Name: Assay מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור Mitophagy ניטור השמרים Saccharomyces cerevisiae (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: למד מעקב אחר מיטופאגיה בשמרים Saccharomyces cerevisiae באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי וחיישן pH דו-פליטה Mt Rosea. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור את תהליכי הפירוק המיטוכונדריאלי בתאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המועצה למחקר האוסטרלי גרנט DP0986937.

<ol><li>Levine, B., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+the+pathogenesis+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Autophagy in the pathogenesis of disease.</a> Cell. 132, 27-42 (2008).</li>
<li>Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451, 1069-1075 (2008).</li>
<li>He, C., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+mechanisms+and+signaling+pathways+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation mechanisms and signaling pathways of autophagy.</a> Annu. Rev. Genet. 43, 67-93 (2009).</li>
<li>Kroemer, G., Mariño, G., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+the+integrated+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Autophagy and the integrated stress response.</a> Mol Cell. 40, 280-293 (2010).</li>
<li>Camougrand, N., Kissová, I., Salin, B., Devenish, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+mitophagy+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Monitoring mitophagy in yeast.</a> Methods Enzymol. 451, 89-107 (2008).</li>
<li>Yen, W. L., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+live+long+and+prosper%3A+autophagy%2C+mitochondria%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">How to live long and prosper: autophagy, mitochondria, and aging.</a> Physiology (Bethesda). 23, 248-262 (2008).</li>
<li>Tolkovsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitophagy.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1793, 1508-1515 (2009).</li>
<li>Bhatia-Kissová, I., Camougrand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+in+yeast%3A+actors+and+physiological+roles%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Res%22%5BJournal%5D)">Mitophagy in yeast: actors and physiological roles.</a> FEMS Yeast Res. 10, 1023-1034 (2010).</li>
<li>Kanki, T., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+mechanism+of+mitochondria+autophagy+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The molecular mechanism of mitochondria autophagy in yeast.</a> Mol. Microbiol. 75, 795-800 (2010).</li>
<li>Nowikovsky, K., Reipert, S., Devenish, R. J., Schweyen, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mdm38+protein+depletion+causes+loss+of+mitochondrial+K%2B%2FH%2B+exchange+activity%2C+osmotic+swelling+and+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Mdm38 protein depletion causes loss of mitochondrial K+/H+ exchange activity, osmotic swelling and mitophagy.</a> Cell Death Differ. 14, 1647-1656 (2007).</li>
<li>Devenish, R. J., Prescott, M., Turcic, K., Mijaljica, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+organelle+turnover+in+yeast+using+fluorescent+protein+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Monitoring organelle turnover in yeast using fluorescent protein tags.</a> Methods Enzymol. 451, 109-131 (2008).</li>
