זיהוי וניתוח של אבות עכבר Erythroid באמצעות CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לזהות תאי אב של כדוריות דם אדומות ישירות ברקמה שנקצרה זה עתה מעכברים. הדבר מאפשר לנו לחקור את תכונותיהם המולקולריות בזמנים שבהם מערכת ההמטופואזה בעכברים אלה עוברת שינוי. לדוגמה, במהלך ההתפתחות העוברית או במהלך התגובה למעקה היפוקסי, תחילה מבודדת רקמה המטופואטית מכבד עוברי של עכבר או מטחול או ממח העצם של עכבר בוגר, ומפורקת לתליה של תאים בודדים.

בשלב הבא, התאים מסומנים באמצעות נוגדנים נגד סמני פני השטח של התא CD 71 ו-TER 19, ונגד סמנים נוספים רלוונטיים, למשל, למדידת הישרדות תאים או מצב מחזור התא. תרחיף התאים המסומנים מנותח לאחר מכן באמצעות מכשיר לציטומטריה זרימה, וסב-אוכלוסיות ספציפיות של אריתרובלסטים בשלבי הבשלה שונים מזוהות. ניתן לטהר סב-אוכלוסיות ספציפיות אלו באמצעות מיון תאים. לאחר מכן, ניתן לבצע ניתוח תאי ומולקולרי עבור כל סב-אוכלוסייה של אריתרובלסטים בשלב הבשלה מסוים.

היכולת לזהות אריתרובלסטים בשלבי הבשלה ספציפיים ישירות ברקמות המטופואטיות שבודדו acabado, מעניקה לנו את ההזדמנות ללמוד על התאים בקורטקס הפיזיולוגי. שיטה זו מאפשרת לפיכך ללמוד על אריתרובלסטים בדרגות הבשלה שונות המגיבים in vivo. כאשר עכברים נחשפים לגירויים, הם מאיצים את קצב ההמטופואזה.

לדוגמה, תנאי היפוקסיה המדמים גובה רב או הזרקה של ההורמון erythropoietin. אנו משתמשים בציטומטריית זרימה רב-פרמטרית כדי לזהות בלאסטים בתוך סביבת רקמה מורכבת ולחקור בו-זמנית את אותות ההישרדות ומצב מחזור התא שלהם. אנו יכולים גם למיין אריתרובלאסטים בשלבי הבשלה ספציפיים ישירות מרקמה טרייה ולבחון את רמות ביטוי הגנים, מצב הכרומטין או תפקודים מולקולריים אחרים שלהם.

ההמטופואזה האריתרואידית הסופית בעכבר מתרחשת בטחול ובמח עצם של עכבר בוגר. לפיכרון, רקמות אלו יואספו מעכבר שהורדמה. לאחר הרדמת העכבר, יש לשאוב דם באמצעות דקירה של הלב אל תוך מבחנות לאיסוף דם המכילות EDTA או הפרין; דם זה ישמש מאוחר יותר לספירת המטוקריט, ספירת רטיקולוציטים או בדיקת CBC.

העבירו את הטחול ועצם הירך שנאספו למבחנות נפרדות המכילות cold staining.Buffer קר. שמרו על הרקמות שנאספו על קרח במידת הצורך. שקלו את הטחול.

עכברים העוברים תגובת סטרס אריתרופואטית צפויים להראות עלייה משמעותית במשקל הטחול. לאחר מכן, תאי טחול ותאי מחית עצם מופקים מהרקמות שנאספו באמצעות פרוצדורות שהודגמו בעבר בעובר עכבר. אריתרופואזה דפיניטיבית מתרחשת בכבד העוברי בין הימים העובריים 12.5 ו-15.5.

עכברות בהריון מתוזמן מוכנות להשגת תאי כבד עובריים בימים 12.5 עד 14.5 להריון. העכברות בהריון המתוזמן מושמדות והקרניים הרחמיות מוסרות אל תוך צלחת פטרי המכילה קרח, מצע תרבית קר או תמיסת צביעה.

מיקרוסקופ דיסקציה נדרש עבור דיסקציה של כבד עוברי מיום עוברי 12.5 או צעיר יותר, לצורך הוצאת העוברים מהרחם. ראשית, הפרד כל חריזה מהקרן. לאחר מכן, הסר בעדינות את דופן הרחם כדי לשחרר את העובר שנמצא בתוך שק השער.

