Name: טיטרציה Calorimetry מקורר באופן איזוטרמי עבור מדידת מקרומולקולה-ליגנד זיקה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: למד טיטרציה קלורימטרית איזותרמית לחקר קישור ליגנד-מקרומולקולה בביוכימיה. השיטה מאפשרת קביעת פרמטרים תרמודינמיים כולל אנתלפיה ואנטרופיה מניסוי אחד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי NSF מענק MCB-0817827.

<ol><li>Wiseman, T., Williston, S., Brandts, J. F., Lin, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+measurement+of+binding+constants+and+heats+of+binding+using+a+new+titration+calorimeter%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter.</a> Anal. Biochem. 179, 131-137 (1989).</li>
<li>Jelesarov, I., Bosshard, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+titration+calorimetry+and+differential+scanning+calorimetry+as+complementary+tools+to+investigate+the+energetics+of+biomolecular+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">Isothermal titration calorimetry and differential scanning calorimetry as complementary tools to investigate the energetics of biomolecular recognition.</a> J. Mol. Recognit. 12, 3-18 (1999).</li>
<li>Velazquez-Campoy, A., Leavitt, S. A., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+protein-protein+interactions+by+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of protein-protein interactions by isothermal titration calorimetry.</a> Methods Mol. Biol. 261, 35-54 (2004).</li>
<li>Turnbull, W. B., Daranas, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+value+of+c%3A+can+low+affinity+systems+be+studied+by+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">On the value of c: can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 14859-14866 (2003).</li>
<li>Fukada, H., Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enthalpy+and+heat+capacity+changes+for+the+proton+dissociation+of+various+buffer+components+in+0.1+M+potassium+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Enthalpy and heat capacity changes for the proton dissociation of various buffer components in 0.1 M potassium chloride.</a> Proteins. 33, 159-166 (1998).</li>
<li>Houtman, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+multisite+binary+and+ternary+protein+interactions+by+global+analysis+of+isothermal+titration+calorimetry+data+in+SEDPHAT%3A+application+to+adaptor+protein+complexes+in+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Studying multisite binary and ternary protein interactions by global analysis of isothermal titration calorimetry data in SEDPHAT: application to adaptor protein complexes in cell signaling.</a> Protein Sci. 16, 30-42 (2007).</li>
<li>Bradrick, T. D., Beechem, J. M., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unusual+binding+stoichiometries+and+cooperativity+are+observed+during+binary+and+ternary+complex+formation+in+the+single+active+pore+of+R67+dihydrofolate+reductase%2C+a+D2+symmetric+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Unusual binding stoichiometries and cooperativity are observed during binary and ternary complex formation in the single active pore of R67 dihydrofolate reductase, a D2 symmetric protein.</a> Biochemistry. 35, 11414-11424 (1996).</li>
<li>Shenoy, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisite+and+multivalent+binding+between+cyanovirin-N+and+branched+oligomannosides%3A+calorimetric+and+NMR+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Multisite and multivalent binding between cyanovirin-N and branched oligomannosides: calorimetric and NMR characterization.</a> Chem. Biol. 9, 1109-1118 (2002).</li>
<li>Chopra, S., Lynch, R., Kim, S. H., Jackson, M., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+temperature+and+viscosity+on+R67+dihydrofolate+reductase+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of temperature and viscosity on R67 dihydrofolate reductase catalysis.</a> Biochemistry. 45, 6596-6605 (2006).</li>
<li>Norris, A. L., Serpersu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+Coenzyme+A+with+the+Aminoglycoside+Acetyltransferase+%283%29-IIIb+and+Thermodynamics+of+a+Ternary+System%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Interactions of Coenzyme A with the Aminoglycoside Acetyltransferase (3)-IIIb and Thermodynamics of a Ternary System.</a> Biochemistry. 49, 4036-4042 (2010).</li>
<li>Falconer, R. J., Penkova, A., Jelesarov, I., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+of+the+year+2008%3A+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">Survey of the year 2008: applications of isothermal titration calorimetry.</a> J. Mol. Recognit. 23, 395-413 (2010).</li>
<li>Ababou, A., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+of+the+year+2005%3A+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">Survey of the year 2005: literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> J. Mol. Recognit. 20, 4-14 (2007).</li>
<li>Buurma, N. J., Haq, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+analysis+of+isothermal+titration+calorimetry+data+for+ligand-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Advances in the analysis of isothermal titration calorimetry data for ligand-DNA interactions.</a> Methods. 42, 162-172 (2007).</li>
<li>Salim, N. N., Feig, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+titration+calorimetry+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Isothermal titration calorimetry of RNA.</a> Methods. 47, 198-205 (2009).</li>
<li>De, M., You, C. C., Srivastava, S., Rotello, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+interactions+of+proteins+with+functionalized+nanoparticles%3A+a+thermodynamic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Biomimetic interactions of proteins with functionalized nanoparticles: a thermodynamic study.</a> J. Am. Chem. Soc. 129, 10747-10753 (2007).</li>
<li>Velazquez-Campoy, A., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+titration+calorimetry+to+determine+association+constants+for+high-affinity+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands.</a> Nat. Protoc. 1, 186-191 (2006).</li>
<li>Velazquez Campoy, A., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ITC+in+the+post-genomic+era...%3F+Priceless%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+Chem%22%5BJournal%5D)">ITC in the post-genomic era...? Priceless.</a> Biophys. Chem. 115, 115-124 (2005).</li>
<li>Harries, D., Rau, D. C., Parsegian, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solutes+probe+hydration+in+specific+association+of+cyclodextrin+and+adamantane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Solutes probe hydration in specific association of cyclodextrin and adamantane.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 2184-2190 (2005).</li>
<li>Chervenak, M. C., Toone, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+measure+of+the+contribution+of+solvent+reorganization+to+the+enthalpy+of+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A direct measure of the contribution of solvent reorganization to the enthalpy of binding.</a> J. Am. Chem. Soc. 116, 10533-10539 (1994).</li>
<li>Taneva, S. G., Moro, F., Velazquez-Campoy, A., Muga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energetics+of+nucleotide-induced+DnaK+conformational+states%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Energetics of nucleotide-induced DnaK conformational states.</a> Biochemistry. 49, 1338-1345 (2010).</li>
<li>Jelesarov, I., Bosshard, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics+of+ferredoxin+binding+to+ferredoxin%3ANADP%2B+reductase+and+the+role+of+water+at+the+complex+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics of ferredoxin binding to ferredoxin:NADP+ reductase and the role of water at the complex interface.</a> Biochemistry. 33, 13321-13328 (1994).</li>
<li>Burrows, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+monomer-dimer+equilibrium+of+interleukin-8+reveals+it+is+a+monomer+at+physiological+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of the monomer-dimer equilibrium of interleukin-8 reveals it is a monomer at physiological concentration.</a> Biochemistry. 33, 12741-12745 (1994).</li>
<li>Baker, B. M., Murphy, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+linked+protonation+effects+in+protein+binding+reactions+using+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Evaluation of linked protonation effects in protein binding reactions using isothermal titration calorimetry.</a> Biophys. J. 71, 2049-2055 (1996).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