<li>Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosella%3A+a+fluorescent+pH-biosensor+for+reporting+vacuolar+turnover+of+cytosol+and+organelles+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast.</a> Autophagy. 4, 205-213 (2008).</li>
<li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate%2Fsingle-stranded+carrier+DNA%2Fpolyethylene+glycol+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods Enzymol. 350, 87-96 (2002).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בתמונות שהוצגו נציג איור. 2B ו - 2C ניתן לראות בבירור כי השימוש אברון ספציפי כתבים פלורסנט מיקרוסקופ פלואורסצנטי מספק ראיות של לוקליזציה והפצה המיטוכונדריה / בגידול והן חנקן מורעבים התאים, ומאפשר mitophagy להיות דמיינו. זה יש להדגיש כי שיטה זו אינה מוגבלת mitophagy הבאה. Autophagy של מרכיבים תאיים אחרים או אברונים (למשל, הריבוזומים, טיפות השומנים, peroxisomes, reticulum endoplasmic ואת הגרעין) עשוי להיות במעקב עם תיוג מתאים. פרטי לבנות את biosensor רוזלה, תרבות תנאים התא תוצאות אופייני מחזור של גרעין (nucleophagy) דווחו 11,12 הממחישות את היישום הרחב יותר של השיטה. השימוש אברון ספציפי כתבים ניאון עבור autophagy ניטור דורש כמה שיקולים של תכנון לבנות כדי לזכור. אלה כוללים: (1) סלקציה היתוך האות המיקוד המתאים כדי להשיג אברון ספציפי מיקוד, (2) בחירה של חלבון פלואורסצנטי מתאים (ים): (3) פליטת הקרינה חזקה; (4) לתקן לוקליזציה אברון ו / או חלוקה בתוך התא. לאחר הכתב אברון ספציפי באה לידי ביטוי בהצלחה מארח את השמרים נבחר זן קבוצה שנייה של שיקולים להיות: (1) צמיחה שמרים תנאים; (2) מדגם הכנה התא; (3) הדמיה פרמטרים כמו חשוב הפרמטרים שנבחרו עבור CLSM (למשל, עוצמת הלייזר, סריקה קצב ומצב, ערך חריר, ערך הזום, מטרות שימוש או חשיפה CCD-מצלמה) נשמרות לאורך ניסוי להבטיח כי ניתן לבצע השוואות בין שליטה (תאים גדל) דגימות רעב: ( 3) אינדוקציה autophagy ומוצלחת המסירה של כתב לתוך vacuole. בסך הכל, זו שיטה מיקרוסקופית פלורסנט קל, מהיר יחסית, ויש לו פוטנציאל היישום ההקרנה תפוקה גבוהה עבור תרופות חדישות המשפרות או לעכב autophagy, וכן גנים המווסתים או לווסת autophagy.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב / ציוד </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> Saccharomyces cerevisiae EasyComp טרנספורמציה Kit </td><td> Invitrogen </td><td> K5050-01 </td></tr><tr><td> חנקן שמרים ללא בסיס חומצות אמינו אמוניום סולפט </td><td> BD Difco </td><td> 200-0030 </td></tr><tr><td> התכה נמוכה agarose </td><td> Progen Biosciences </td><td> 200-0030 </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ שקופיות (76 x 26 מ&quot;מ) </td><td> Menzel-גלזר </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ coverslips (22 x 22 מ&quot;מ) </td><td> Menzel-גלזר </td><td> BB022022A1 </td></tr><tr><td> לייזר Confocal סריקת מיקרוסקופ Fluoview FV500 </td><td> אולימפוס </td><td></td></tr><tr><td> CMAC-Arg </td><td> Moleular בדיקות-Invitrogen </td><td> Y-7531 </td></tr></tbody></table> כל ריכוזי נתון w / v, אלא אם צוין אחרת. שמרים בינוני מינימלי (YMM): 0.67% חנקן שמרים ללא בסיס חומצות אמינו, גלוקוז 2%, אגר 1.5% (מוסף רק בעת ביצוע התקשורת מוצק) וכל תוספי auxotrophic הנדרש (0.01%)]. Saccharomyces מלחים (SS): (NH 4) 2 S0 4, 0.12%; KH 2 PO 4, 0.10%, 0.6% MgC1 2 H2O, 0.07; NaC1, 0.05%; CaCl2, 0.01%; FeC1 3, 0.0005%. בינוני צמיחה: אס ואתנול 2% (v / v) ותוספי auxotrophic המתאים. חנקן רעב בינוני: 0.17% חנקן שמרים ללא בסיס חומצות אמינו אמוניום סולפט (Difco), 2% אתנול (v / v).

