של 5 µL על המכסה הסטרילי של צחנת פטרי. הניחו את המכסה במקפיא בטמפרטורה של 20-°C למשך דקה עד שתי דקות כדי לשתק את התולעים. לאחר שהתולעים שותקו, ספרו באמצעות מיקרוסקופ סטריאו את מספר התולעים הבודעות החיות הממוצע ל-5 µL כדי להעריך את המספר הכולל.

הפשיר את תרבית חיידקי ה-OP 50 הקפואה שהוכנה קודם לכן על ידי הנחתה על השולחן למספר דקות. לאחר מכן, הוסף שלושה מיליליטרים של 50% OP 50 עבור כל 500,000 תולעים שבקעו. נער את הבקבוק ב-100 RPM בטמפרטורה של 20 °C.

התולעים יתפתחו ללרוות בשלב L4 ולשלבי בוגרים צעירים תוך כ-51 שעות. עקוב אחר כמות החיידקים לאורך כל תקופת הדגירה באמצעות בדיקה ויזואלית. הוסף חיידקים נוספים אם המצע הופך לשקוף.

השתמשו בפיפטה סרולוגית סטרילית כדי להעביר כ-0.5 מיליליטרים של תרבית התולעים התלויה לפיתח אגאר NGM סטנדרטי. בחנו את התולעים באמצעות מיקרוסקופ סטריאו כדי לוודא שמרביתן הן פגעים בשלב L4 ומבוגרים צעירים; תחת מיקרוסקופיית שדה בהיר, לפגעים בשלב L4 תהיה נקודה שקופה ונטרלית במרכז הגוף. מבוגרים צעירים יהיו גדולים מעט יותר ולא תהיה להם נקודה שקופה.

בשלב הבא, העבירו את תרבית התולעים למבחנות סטריליות בנפח 50 milliliter. הניחו את המבחנות במעמד למבחנות בתוך המנדף ואפשרו לביצים שלא בקעו או לתולעים שלא התפתחו לשקוע. אלה שוקעים לאט יותר מתולעים מפותחות.

לאחר 10 דקות, הסירו את הנוזל העליון, המכיל תולעים שלא בקעו או לא התפתחו, באמצעות שאיבה. הוסיפו כ-10 milliliters של NGM buffer לכל משקע והשעו את התולעים על ידי סיבוב עדין של המבחנות. אספו את כל התולעים למבחנה אחת בנפח 50 milliliter. סבבו בצנטריפוגה עם רותם נתיב (swinging bucket centrifuge) ב-500 RCF למשך 30 שניות.

לאחר מכן, השביו את התולעים ב-50 milliliters של NGM עם 1%lb כדי לשטוף אותן. חזרו על פעולה זו, ושטפו שלוש עד ארבע פעמים כדי להסיר את החיידקים לאחר השטיפה. מלאו את המבחנה בבופר NGM פלוס LB עד לנפח של 50 milliliters.

שפכו זאת לתוך בקבוק חלוקה מותאם לתולעים עם מוט ערבוב והניחו אותו על פלטת ערבוב. נדרש נפח מינימלי של כ-20 milliliters או 60,000 תולעים כדי למלא את החלל המת בבקבוק החלוקה ובקסת החלוקה. ספרו את מספר התולעים בשלוש טיפות של five microliter כפי שהודגם בעבר.

לאחר ספירה ב-NGM בתוספת LB עד לריכוז של 12 עד 15 תולעים לטיפה של חמישה מיקרולטר, כל פלטה בעלת 84 בארות דורשת כ-35,000 תולעים או 11.5 מיליליטר של תולעים תלויות. הכנס קסטת חלוקה של 10 מיקרולטר למחלק ועקר אותה על ידי שטיפה ראשונית ב-70% ethanol. שטוף את ה-ethanol על ידי שטיפה ראשונית במים סטריליים.

החדירו את קצה מחסנית החלוקה אל הבקבוק, כך שתהיה מעט מעל מוט הבחישה מבלי להפריע לתנועתו. ודאו שהתולעים נשארות תלויות לאורך כל הבקבוק. תכנתו את המחלק להזרמת תולעים במהירות נמוכה, עם שני דחפי הכנה (prime), והריצו לפחות 10 milliliters של תולעים תלויות.

מלאו את פלטות המיקרוטיטר, שאמורות להכיל כבר את תרכובות הבדיקה, במהירות כדי למנוע מהתולעים לשקוע בתוך הצינוריות. כאן זהו השלב להוספת תרכובת הבדיקה שנטענה מראש לפלטת המיקרוטיטר. Glow. אטמו את הפלטות בסרט דביק נשום כדי למנוע הצטברות אבק בבארות.

