הפקת DNA מחומר פרפין Embedded עבור ניתוח גנטי epigenetic

סרטון זה ידגים כיצד לבצע מיצוי DNA מדגימות רקמה הטמעות בפרפין. הדגימה המשמשת בהדגמה זו היא גליל רקמה (tissue core), שקוטרו שלושה מילימטרים ואורכו שישה מילימטרים. בעוד שבהדגמה זו נעשה שימוש בגליל בודד, ניתן לעבד בתגובה אחת דגימות גדולות יותר שקוטרן עולה על חמישה מילימטרים ואורכן עולה על 10 מילימטרים, או שניים עד שלושה גלילים בגודל המשמש כאן.

עם זאת, חשוב לציין כי עשויים להידרש התאמות לפרוטוקול כדי להבטיח הסרה מלאה של הפרפין ועיכול של הרקמה. לפני שניתן לבצע כל פעולה ברקמה, יש להמיס את הפרפין השעוותי המשמר אותה. פעולה זו מתבצעת באמצעות xylene, היות ש-xylene ופנול הם חומרים רעילים. כל עבודה עם כימיקלים אלו חייבת להתבצע במנדף; הוסף 800 µL של xylene למבחנה המכילה את הדגימה שלך.

לאחר מכן, הניחו את הדגימה על רוקר (rocker) למשך 10 דקות עם ניעור עדין. סבבו את הדגימה בצנטריפוגה במהירות של 14,000 RPM למשך שלוש דקות כדי להשקיע את הדגימה, ולאחר מכן הסירו את ה-xylene והמיסו את הפרפין מהמבחנה. חזרו על שלבים אלו ש פעמיים או שלוש עד להמסה מלאה של הפרפין.

הרקמה צריכה להיראות רטובה ורכה. חשוב להסיר את כל הפרפין כדי להגדיל את תנובת ה-DNA הסופית. לכן, דגימות רקמה גדולות יותר דורשות מספר רב יותר של שטיפות.

כעת, לאחר שהפאראפין הוסר מהדגימה, יש להחזיר את הנוזלים לרקמה (rehydration) כדי לאפשר את עיכול הרקמה. פעולה זו מתבצעת באמצעות סדרת רהידרטציה באתנול. ראשית, הוסף 800 µL של 100% ethanol לדגימה, ערבב במערבל וורטקס וסבב את הדגימה ב-14,000 RPM למשך שלוש דקות.

הסר את הנוזל העליון (supernatant). חזור על שלבים אלה תוך שימוש ב-800 µL של 70% ethanol, ולאחר מכן ב-50% ethanol. הסבוב האחרון צריך להימשך חמש דקות, כיוון שהרקמה תהיה פחות מוצקה ותדרוש כוח רב יותר להצמדה למשקע (pellet).

כעת יש לעכל את הרקמה כדי לשחרר את ה-DNA מהתאים. פעולה זו מבוצעת באמצעות באפר ליזיס (lysis buffer), תמיסה המורכבת מחומרי דנטורציה של חלבונים, כגון SDS ו-proteinase K, האנזים האחראי על פירוק הרקמה.

הוסיפו 200 עד 500 µL של תמיסת ליזיס לדגימה. בהתאם לגודל, נפח של 400 µL הוא נפח מומלץ לשימוש. כמובן, הרכיבים של תמיסת הליזיס וכן טמפרטורת האינקובציה של 56 °C נועדו למקסם את פעילות החלבון.

מכיוון ש-ACE K הוא חלבון, הוא יכול לפרק רקמות למשך זמן מוגבל, ולכן יש להוסיף אנזים באופן תקופתי כדי להמשיך את התגובה. 20 µL של חלבון ACE K בריכוז של 10 mg/mL מתווספים לדגימה בבוקר ובערב עד שהרקמה מומסת לחלוטין.

כאשר לא ניתן לראות עוד רקמה מוצקה, יש לחלץ את ה-DNA מתוך תמיפת השאריות התאיות. פנול רווי משמש להפרדת הדגימה לשלב מימי ושלב אורגני. השלב המימי מכיל את ה-DNA.

חשוב להשתמש בפנול רווי במאפר (buffer saturated phenol), מכיוון שהחומציות של פנול רגיל אינה רק מפרקת את ה-DNA, אלא גם הופכת את סדר השכבות של הפאזות המימיות והאורגניות. יש לשים לב שפנול רווי במאפר מאוחסן בשתי פאזות, כאשר הפנול מהווה את השכבה התחתונה.

הוסיפו לנמונה נפח שווה של פנול רווי בתמיסת בופר והפכו את המבחנה מספר פעמים. לאחר מכן, הניחו את הנמונה בצנטריפוגה וסובבו אותה ב-14,000 RPM למשך חמש דקות כדי להשרות הפרדה של הפאזות.