assay מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור mitophagy ניטור השמרים saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy חשוב מחזור של רכיבים סלולריים תחת מגוון של תנאים שונים. זה ממלא תפקיד חיוני homeostatic וכן בקרת איכות מנגנון שיכול היעד סלקטיבי לבזות חומר הסלולר כולל organelles1-4. לדוגמה, פגום או מיותר המיטוכונדריה (איור 1), לא מסולק על ידי autophagy, יכול לייצג איום על הומאוסטזיס הסלולר הישרדות התא. ב השמרים, Saccharomyces cerevisiae, חסך תזונתי (למשל, רעב חנקן) או נזק יכול לקדם מחזור סלקטיבית של המיטוכונדריה על ידי autophagy בתהליך שמכונה mitophagy 5-9. אנו מתארים גישה פשוטה מיקרוסקופ פלואורסצנטי להעריך autophagy. לשם הבהירות אנו להגביל את התיאור שלנו כאן כדי להראות עד כמה הגישה ניתן להשתמש כדי לפקח mitophagy בתאי שמרים. Assay עושה שימוש כתב ניאון, רוזלה, המהווה biosensor כפול הפליטה הכוללת חלבון יחסית-pH יציב ניאון אדום קשור חלבון ה-pH רגיש פלואורסצנטי ירוק. המבצע של הכתב הזה מסתמך על ההבדלים בין ה-pH (5.0-5.5 pH ~) vacuole ו (pH 8.2 ~) המיטוכונדריה בתאים חיים. תחת תנאי גידול, סוג התאים בר התערוכה הן פלואורסצנטי אדום וירוק מופץ מאפיין בצורה של המיטוכונדריה. פליטת הקרינה לא קשורה vacuole. כאשר נתון רעב חנקן, מצב אשר גורם mitophagy, בנוסף פלואורסצנטי אדום וירוק תיוג במיטוכונדריה, תאים התערוכה הצטברות של האדומים, אבל לא פלואורסצנטי ירוק, את לומן vacuolar חומצי המייצג את המסירה של המיטוכונדריה כדי vacuole. ניקוד תאים עם אדום, אבל vacuoles ניאון ירוק לא יכול לשמש כמדד לפעילות mitophagic בתאים 5,10-12.