המרכז לטניס בישראל כבר נעשה שימוש נרחב בחקר אינטראקציות ליגנד מקרומולקולה, עם 11 מחקרים מסתכל ליגנד חלבון, 12 ליגנד-DNA ו-RNA-13 מקרומולקולה 14 מחקרים. המרכז לטניס בישראל יכול להיות אפילו לרוץ עם חומרים מוצקים, כגון חלקיקים, כי הטופס השעיות אחיד. 15 יתר על כן, מערכות משולשת, שבו ליגנד קשור כבר מקרומולקולה לבין ליגנד השני הוא טיטרציה, יכול לשמש כדי לקבוע את התרמודינמיקה של, עבור למשל, מחייב המצע מערכת אנזימים cofactor. 7 מחקרים יכול להיות גם ביצע עבור מולקולות עם זיקות מחייבות גבוהה מאוד שבדרך כלל עולה על גבול הגילוי של המרכז לטניס בישראל על ידי ביצוע מבחני התחרות מחייב עם ligands מחייב החלשות. 16 מידע על הכריכה חלושות ligands ניתן גם להשיג על ידי מבחני התחרות. 17 תפקיד המים מחייב יכול להיחקר על ידי המרכז לטניס בישראל, 18 יחד עם התלות של אנתלפיה על ארגון מחדש ממס. 19 לאחרונה, תרמודינמיקה של שינוי קונפורמציה של וריאנטים DNAK נמדדו על הכריכה של ADP ו - ATP. 20 חלבונים העמותה ניתן ללמוד על ידי המרכז לטניס בישראל, מניב מידע על מתחמי הטרו 21, כמו גם על הומו אסוציאציה. 22 השפעות טמפרטורה על אנתלפיה מחייב ייתן את קיבולת החום של האירוע מחייבות. 2 מספר פרוטונים נספג או שוחרר על הכריכה יכול להיות גם נקבע מניסויים שבוצעו עם enthalpies מאגרים שונים של יינון. 5 אם ITC מחקרים נוספים נעשים על ערכי pH שונים, אז PKA של הקבוצה מעורבת עלולה להיות נחוש. 23 לסיכום, מדידות מדויקות של ריכוז מקרומולקולה לבין ליגנד הם הכרח עבור ניסוי ITC טוב. ריכוזים לדוגמה גם צריך להיות בטווח הנכון כדי לקבל נתונים מהימנים. יש להקפיד עם למאגר כמו זיהומים מולקולה קטנה אי התאמות pH תגרום חפצים thermogram.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> 1.7 microcentrifuge צינורות מ&quot;ל </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 02-681-282 </td></tr><tr><td> 15 מ&quot;ל בז צינורות </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 14-959-49B </td></tr><tr><td> 2.5 מ&quot;ל במזרק המילטון </td><td> MicroCal </td><td> SYN161714 </td></tr></tbody></table>