קלפו בעדינות את קרומי השליה. כבד העובר הוא הרקמה הבטנית האדומה הגדולה ביותר, הממוקמת מתחת ללב, שהוא קטן ממנה בהרבה. כדי להוציא את כבד העובר, השתמשו בפינצטה כדי לקבע את העובר משני צדי הכבד, ודחפו בעדינות את הכבד מחוץ לבטן אל תוך המצע.

העבר בעדינות את הכבד למבחנה המכילה תמיפת צביעה טרייה. לאחר שכל כבדי העוברים חולקו והועברו למבחנה עם תמיפת צביעה טרייה, פרק את הכבדים באופן מכני באמצעות פיפטינג, ולאחר מכן סנן את התאים המפורקים דרך רשת ניילון של 40 מיקרון. שטוף את התאים פעמיים על ידי סנטריפוגציה, השלך את העל-נוזל ותלה אותם שוב בתמיפת צביעה.

לאחר השטיפה השנייה, צבע את התאים ב-trian blue וספור אותם באמצעות המוציטומטר. כבד עוברי ביום E 13.5 מכיל כ-10⁷ תאים. השהה את התאים בריכוז של 1-2 × 10⁶ תאים ל-200 µL דגימה לצורך ניתוח בציטומטריית זרימה.

לצורך פרוטוקול וידאו זה, צביעה בנוגדנים עבור ציטומטריה זרימה תוצג עבור תאי כבד עוברי בלבד. כדי להתחיל בהליך זה, הכין תערובת מקדימה לצביעה בנוגדן ראשוני המכילה את הרכיבים הבאים: purified rabbit IgG לחסימת קולטני FC בתאי עכבר, CD 71 FETR one 19 PE ונוגדן המכוון לחלבון פני השטח של התא fast. ערבב בעדינות את תמיסת הנוגדנים על ידי היפוך המבחנה פעמיים או שלוש, הוסף 200 µL מהתערובת המקדימה לצביעה בנוגדן ראשוני לדגימת תאי הכבד העוברי שהוכנה קודם לכן, ובצע פיפוט הלוך ושוב בעדינות כדי להשעות את התאים.

בשלב הבא, הכין את ששת דגימות התאי-בקרה הללו. דגימה ללא צביעה שבה התאים נשארים בתמיסת הצביעה כדי לספק את האוטופלורסנציה של רקע התאים, צבע בודד עבור כל נוגדן או צבע המשמש בפרוטוקול כדי לתקן חפיפה ספקטרלית בין הערוצים, אשר בניסוי זה הם TUR one 19 PE CD 71 fz fast, biotin ו-streptavidin A PC, ובקרת fluorescence minus one עבור fast biotin, המספקת את הרקע האמיתי עבור אותו ערוץ שבו התאים נצבעים בכל הצבעים או הנוגדינים בפרוטוקול למעט fast biotin. דגור את הדגימה ואת הבקרות הרלוונטיות בצביעת הנוגדן הראשוני על קרח למשך 45 דקות עד שעה בחושך.

בסיום הדגירה, שטפו את התאים על ידי הוספת שלושה מיליליטר של תמיסת צביעה לכל מבחנה וסובבו במשך שלוש עד חמש דקות בכ-400 ×g בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסיפו strep avid ב-PC והדגש את המבחנות על קרח למשך 30 עד 45 דקות. עם סיום הדגירה, שטפו את התאים כפי שבוצע בשלב הצביעה בנוגדן הראשוני.

לבסוף, השעו מחדש את התאים בתמיסת צביעה המכילה את צבע ה-DNA, seven a a d, שאינו חודר לתאים, וזאת כדי להוציא תאים מתים מהניתוח. הדגימות מוכנות כעת לניתוח פלוו ציטומטרי. ההיבט המורכב ביותר של פרוצדורה זו הוא ניתוח ה-gating הנכון של האירועים הפלוו ציטומטריים, המאפשר זיהוי מהימן של תתי-אוכלוסיות של אריתרובלסטים.

התהליך דורש הגדרה קפדנית של המכשיר, שימוש בכל דגימות הבקרה המתאימות, פיצוי מדויק עבור חפיפה ספקטרלית וביצוע גייטינג (gating) עוקב המסיר תאים מתים, אגרגטים ואירועים קטנים מאוד. בתחילת ניתוח הנתונים, הדגימה ללא צבע ודגימות הבקרה בעלות צבע יחיד משמשות לקביעת הפיצוי עבור החפיפה הספקטרלית עבור כל שילוב צבעים.