גישה חזקים כדי לפקח על משלוח של האברונים את לומן חומצי של vacuole את השמרים במשך השפלה ומיחזור מתואר. השיטה מסתמכת על תיוג הספציפי של האברונים היעד עם פלואורסצנטי כפול פליטת מקודדים גנטית pH-biosensor, ויזואליזציה של תאים בודדים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Assay מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור Mitophagy ניטור השמרים Saccharomyces cerevisiae

אוטופגיה חשובה עבור תחלופה של רכיבים תאיים תחת מגוון תנאים שונים. היא ממלאת תפקיד הומאוסטטי חיוני, כמו גם...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לעקוב אחר העברה של מיטוכונדריה אל תוך ה-vacuole כאמצעי ללימוד האוטופגיה של מיטוכונדריה, תהליך הידוע כ-mitophagy. דבר זה מושג על ידי ביטוי בתאי שמרים של ביו-סנסור של pH עם פלואורסצנציה כפולה, המקודד גנטית ומכוון למיטוכונדריה, הנקרא Mt Rosea, המסמן מיטוכונדריה בפלואורסצנציה אדומה וירוקה. כשלב שני, תאי השמרים נחשפים להרעבה בחנקן כדי להשרות אוטופגיה.בשלב הבא, אנו בוחנים את התאים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית או מיקרוסקופיה קונפוקלית לסריקת לייזר כדי להמחיש את ספיגת המיטוכונדריה אל תוך ה-va. התוצאות המתקבלות מראות הצטברות של פלואורסצנציה אדומה אך לא ירוקה ב-VAs של תאים המורעבים בחנקן. דירוג אוטופגיה של תאים באוכלוסייה מאפשר לקבוע את מידת המיטופגיה.שימוש ב-rosea למעקב אחר העברה של מיטוכונדריה אל הוואקואולה של תאי שמרים יכול לספק תובנות מכניסטיות לגבי תהליך ה-mii. ניתן להתאים את הגישה למעקב אחר אוטופגיה של מדורים תאיים אחרים, כגון הגרעין, להדגמה של הפרוצדורה על ידי dalibor alica, חוקר פוסט-דוקטורט מהמעבדה שלנו. בפרוטוקול זה אנו משתמשים בזן הפרא BY 4 7 41, ובזן מוטנט עם מחיקה delta A TG three, שנגזר מאותו רקע גנטי, כדי להמחיש את הלוקליזציה של המיטוכונדריה.בזנים אלו, הם מסומנים באמצעות רפורטר פלואורסצנטי. Rosea Rosea הוא ביו-סנסור בעל פליטה בצבעים כפולים, המורכב מחלבון פלואורסצנטי אדום יציב יחסית ל-pH ומחלבון פלואורסצנטי ירוק הרגיש ל-pH. רצף מטרה מיטוכונדריאלי משמש להכוונת הביו-סנסור Rosea למטריקס המיטוכונדריאלי.חלבון דגלי זה נקרא Mt.Rosea. ב-pH גבוה, הביוסנסור פולט פלואורסצנציה הן באדום והן בירוק. עם זאת, ב-pH נמוך, הוא פולט פלואורסצנציה באדום בלבד. זן הטיפוס הפראי משמש כביקורת להצגת רמות האוטופגיה המצופות בדרך כלל כביקורת שלילית.זן שבו ביטוי של גן אוטופגיה חיוני הוא בטל (null) הוא מתאים. מכיוון שזן כזה אינו יכול להעביר מיטוכונדריה לוואקואולה, נעשה שימוש בפרוצדורות סטנדרטיות כדי להעביר (transform) לשמרי הזנים את הפלסמיד הנושא את הדיווח rosala המכוון למיטוכונדריה. צלחות גידול מדגרות במשך יומיים עד ארבעה ימים ב-28 עד 30 °C עד להופעת מושבות בקוטר של כ-2 עד 3 מ"מ. כדי לגדל תאים להשראת אוטופגיה, יש להוסיף עבור כל זן מושבת שמרים בודדת לתוך 10 ml של מצע גידול המכיל מקור פחמן שאינו תסיס.במקרה זה, אתנול ותוספי תזונה מתאימים. מגדלים תרביות כפולות עבור כל זן, מה שמוביל לסך של ארבעה תרביות. מדגרי את תרביות השמרים למשך כ-48 שעות בטמפרטורה של 28 עד 30 מעלות צלזיוס עם ניעור אורביטלי, עד שיתגשלו התרביות לשלב הלוגריתמי האמצעי (mid log phase) של הצמיחה.בסיום תקופת הדגירה, העבירו שתי דגימות של 1 ml מכל תרבית למבחנות צנטריפוגה מפלסטיק עם מכסה בנקישה (Snap cap) בנפח 1.7 ml. שקעו בעדינות את התאים באמצעות צנטריפוגה במהירות נמוכה. לאחר הצנטריפוגה, הסירו בזהירות והשליכו את העליון (supernatant) מכל מבחנה, מבלי להפריע למשקע התאים.שטפו את התאים עם מיליליטר אחד של מים מזוקקים סטריליים על ידי השהיה (resuspension), ולאחר מכן ביצעו צנטריפוגציה. חזרו על השטיפה פעמיים נוספות כדי להסיר שאריות של מצע גידול. לאחר השטיפה השלישית, השהו מחדש את התאים ב-100 microliters של מצע גידול או מצע להרעבת חנקן.מדיום להרעבת חנקן מכיל את מקור הפחמן אתנול, אך חסר תוספי חנקן, והוא ישרה אוטופגיה בתאים. לאחר מכן, זרע מחדש את התאים שהושעו לתוך 10 milliliters של מדיום גידול טרי או לתוך 10 milliliters של מדיום להרעבת חנקן.