הניחו את הפלטות על פלטפורמה רוטטת בתוך אינקובטור בטמפרטורה המתאימה לבדיקה. אין לערום את הפלטות, שכן הדבר עלול להגביל את זרימת האוויר. הכניסו את פלטת היעד לקורא מיקרופלטות כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנציה של כל באר באורכי הגל של פליטה ועירור המתאימים כאן.

המסננים המשמשים עבור GFP הם עירור ב-485 ופליטה ב-528. המסננים עבור RFP הם עירור ב-540 ופליטה ב-590. לאחר קריאת הפלטה, חשב את היחס בין GFP ל-RFP ונרמל את התוצאות באמצעות הקריאות מבארות הביקורת, שאינן מכילות את התרכוב המפעיל, כדי לקבוע את ההבדל המדויק (fold difference) בעוצמת הפלואורסצנציה הנובעת מהטיפולים האינדיבידואליים.

בדיקת ה-SSKN המוצגת כאן משתמשת בדגם בעל דיווח כפול המשולב כרומוזומלית, זן שבו נספרו התולעים ידנית באמצעות מיקרוסקופ סטריאו. מספר התולעים נמצא במתאם עם הנפח שהוזרק עם ערך R squared של 0.94 וערך p נמוך מ-0.0001. דבר זה מעיד על כך שניתן לשלוט במספר התולעים המוזרקות לכל באר על ידי כיוון הנפח המוזרק.

הפלואורסצנציית GFP הכוללת למבב, המוצגת משמאל, והפלואורסצנציית RFP למבב, המוצגת מימין, ניתנות לשחזור גבוה בין מבב למבב בלוח של 384 מבבבים בדמויות אלו. סימני XS מציינים את הפלואורסצנציה היחסית שנמדדה בכל מבב. קווים רצופים מציינים את הממוצעים וקווים מקווקווים מציינים שלוש סטיות תקן מעל או מתחת לממוצע הפלואורסצנציה של כל המבבבים, עם מקדם וריאציה נמוך מ-9%. כפי שמוצג בדמות זו, פלואורסצנציית GFP מהפרומוטור GST four נמצאת במתאם ליניארי עם פלואורסצנציית RFP מהפרומוטור DOP three ב-384 מבבבים, עם ערך R squared של 0.62 וערך p נמוך מ-0.0001.

לפיכך, ניתן להשתמש במדווח RFP שאינו בר-השראה כדי לנרמל את מדווח ה-GFP הבר-השראה. כאשר הוא מתבטא, היחס בין פלואורסצנציית GFP לפלואורסצנציית RFP הופך לדביק באופן גבוה בין באר לבאר בלוח בעל 384 בארות.

חישוב היחס בין GFP ל-RFP הפחית את מקדם השונות לפחות מ-6%, דבר המדגים את היכולת של נשאי RFP עם שלושה פרומוטורי DOP להפחית שונות כפי שמוצג כאן. השראת GFP ביחס ל-RFP באמצעותו של xeno biotic המפעיל SK N one היא חזקה ובעלת הדירות גבוהה לרוחב פלטת 384 בארות; יחסי הפלואורסצנציה היחסיים הממוצעים של כל בארות הביקורת ובארות ה-due GLO מסומנים בקוים רציפים. שלוש סטיות תקן מעל ממוצע הביקורת ומטה ממוצע ה-dlo מסומנות בקוים מקווקווים.

ברגע שהשיטה נשלטת, הקמת תרבית תולעים יכולה להיעשות בכשעה אחת ביום הראשון, ואיסוף והפצה של תולעים יכולים להיעשות בכשעתיים אם הדבר מבוצע כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להתחיל עם לפחות 60,000 תולעים ולהבטיח שהן יישארו תלויות במהלך ההפצה; ביצוע פרוצדורה זו יחד עם שיטות אחרות, לדוגמה, דיווח על רצפים עבור מסלולים הניתנים להשראה אחרים, יכול להתבצע במטרה לפתח מודולטורים עבור מסלולים אחרים לאחר פיתוחם.

טכניקה זו יכולה לסלול את הדרך עבור חוקרים בתחומי הסריקה בתופעות גבוהה (high throughput screening) וחיישנות ביולוגית (biosensing) לזיהוי מהיר של מודולטורים של מסלולים באמצעות מולקולות קטנות או לגילוי מזהמים סביבתיים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הגידול, החלוקה והמדידה של זני *elegans* פלואורסצנטיים לצורך סריקה בתופעות גבוהה של מסלולי תעתוק הניתנים להשראה, או לבדיקת דגימות מרובות לאיתור מזהמים סביבתיים.