טיטרציה calorimetry מקורר באופן איזוטרמי עבור מדידת מקרומולקולה-ליגנד זיקה

Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity

Calorimetry טיטרציה מקורר באופן איזוטרמי (ITC) הוא כלי שימושי להבנת התמונה התרמודינמית מלאה של התגובה מחייב. בשנת למדעי הביולוגיה, אינטראקציות macromolecular חיוניים להבנת המנגנון של התא. תנאי הניסוי, כגון חיץ וטמפרטורה, ניתן להתאים את המערכת מחייב מסוים הנלמד. עם זאת, תכנון זהיר נדרש מאז ליגנד מסוים טווחי הריכוז מקרומולקולה נחוצים כדי להשיג מידע שימושי. ריכוזים של מקרומולקולה לבין ליגנד צורך לקבוע במדויק את תוצאות אמינות. טיפול גם צריך לקחת בעת הכנת הדגימות כמו זיהומים יכולים להשפיע משמעותית על הניסוי. כאשר ניסויים המרכז לטניס בישראל, יחד עם בקרות, מבוצעות כהלכה, מידע שימושי מחייב, כגון הזיקה stoichiometry ו אנתלפיה, מתקבלים. על ידי הפעלת ניסויים נוספים תחת חוצץ שונה או בתנאי טמפרטורה, מידע מפורט יותר ניתן לקבל על המערכת. פרוטוקול עבור ההתקנה הבסיסית של ניסוי המרכז לטניס בישראל הוא נתון.

פרוטוקול כללי לשימוש calorimetry טיטרציה מקורר באופן איזוטרמי לפקח על התרמודינמיקה מחייב עבור מערכות ביולוגיות עם זיקות מחייבות מתונה מוצג.

טיטרציה Calorimetry מקורר באופן איזוטרמי עבור מדידת מקרומולקולה-ליגנד זיקה

קלורימטריה של טיטרציה איזותרמית (ITC) היא כלי שימושי להבנת התמונה התרמודינמית המלאה של תגובת קישור. במערכות ביולוגיות...