בדוגמה זו, נראה כיצד פלואורסצנציית fit E חולקת אל ערוץ ה-PE וכיצד חפיפה ספקטרלית זו מתוקנת לאחר פיצוי (compensation). ראשית, באמצעות בקרת הלא-צבועים, נגדיר אזור חיובי ל-fit E ושלילי ל-PE. לאחר מכן, באמצעות בקרת צבע בודד של fit E, נוכל להמחיש את החפיפה הספקטרלית אל ערוץ ה-PE.

בעקבות פיצוי דיגיטלי באמצעות תוכנת FlowJo, אות ה-spillover fit E בערוץ ה-PE ממוזער. לאחר הפיצוי, ניתן להסיר תאים מתים, צברים ואירועים קטנים. צברים וכפילויות תאים מוסרים על ידי שרטוט גובה הפיזור קדימה (forward scatter height) מול שטח הפיזור קדימה (forward scatter area) ובחירת אירועים בתוך שער אלכסוני צר.

תאים מתים מוסרים על ידי בחירת תאים השליליים לצבע dapi, צבע DNA שאינו חודר לתא. שער התאים החיוניים השליליים ל-DAPI מו exclusion גם אירועים קטנים מאוד כגון גרעינים או שברים תאיים, בעלי פיזור קדמי (forward scatter) נמוך מאוד. כעת, נציג את אסטרטגיית השערים עבור תאי כבד עוברי.

תאים שנקצרו טריים סומנו עבור CD 71 TUR one 19, ותערובת של נוגדנים המסומנים ב-ZI המכוונים לסמני שושלת שאינם אריתרואידיים. בדוגמה זו, הדגימות כבר עברו פיצוי עבור חפיפה ספקטרלית ולאחר מכן סוננו (gated) כדי להוציא אגרגטים, תאים מתים ואירועים קטנים מאוד. אנו משתמשים בדגימת FMO המכילה את כל הצבעים למעט צביעת ה-fitzy החיובית לשושלת כדי לשרטט היסטוגרמת fitzy ולהגדיר את שער התאים השליליים לשושלת, ולאחר מכן אנו מחילים שער זה על דגימת תאי הכבד העוברי שצבעה עם סמני שושלת מצומדים ל-ZI.

תאים עם Lineage שלילי נבחרים וממופים כאשר CD 71 מופיע בציר ה-Y ו-TER one 19 בציר ה-X. התאים מוכנים כעת לחלוקה לתתי-קבוצות S zero עד S five. תת-הקבוצה S zero, שרוקנה מתאי Lin, מכילה ברובה תאים בעלי פוטנציאל CFUE לפני תחילת התלות ב-EPO.

תת-האוכלוסייה S one מכילה תאי CFUE התלויים ב-EPO הנמצאים במידה רבה בשלב S של מחזור התא. תאים בתת-האוכלוסייה S two איבדו את הפוטנציאל ליצירת מושבות והחלו להביע המוגלובין. תאים בתת-האוכלוסייה S3 הם במידה רבה אריטרובלסטים בסיפילים. תת-האוכלוסיות S four ו-S five מכילות אריטרובלסטים מאוחרים. מוצגת כאן אסטרטגיית הניתוח לאחר רכישת נתונים מתאי טחול שעובדו וסומנו בנוגדנים המכוונים ל-CD 71 ול-TER one 19, וכן היסטוגרמה של קולטן המוות fast.

הראשון מציג את כל האירועים שנרכשו, כאשר השער האלכסוני מייצג אירועים שהם ככל הנראה תאים בודדים, תוך החרגת דובלטים או אגרגטים גדולים יותר. התאים בשער זה מנותחים בהמשך בהיסטוגרמה השנייה כאן. אירועים קטנים מאוד, שככל הנראה הם גרעינים או פסדתיים, מוחרגים.

התאים שעברו סינון מוצגים בהיסטוגרמה שלוש, שבה תאים חיוביים ל-DAPI, שהם ככל הנראה תאים אפוप्टוטיים עם ממברנה חדירה, מוחרגים מהניתוח המשך. היסטוגרמה ארבע מציגה את האוכלוסייה שהתקבלה של תאי טחול חיוניים. ה-pro eGate מכיל תאים עם ביטוי גבוה של CD 71 וביטוי בינוני של TER 19; תאים עם ביטוי גבוה של TER 19 מנותחים בהמשך בהיסטוגרמה חמש.