דגרו את התרביות עם ניעור מסובב למשך שש עד 12 שעות לאחר השראת האוטופגיה. מומלץ לאשר את העברתו של Mt Rosea אל ה-vae תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה. ניתן לאתר את ה-vae באמצעות סימון בעזרת צבע פלואורסצנטי כחול המבוסס על קומרין, כגון seven amino four chloro methyl cumerin, המכונה בקיצור L arginine mi cmac arg.אין צורך לבצע סימון באמצעות cmac ARG באופן שגרתי, אך הדבר מומלץ עבור מי שאינם מכירים את המיקום והמראה של הוואקואולה בשמרים. כדי להתחיל את הליך סימון הוואקואולה, העבירו דגימות של מילליטר אחד מכל תרבית למבחנות צנטריפוגה מפלסטיק נפרדות עם מכסה מסוג snap cap בנפח 1.7 מילליטר. לאחר מכן, הוסיפו cmac arg לכל מבחנה.דגרו את המבחנות בטמפרטורה של 28 עד 30 מעלות צלזיוס עם ניעור אורביטלי למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, השקיעו את התאים על ידי צנטריפוגה, השליכו את supernatant, ושטפו את התאים במיליליטר אחד של מים מזוקקים סטריליים על ידי סספנסיון, ולאחריו צנטריפוגה. שטפו את התאים פעמיים נוספות במים מזוקקים סטריליים.שלב זה מסיר שאריות של מצע וצבע cmac arg עודף. לאחר השטיפה השלישית, יש לסספנד מחדש את התאים ב-100 µL של מים מזוקקים סטריליים. התאים מוכנים כעת להרכבה לצורך דימות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית.בעת ביצוע פרוטוקול זה, חשוב מאוד להשתמש בתרביות שמרים שעברו טרנספורמציה טרייה כדי להבטיח קבלת תאי T עם מיטוכונדריה פלואורסצנטית חזקה. כדי להכין תאי שמרים חיים לדימוג באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, ראשית המסו 2 mg של agarose בנקודת התכה נמוכה באליקוויטים נפרדים של 1 mL של מצע גידול ומצע הרעבה לחנקן, על ידי דגירה ב-70 °C למשך שעה אחת; יש לשמור על ה-agarose המומס ב-70 °C. לצורך קיבוע התאים, טפטפו 20 µL של agarose מומס על זכוכית מיקרוסקופ מסומנת בגודל 76 על 26 מ"מ.טפטפו מיד 10 µL מתליון התאים השטוף על גבי מצע ה-aros. כסו את מצע ה-aros עם זכוכית כיסוי בגודל 22 על 22 מילימטרים. התאים יתפשטו על פני השטח של ה-aros מתחת לזכוכית הכיסוי.לאחר מכן, אטמו בזהירות את קצוות הזכוכית המכסה בעזרת שכבה דקה של לק ציפורניים. פעולה זו תמנע התייבשות ותזוזה של הזכוכית המכסה במהלך הדמיה. כאשר הלק יבש לחלוטין, השקופיות מוכנות לצפייה במיקרוסקופ פלואורסצנציה. באמצעות טכניקה זו, ניתן להבחין בתאים המורכבים למשך עד שעה לאחר ההרכבה, ללא השפעות שליליות ניכרות על התאים.מכיוון שתאי שמרים הם קטנים יחסית, תזדקקו למיקרוסקופ פלואורסצנציה באיכות גבוהה, המצויד במסנני עירור ופליטה המתאימים להדמיה נפרדת של פליטת GFP ופליטת RFP, ולעדשת יעד של 60 x עם טבילה במים בעלת מפתח מספרי של 1.2. תוצאות טיפוסיות שהתקבלו באמצעות ביטוי של MT Rosea בתאי פרא (wild type) ובשימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית עם סריקת לייזר מוצגות כאן בתנאי אי-רעב עם אתנול כמקור פחמן, כאשר תאי הפרא מראים התבצעות תאית טיפוסית של מיטוכונדריה בפריפריה של תאי השמרים, המראים הן פלואורסצנציה אדומה והן פלואורסצנציה ירוקה.פליטת פלואורסצנציה אדומה וירוקה אינה מזוהה בתוך הוואקואולה. כאשר תאי פרא (wild type) המבטאים MT.Rosea נחשפים להרעבה בחנקן למשך שש שעות ומעלה, הם מראים, בנוסף לפלואורסצנציה אדומה וירוקה התואמת למיטוכונדריה, הצטברות של פלואורסצנציה אדומה אך לא ירוקה בוואקואולה.אות זה מעיד על אוטופגיה. הספיגה האוטופגית של המיטוכונדריה היא תאיות. ניתן לאשר בנפרד את הלוקליזציה של rosea באמצעות CMAC arg.בניגוד לכך, בתאי ביקורת שלילית למיטופגיה המבטאים MT.Rosea, שנצפו לפני הרעבה ולאחר שש שעות ומעלה של הרעבה, לא נצפתה הצטברות של פלואורסצנציה אדומה בוואקואולה. בעוד שהסימון המיטוכונדרי נותר חזק כדי להעריך את רמת האוטופגיה בזן הפרא ובזני המוטנט A TG three, נצפו יותר מ-200 תאים לכל זן לצורך בדיקת הצטברות פלואורסצנציה אדומה בוואקואולה לפני השראת האוטופגיה ובנקודות זמן נבחרות לאחר השראת האוטופגיה. שרטוט שיעור התאים המראים הצטברות בוואקואולה מגלה כי מידת הספיגה לוואקואולה עולה עם הזמן בתאי זן הפרא, אך לא בתאי מוטנט delta ATG three אשר אינם יכולים להעביר מיטוכונדריה לוואקואולה לאחר התפתחותה. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום האוטופגיה לחקור את העברת המיטוכונדריה ואורגנלות אחרות, כגון הגרעין, לוואקואולה תחת תנאי גידול שונים בתאים אלו.