המטרה הכללית של נוהל זה היא להדגים טכניקה כללית לחקר קישור בין ליגנד למקרו-מולקולה באמצעות קלורימטריית טיטראציה איזותרמית, או ITC. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת תמיסות ליגנד ומקרו-מולקולה נקיות מזיהומים, המותאמות הן בהרכב הבאפר והן ב-pH. לאחר מכן נקבעים הריכוזים הסופיים של תמיסות הליגנד והמקרו-מולקולה.בשלב הבא נקבעים הפרמטרים הניסיוניים של ה-ITC, ולאחריהם נערך איסוף הנתונים. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא ניתוח והתאמה (fitting) של הנתונים. לבסוף, מתקבלים תוצאות המראות אינטראקציות בין ליגנד למקרומולקולה באמצעות ניתוח גרפי של נתוני הטיטרציה, כדי לקבוע את פרמטרי הקישור והתרמודינמיקה.היתרון המרכזי של טכניקת קישור זו על פני שיטות קיימות, כגון תימותר (titrations) של בליעה ופלואורסצנציה, הוא שניתן לקבוע את האנתלפיה, ובכך גם את האנטרופיה של הקישור, מאותו ניסוי. הכנת הדגימה מתחילה בקביעת הריכוזים המתאימים עבור המקרו-מולקולה והליגנד. שלב קריטי לקבלת התאמות ITC מדויקות, שיש להביאו בחשבון בעת חישוב ריכוזים אלו, מפורט בנוהל הכתוב.בהדגמה זו, נבחן את קישורו של הקו-פקטור N-A-D-P-H לאנזים dihydro folate reductase הכרומוזומלי של e coli. ראשית, שחזרו את המקרו-מולקולה הליופיליזית בבופר עד להגעה לריכוז הרצוי, ולאחר מכן המיסו את הליגנד בנפח הבופר הדרוש. לאחר מכן, ודאו שערכי ה-pH של דגימות המקרו-מולקולה והליגנד נמצאים בטווח של פלוס או מינוס 0.05 יחידות pH מהבופר וזה מזה. סובבו בצנטריפוגה, הן את תמיסות ה-dihydro folate reductase הכרומוזומלי והן את תמיסות ה-N-A-D-P-H, בתוך מבחנות מיקרו-צנטריפוגה למשך חמש דקות.במהירות של 8,000 עד 14,000 RPM, פעולה זו תשקיע חלקיקים הנמצאים בתמיסה, אשר עלולים לגרום לארטיפקטים בקו הבסיס של התרמוגרמה של ה-ITC. לאחר הסרכזוגציה, יש לבדוק בקפידה את ריכוזי התמיסות של המקרו-מולקולה והליגנד באמצעות ספקטרוסקופיית UV-Vis ולרשום את ריכוזיהם המדויקים.לאחר מכן, הכינו את הנפח המתאים של כל תמיסת ITC על ידי דילול תמיסות המאגר המוכנות של המקרומולקולה והליגנד לריכוזים הניסויים הדרושים. לבסוף, פנו את הגזים מהדגימות כדי למנוע ארטיפקטים באות עקב בועות אוויר או שחרור של גזים מומסים במהלך התitipiרוציה לפני טעינת המקרומולקולה והליגנד לתוך ה-ITC. נקו את תא הדגימה ואת מזרק ההזרקה בהתאם לפרוטוקול היצרן.לאחר מכן, שטפו את תא הדגימה פעמיים או שלוש באמצעות 1.8 milliliters של מים מזוקקים בעזרת מזרק Hamilton. היזהרו בעת השימוש במזרק, שכן הקצה הארוך נוטה להתכופף בקלות. לאחר מכן, שטפו את תא הדגימה מספר פעמים עם אותו נפח של בופר.לאחר שניקוי תא הדגימה, טענו 1.8 milliliters של תמיסת המקרו-מולקולות לתוך התא. הפסיקו את הוספת הדגימה בזהירות כדי למנוע היווצרות בועות בנקודה שבה התמיסה מופיעה מחוץ לגבעול התא. הסירו בועות אוויר באמצעות מזרק Hamilton על ידי הנעת המחט בעדינות מעלה ומטה לאורך דפנות התא כדי להסיר בועות קיימות.הוציאו את המזרק והסירו כל נפח עודף מהבאר שבראש התא. לאחר מכן, מלאו את תא הייחוס במים מזוקקים. לאחר מכן, חברו מזרק פלסטיק לפתח המילוי של מזרק ההזרקה באמצעות צינורית.פתחו את פתח המילוי בקונסולה של ה-VP viewer 2000. שטפו את מזרק ההזרקה במים מזוקקים, ולאחר מכן בבופר. ודאו שמזרק ההזרקה מרוקן לחלוטין על ידי שאיבת אוויר דרך המערכת.הכניסו את מחט מזרק ההזרקה לתוך תמיסַת הליגנד ושאבו את התמיסה לתוך המזרק עד למילוי מלא. המשיכו לשאוב נפח קטן מעבר לדרוש לתוך הפתח ונתקו את הצינור מיד לאחר סגירת פתח המילוי. נתקו את הצינור ואת מזרק הניקוי מפלסטיק, ומלאו שוב את מזרק ההזרקה פעמיים כדי להסיר בועות אוויר מהמזרק.הוצא את מזרק ההזרקה מתמיסת הליגנד ונגב בעזרת מטפית כימית (chem wipe) טיפות שנותרו על דפנותיו. הקפד לא לגעת עם קצה המזרק במטפית הכימית ולא להניח למזרק להיחבט, שכן הדבר עלול לגרום לאובדן נפח מהמזרק. לאחר מכן, הנח בזהירות את מזרק ההזרקה לתוך תא הדגימה.