כאן, תאים עם ביטוי גבוה של CD 71 מחולקים לתת-קבוצה פחות בוגרת בעלת שטח גדול, אריטרובלסטים A, ולתת-קבוצה קטנה ובוגרת יותר, אריטרובלסטים B. תת-הקבוצה הבוגרת ביותר של אריטרובלסטים היא ARI C. ניתן למדוד בו-זמנית ביטוי של חלבונים על פני השטח של התא עבור כל אחת מתת-הקבוצות הללו על ידי הוספת הנוגדנים הרלוונטיים יחד עם TER R 19 ו-CD 71. היסטוגרמת הצביעה 6 מראה ביטוי של קולטן המוות Fas על פני שטח התא, ספציפית בתת-הקבוצה A בעכברים במצב בסיסי ובעכברים שהוזרק להם מינון בודד של Eppo.

התוצאות מעידות על כך ש-EPO מדכא ביטוי מהיר באזור. ניתן למדוד גם ביטוי in vivo של חלבונים תוך-תאיים או את מצב מחזור התא עבור תאים בכל תת-קבוצה. בניתוח מייצג זה של מחזור התא, הוזרק לעכברים BRDU באופן תוך-פריטוניאלי ומוח extracted של מחולל העצם נדגם 30 עד 60 דקות לאחר מכן.

בנוסף לצביעה עבור CD 71 ו-TERT, התאים נצבעו עבור שילוב BRDU בתוך ה-DNA המשוכפל שלהם; תאים חיוביים ל-BRDU נמצאים בשלב S של המחזור. תאים בביניים (Interface cells) הם שליליים ל-BRDU וניתן להבחין ביניהם בין שלבי G1 או G2/M. באמצעות 7-AAD, ניתן למיין את התאים מכל אחת מתתי הקבוצות PRO, PRE ו-AEC.

כאן הם מוצגים בהכנות ציטוזין המראות הבשלה רצופית עם ירידה בגודל התאים, עיבוי גרעיני ועלייה בצבע חום המשקפת ביטוי של hemoglobin. לבסוף, מוצג כאן ניתוח מחזור תאים מייצג של תת-הקבוצה S3 בכבד עוברי ביום E 13.5. עכברים בהריון הוזנקו ב-BRDU.

כבדים עובריים נאספו, קובעו לאחר 30 עד 60 דקות, עברו חדירה (permeabilization) ונצבעו בנוגדנים נגד CD 71, TER one 19 ו-BRDU. מצב מחזור התא של תאי S3 נותח, כאשר תאי שלב S הם חיוביים ל-BRDU, ותוכן ה-DNA נמדד על ידי צביעה בצבע ה-DNA seven A a d.

הגישה הציטומטרית שאנו מתארים מאפשרת בדיקה בו-זמנית של תפקודים תאיים כגון ביטוי של סממני שטח התא וחלבונים אחרים, הישרדות תאים, סיגנלינג תאי באמצעות נוגדנים ספציפיים ומצב מחזור התא. לפיכך, היא מאפשרת לנו לחקור את התגובות המולקולריות של אריתרובלסטים, שלב הבשלה שונה, למגוון רחב של גירויים או את השפעתן של מוטציות גנטיות. יש לציין כי תתי-אוכלוסיות הבשלה בציטומטריה זרימה מוגדרים על בסיס ביטוי סממני שטח התא ופיזור קדימה (forward scatter).

מצאנו כי באופן כללי, תאים בכל תת-קבוצה תואמים לשלב מורפולוגי דומה של אריתובלסט במגוון רחב של מודלים של עכברים. עם זאת, אנו ממליצים לוודא זאת בעת בחינת מודל עכברים חדש. באמצעות מיון תאים מכל תת-קבוצה ובחינת המורפולוגיה שלהם. ניתן למיין תאים מכל תת-קבוצה גם לצורך ניתוח RNA או ניתוח טרנסקריפטומה; ניסויי מיון אלו צריכים להשתמש בלחצי מיון נמוכים ובדיסות רחבות (wide noses) כדי למזער את מאמץ הגזירה על התאים.

אנו ממליצים לבדוק גם את טהרת התאים והחיוניות שלהם לאחר כל ניסוי מיון. לבסוף, בעת זיהוי שינוי בתדירות של תת-אוכלוסייה נתונה, חשוב לקבוע אם הדבר נובע משינוי ממשי במספר התאים באותה תת-אוכלוסייה או שמא הוא נובע משינויים בתת-אוכלוסיות אחרות. לכן, בנוסף למדידת תדירויות של תת-אוכלוסיות, תמיד יש למדוד גם את מספר התאים המוחלט בכל תת-אוכלוסייה.