ה-DNA וה-RNA יימצאו בשכבה המימית העליונה, בעוד שחלבונים, ליפידים ופוליסכרידים יימצאו באינטרפזה ובשכבה האורגנית התחתונה. הסר בזהירות את השכבה המימית מבלי להפריע לאינטרפזה והעבר אותה למבחנה חדשה. לעיתים קרובות, לאחר הסבב הראשון של הצנטריפוגה, האינטרפזה רפויה וחוזרת אחורה.

נדרש ביצוע מיצויים באמצעות נפחים קטנים של מים. ניתן למצוא את הפרוטוקול למיצויים חוזרים (back extractions) בטקסט המלווה סרטון זה. חזור על שלבים אלה עד שהממשק יהיה נקי, דבר שמושג בדרך כלל לאחר שלוש עד חמש חזרות, על ידי הוספת נפח שווה של פנול כלורופורם, איזואמיל אלכוהול לדגימת ה-DNA.

שלב זה משרת את אותה מטרה כשל פנול לבדו, אך הוא מחדד את הממשק כדי למקסם את תנובת ה-DNA. חזור על הליך זה פעם או פעמיים עד שהממשק יהיה נקי וחד. כעת, לאחר שהדגימה נקייה מחלבונים, יש להסיר כל RNA מזוהם.

דבר זה מושג באמצעות RNAs. מתווסף לדגימה RNAs A לפירוק בריכוז סופי של 100 micrograms per mil, והדגימה מדוגרת למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. כעת, לאחר שה-RNA עבר פירוק, יש להסיר את אנזים ה-RNAA.

יש לחזור על הליך ניקוי ה-DNA כפי שבוצע קודם לכן. שימוש ראשוני בפנול רווי בבופר ולאחר מכן מעבר לפנול כלורופורם איזואמיל אלכוהול יצמצם את מספר שלבי הניקוי הנדרשים, שכן הזיהומים היחידים שנותרו כעת הם אנזים ה-RNA A ו-RNA מעוכב. כעת, כאשר הדגימה מכילה DNA בלבד, יש להשקיף את ה-DNA מהתמיסה על ידי הוספת נפח של 1/10 סודיום אצטט ונפח אחד של איזופרופנול.

לחלופין, ניתן להוסיף שני וחצי נפחים של אתנול, אך במקרה זה יידרש מבחנה גדולה יותר. הדגרו את הדגימה בטמפרטורה של 20- °C למשך 30 דקות עד שעה, או במהלך הלילה אם אתם עובדים בשעות מאוחרות. כעת, מכיוון שאתם עובדים עם DNA, ודאו שהדגימה נשארת על קרח כדי למנוע את פירוקה.

סבבו את הדגימה ב-14,000 RPM למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס כדי לשקיע את ה-DNA המשוקק. הסירו את הנוזל העליון (supernatant) בזהירות כדי לא להזיז את המשקע, במטרה להסיר מלחים עודפים שעלולים להפריע לניסויים מאוחרים יותר כמו ריצוף. לדוגמה, הוסיפו 1 mL של ethanol 70% מקורר וערבבו בעדינות כדי להחזיר את הדגימה למצב של תליה (resuspend).

סבבו את הדגימה פעם נוספת במהירות של 14,000 RPM למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. הסירו בזהירות את supernatant והניחו לכל שארית אתנול להתייבש באוויר למשך עד חמש דקות. חשוב לא לייבש את הדגימה יתר על המידה.

לבסוף, ה-DNA מטוהר ומוכן להמסה מחדש בבופר לבחירתכם. כאן אנו משתמשים במים מזוקקים שעברו אוטוקלאב. זהו.

אחסנו את דגימות ה-DNA בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. לאחר השלמת האקסטרקציה, יש להעריך את האיכות והכמות של ה-DNA. פעולה זו מבוצעת באמצעות ספקטרומטריה באמצעות NanoDrop 2000; הגדירו את סוג המדידה כ-nucleic acid, בחרו ב-DNA 50 לצורך החישוב, ובצעו כיול למכשיר באמצעות 1.5 µL של מים.

נקה את תושבת המדידה (pedestal) ובצע מדידת בלאנק (blank) באמצעות 1.5 µL של מדלל. במקרה זה, מים מזוקקים. נקה את תושבת המדידה, טען 1.5 µL של דגימה ולחץ על כפתור המדידה. כן. מצוין.

יחס של 1.8 בין A260 ל-A280 הוא אידיאלי בשלב זה. ה-DNA שלכם מוכן לשימוש ביישומים המשכיים, הכוללים, בין היתר, מערכים (Arrays), היברידיזציה גנומית השוואתית, שיקוע חיסוני של DNA מתילציה (Methylated DNA immunoprecipitation) וריצוף.

הקישורים לפרוטוקולים אלו מוצגים כאן, למקרה שלא יהיו נחוצים באופן מיידי. אחסנו את הדגימות שלכם בטמפרטורה של 20- °C לשימוש מאוחר יותר.