הגדירו את הפרמטרים להרצת ה-ITC באמצעות תוכנת V VP viewer 2000 המסופקת על ידי Micro Cal עבור מערכות קישור. במקרים של אותות חום חזקים, כגון מערכת ה-N-A-D-P-H של ה-DIHYDROFOLATE reductase הכרומוזומלית, מספר רב של הזרקות בנפח נמוך יספק נקודות נתונים רבות יותר לצורך התאמה (fitting). לעומת זאת, עבור מערכות בעלות אותות חום חלשים, עדיף להשתמש במספר קטן של הזרקות בנפח גדול.עבור ההזרקות הראשונות או השניים, הגדירו את נפח ההזרקה ל-2 µL. הזרקות אלו יסורקו בסופו של דבר מאחר שהן עלולות להניב תוצאות שגויות עקב ערבוב בין תמיסות הליגנד והמקרומולקולה. בעת הזנת הזמן בין ההזרקות, המתינו מספר דקות כדי לאפשר למערכת להגיע לשיווי משקל ולסיגנל החום לחזור לקו הבסיס.לאחר מכן, בחרו את טמפרטורת הניסוי והזינו את מהירות הערבוב של המזרק הדרושה לערבוב הולם של הליגנד והמקרומולקולה במהלך התסמיכה. לאחר הגדרת הפרמטרים הניסויים, התחילו בניסוי. עם סיום הניסוי, אות החום הסופי צריך להיות קרוב לרוויה. נקו את ה-ITC לפי פרוטוקול היצרן, וחזרו על התסמיכות לפחות פעם אחת או פעמיים נוספות כדי לקבל נתונים הדירים.לבסוף, בצעו בקרת ניסוי שבה הליגנד מוטטר לתוך בופר בתא הדגימה כדי לקבוע את חום הדילול של הליגנד; ניתן לבצע בקלות התאמה של הנתונים באמצעות מאקרואים בכל תוכנה להתאמת נתונים. כאן נעשה שימוש ב-Origin seven המסופקת על ידי micro Cal כדי להדגים התאמת נתונים. כדי להתחיל, טענו את קובץ הנתונים הראשון.בדקו את התרמוגרמה הגולמית לאיתור סימנים של בועות אוויר או ארטיפקטים אחרים באות, כגון קפיצות בקו הבסיס או שיאים בהיעדר נקודת הזרקה. סמנו נקודות נתונים אלו שכן יש להסירו. לאחר מכן, טענו את נתוני בקרת המהילול של הליגנד והפחיתו אותם מעקומית הקשירה (binding isotherm) בשלב זה.הסר את כל נקודות הנתונים השגויות, כולל מספר נקודות הנתונים הראשונות של הטיטרציה שבהן מתרחשים בדרך כלל ארטיפקטים של דילול. לאחר מכן, בחר את מודל התאמת הנתונים. לאחר בחירת המודל, ניתן לבצע התאמה לנתונים על ידי הזנה ידנית של ניחושים ראשוניים עבור פרמטרי ההתאמה, כולל סטוכיומטריה, אנתלפיה ואפיניות קישור.עם זאת, אם ידועים פרמטרים מניסויים אורתוגונליים קודמים, יש להזין ערכים אלה כיוון שהם יסייעו למנוע מהנתונים להילכד במינימום מקומי במהלך ההתאמה. לאחר התאמת הנתונים עבור הטיטרציה הראשונה, חזור על שלבי ניתוח הנתונים עבור שאר האיזורמות. לחלופין, ניתן לבצע התאמה גלובלית של הנתונים באמצעות תוכנה כגון said fat; כדי להתחיל התאמה גלובלית, שמור את הנתונים ב-origin כקובץ dot dat.לאחר מכן, ייבא את הנתונים לתוכנת ה-fat האמורה. בחר מודל להתאמה ובצע התאמה גלובלית של הנתונים תוך מעבר הלוך ושוב בין אפשרויות ההתאמה simplex ו-Mark HAR Leven, עד שער ה-chi-squared הגלובלי יגיע למינימום. הליך ה-ITC המייצג המוצג בסרטון זה מנטר את הקישור של N-A-D-P-H ל-dehydro folate reductase כרומוזומלית של e coli.הקישור האקסותרמי של N-A-D-P-H ל-de hydro folate reductase ניכר בתרמוגרמה הגולמית כחום שנפלט. ירידה באותות החום עם כל הזרקה עוקבת מעידה על רוויית הקישור, המתרחשת במהלך המחצית הראשונה של התטיטראציה. טוהר הרכיבים וההתאמה הטובה של הבאפרים ניכרים בחלק הרווי של הגרף, שבו מופיעים אותות חום מינימליים בלבד הנובעים מחום הדילול של הליגנד.הנתונים הותאמו למודל של אתר קישור יחיד באמצעות תוכנת origin כדי לחשוף את איזותרמת הקישור. לאחר מכן, שני מערכי נתונים הותאמו למודל של אתר קישור יחיד באמצעות התאמה זו. הערכים הנמוכים והדפוס האקראי של השאריות מעידים כי הפרמטרים התרמודינמיים סבירים. פרמטרים אלה תוקפו גם באמצעות השוואה לערכי ספרות שהתקבלו בשיטות אורתוגונליות.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן חקר קישור מאקרו-מולקולרי של ליגנדים, באמצעות VP ITC מבית Micro, על ידי הכנת תמיסות בצורה נכונה, הגדרת פרמטרים ניסיוניים וניתוח הנתונים.