a-fluorescence-microscopy-assay-for-monitoring-mitophagy-yeast

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

GFP-Fusion חלבונים נמצאים בשימוש נרחב כדי להמחיש האברונים ידי מיקרוסקופיה confocal. אולם, ההקרנה של מוטציות המשפיעות על המורפולוגיה של האברונים בדרך כלל דורש mutagenesis הפרט היא זמן רב. הנה, אנחנו מדגימים שיטה לשלב בו זמנית אברון-GFP סמנים כמעט 5,000 שאינם חיוניים גנים בשמרים.

שיטת תפוקה גבוהה ברחבי העולם כדי ללמוד את המורפולוגיה של אברון cerevisiae ס

כמותי תא חי פלואורסצנטי, מיקרוסקופ ניתוח של שמרים ביקוע

מאמר זה מתאר את השימוש בחלבון היתוך לוציפראז-GFP גחלילית...

מבחני יחד לrefolding החלבון בניטור<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

שתי שיטות משלימות המבוססות על הזרימה cytometry ומיקרוסקופיה מוצגות המאפשרות כימות, ברמת התא הבודד, של הדינמיקה של ביטוי גנים הנגרמת על ידי ההפעלה של מסלול MAPK בשמרים.

כימות זמניות של ביטוי MAPK מושרה בתאי שמרים יחיד

כאן, אנו מתארים בפירוט גישת מיקרוסקופ וידאו זמן-lapse למדידת הגיוס הזמני של EYFP-Parkin במהלך הסרה סלקטיבית של מיטוכונדריה פגומה. תהליך דינמי זה של הסרה תלויה ב-EYFP-Parkin של מיטוכונדריה פגומה יכול לשמש כאינדיקטור לבריאות התא בתנאי ניסוי שונים.

זמן לשגות מיקרוסקופית וידאו עבור הערכת EYFP-פרקין Aggregation כסמן לסלולאריות Mitophagy

Mitophagy, התהליך של פינוי נפגע המיטוכונדריה, הוא הכרחי עבור תחזוקה מיטוכונדריאלי הומאוסטזיס ובריאות. מאמר זה מציג חלק mitophagy האחרונה שיטות זיהוי תאים אנושיים, Caenorhabditis elegansועכברים.

במבחנה and In Vivo זיהוי של Mitophagy ב תאים אנושיים, C. Elegansועכברים

Mitophagy, השפלה סלקטיבי של המיטוכונדריה, היה מעורב הומאוסטזיס מיטוכונדריאלי, הוא deregulated למחלות אנושיות שונות. עם זאת, שיטות נסיוניות נוח למדידת פעילות mitophagy מוגבלים מאוד. כאן, אנו מספקים וזמינותו רגיש למדידת פעילות mitophagy באמצעות cytometry זרימה.

מדידה רגיש של Mitophagy מאת Flow Cytometry באמצעות תלויי-pH הכתב פלורסנט mt-Keima

כאן, אנו מציגים הדמיה תא חי שהיא שיטת מיקרוסקופ לא רעיל המאפשר לחוקרים ללמוד התנהגות החלבון הדינמיקה הגרעינית בתוך חי ביקוע תאים שמרים במהלך מיטוזיס ו meiosis.

בחינת Mitotic ומיוטיק ביקוע הדינמיקה הגרעינית על ידי הזריחה לחיות-מיקרוסקופ התא

מיטופגיה היא המנגנון העיקרי של בקרת איכות מיטוכונדריאלית. עם זאת, ההערכה של mitophagy in vivo הוא הפריע על ידי היעדר בדיקות כמותיות אמין. מוצג כאן פרוטוקול לתצפית על מיטופגיה בתאים חיים באמצעות צבע מיטוכונדריה ירוק-פלואורסצנטי המיועד לתאים וצבע ליזוזום אדום-פלואורסצנטי.

הדמיה של מיטופגיה עם צבעים פלואורסצנטיים למיטוכונדריה וליזוזום

חקר מיטופגיה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים, חיישנים גנטיים ואימונופלואורסנציה דורש ציוד יקר, כוח אדם מיומן והשקעת זמן משמעותית. כאן, אנו מדגימים את היעילות של ערכת צבע פלואורסצנטית מסחרית בכימות תהליך המיטופגיה הן ב- Caenorhabditis elegans והן בקו תאים לסרטן הכבד.

איתור מיטופגיה בתאי Caenorhabditis elegans ובתאי יונקים באמצעות צבעים ספציפיים לאברונים

מי חמצן (H 2 O2) הםגם מקור לנזקי חמצון וגם מולקולת איתות. פרוטוקול זה מתאר כיצד למדוד H 2 O2מיטוכונדריאלי באמצעות HyPer7 ממוקד מיטוכונדריה (mtHyPer7), ביוסנסור יחסי מקודד גנטית, בשמרים חיים. הוא מפרט כיצד לייעל את תנאי ההדמיה ולבצע אנליזה כמותית תאית ותת-תאית באמצעות תוכנה זמינה באופן חופשי.

הדמיה של mtHyPer7, ביוסנסור רציומטרי למי חמצן מיטוכונדריאליים, בתאי שמרים חיים

למד מעקב אחר מיטופאגיה בשמרים Saccharomyces cerevisiae באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי וחיישן pH דו-פליטה Mt Rosea. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור את תהליכי הפירוק המיטוכונדריאלי בתאים.

Assay מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור Mitophagy ניטור השמרים Saccharomyces cerevisiae

גלה סרטונים נוספים