isothermal-titration-calorimetry-for-measuring-macromolecule-ligand

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

המרכז לטניס בישראל הוא כלי רב עוצמה ללימוד קשירת ליגנד לארח שלה. במערכות מורכבות עם זאת, מספר דגמים עשוי להתאים את הנתונים באותה מידה. השיטה המתוארת כאן מספק אמצעי על מנת להבהיר את מודל מחייב מתאים מערכות מורכבות לחלץ את פרמטרים תרמודינמיים המקביל.

איסוף משתנה ריכוז מקורר באופן איזוטרמי Calorimetry טיטרציה מערכי נתונים על מנת לקבוע מנגנונים הכבילה

סרטון זה מדגים קלורימטריה של סריקה דיפרנציאלית — טכניקה לחקר האינטראקציה בין ביומולקולה לליגנד. הקישור של אפטמר DNA וליגנד תרמולבילי נחקר על ידי החלת מחזורי חימום וקירור חוזרים ונשנים על הדגימה וקבלת סריקות לאנליזה תרמודינמית.

סריקה דיפרנציאלית קלורימטריה לחקר DNA Aptamer-Thermolabile Ligand אינטראקציה

זרימת חום אמצעי calorimetry טיטרציה Isothermal שוחררה או נספגת בתגובות כימיות. בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לכמת אנזים-קטליזה. במאמר זה, הפרוטוקול להתקנה אינסטרומנטלית, ניתוח ניסוי ריצה, ונתונים מתוארים בדרך כלל, ופנה לאפיון של הידרוליזה אוריאה האנזימטית של urease שעועית שקע.

הביולוגי קטליזה חמה: Isothermal טיטרציה Calorimetry לאפיין תגובות אנזימטיות

פלואורימטריית סריקה דיפרנציאלית היא שיטה בשימוש נרחב לסינון ספריות של מולקולות קטנות לאינטראקציות עם חלבונים. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה להרחבת ניתוחים אלה כדי לספק אומדן של קבוע הדיסוציאציה בין מולקולה קטנה לשותף החלבון שלה.

נחישות של אינטראקציות חלבון ליגנד שימוש דיפרנציאל סריקת Fluorimetry

אנו מציגים פרוטוקול פלואורסנציה למערכות ביולוגיות קיפול ואיגוד אינטראקציות עם thermolabile ליגנדים שימוש דיפרנציאלי calorimetry סריקה מהירה.

מדידת למערכות ביולוגיות DSC פרופילים עם Thermolabile ליגנדים לאפיין במהירות קיפול ואיגוד אינטראקציות

פרוטוקול מפורט לביצוע טיטור אליסה מתואר. יתר על כן, באלגוריתם הרומן מוצג כדי להעריך טיטור ELISAs וכדי להשיג קבוע דיסוציאציה של איגוד של ליגנד מסיסים לקולטן צלחת. מרותק למיטה microtiter.

טיטור אליסה כשיטה לקבוע את קבוע דיסוציאציה של קולטן ליגנד אינטראקציה

מדידות של התרופה היעד אירוסין הן גורם מרכזי פיתוח תרופות יעיל ובדיקת בדיקה כימית. כאן, אנו מפרטים פרוטוקול למדידת סמים-יעד האירוסין באמצעות הדמיה תוכן גבוהה לאגדת microplate תואמי וזמינותו הסלולר shift תרמיים (CETSA).

באמצעות תוכן גבוהה הדמיה לכמת התחייבות היעד תאים חסיד

יציבות תרמית של פעילות אנזים נמדד בקלות על ידי טיטור איזותרמי calorimetry (ITC). כיום, רוב מבחני יציבות חלבון המשמש מדד חלבון התגלגלות, אבל אינם מספקים מידע אודות פעילות אנזימטיות. המרכז לטניס בישראל מאפשר קביעה ישירה ההשפעה של שינויים האנזים על היציבות של פעילות אנזים.

מדידת אנזימטי יציבות על ידי טיטור איזותרמי Calorimetry

תרמופורזה מיקרומטרית מקבלת קבועי כריכה במהירות בעלות חומר נמוכה. תרמופורזה מיקרו-קשקשית ללא תווית או תווית זמינה מסחרית; עם זאת, תווית תרמופורזה חינם אינו מסוגל מגוון של מדידות אינטראקציה שניתן לבצע באמצעות תוויות פלואורסצנטיות. אנו מספקים פרוטוקול למדידות תרמופורזה מתויגות.

שימוש בתרמופורזה מיקרומטרית למדידת אינטראקציות בין חלבון לליפיד

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השימוש בקלורימטריית טיטרציה איזותרמית (ITC) כדי לנתח את קינטיקה של הקשר והדיסוציאציה של הקשירה בין אפטמר DNA לטטרציקלין, כולל הכנת דגימות, הפעלת תקנים ודגימות, ופענוח הנתונים המתקבלים.

קביעת הקשר התרמודינמי והקינטי של אפטמר DNA וטטרציקלין באמצעות קלורימטריה איזותרמית טיטרציה

למד טיטרציה קלורימטרית איזותרמית לחקר קישור ליגנד-מקרומולקולה בביוכימיה. השיטה מאפשרת קביעת פרמטרים תרמודינמיים כולל אנתלפיה ואנטרופיה מניסוי אחד.

טיטרציה Calorimetry מקורר באופן איזוטרמי עבור מדידת מקרומולקולה-ליגנד זיקה

גלה סרטונים נוספים