זיהוי וניתוח של אבות עכבר Erythroid באמצעות CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לזהות מבשרי תאים אדומים ישירות ברקמה טרייה שנקטפה בעכברים. זה מאפשר לנו לחקור את התכונות המולקולריות שלהם בזמנים שבהם המערכת האריתרופויאטית בעכברים אלה עוברת שינוי. לדוגמה, במהלך ההתפתחות העוברית או במהלך התגובה ללחץ היפוקסי, רקמה המטופויאטית ראשונה מבודדת מכבד עוברי של עכבר או טחול בוגר או מח עצם ומפורקת לתרחיף תא בודד.

לאחר מכן התאים מסומנים בנוגדנים כנגד סמני פני התא CD 71 ו-TER אחד 19, ועם כל סמן אחר מעניין, למשל, כדי למדוד את הישרדות התא או מצב מחזור התא, מתלה התא המסומן מנותח לאחר מכן באמצעות מנתח ציטומטריית זרימה ומזהים תת-קבוצות אריתרובלסט ספציפיות בשלבי התבגרות שונים. תת-קבוצות ספציפיות אלה עשויות להיות מטוהרות על ידי מיון תאים. לאחר מכן, ניתן לבצע ניתוח סלולרי ומולקולרי עבור כל תת-קבוצה של התבגרות אריתרובלסט.

היכולת לזהות אריתרובלסט בשלבי התבגרות ספציפיים ישירות ברקמות המטופויאטיות מבודדות טריות נותנת לנו את האפשרות לחקור את התאים בקליפת המוח הפיזיולוגית. שיטה זו מאפשרת לנו אפוא לחקור אריתרובלסטים גבוהים בשלבי התבגרות שונים, להגיב in vivo. כאשר עכברים נתונים לגירויים, הם מאיצים את ארגז האריתרופואט.

לדוגמא, מצבים היפוקסיים המחקים גובה רב או הזרקה של ההורמון אריתרופואטין. אנו משתמשים בציטומטריית זרימה מרובת פרמטרים כדי לזהות בלטים בסביבת רקמה מורכבת ובמקביל לחקור את הישרדות האיתות שלהם ואת מצב מחזור התא. אנו יכולים גם למיין אריתרובלסטים את שלבי ההתבגרות הספציפיים שלהם ישירות מרקמה טרייה ולחקור את רמות ביטוי הגנים שלהם, מצב הכרומטין או פונקציות מולקולריות אחרות.

אריתרופואיזיס סופי של עכבר מתרחש בטחול ובמח העצם של העכבר הבוגר. לכן, רקמות אלה ייקצרו מעכבר שעבר המתת חסד. לאחר המתת חסד העכבר שואב דם על ידי ניקוב לב לתוך צינורות איסוף דם EDTA או הפרין, דם זה ישמש מאוחר יותר לספירת המטוקריט, ספירת רשתית או ניתוח CBC.

מניחים את הטחול ועצם הירך שנקטפו בצינורות נפרדים המכילים כתמים קרים. מאגר. שמור טישו שנקטף על קרח אם רוצים. שקלו את הטחול.

עכברים העוברים תגובת לחץ אריתרופויאטית עשויים להראות עלייה משמעותית במשקל הטחול. לאחר מכן, תאי טחול ותאי מח עצם מוכנים מהרקמות שנקטפו על ידי הליכים שהודגמו בעבר בעובר העכבר. אריתרופואיזיס סופי מתרחש בכבד העובר בין הימים העובריים 12.5 ל-15.5.

עכברים נקבות בהריון מתוזמנים מוכנים להשגת תאי כבד עובריים בימים 12.5 עד 14.5 להריון. נקבות העכברים ההרות המתוזמנות מורדמות וקרני הרחם מוסרות לצלחת פטרי המכילה קרח. מדיום תרבות קרה או מאגר מכתים.

מיקרוסקופ מנתח נדרש לניתוח כבד עוברי מהיום העוברי 12.5 ומטה כדי להוציא עוברים מהרחם. ראשית הפרד כל חרוז מהקרן. לאחר מכן כרתו בעדינות את דופן הרחם כדי לשחרר את העובר שנמצא בתוך שק מי השפיר שלו.

מקלפים בעדינות את קרום מי השפיר. כבד העובר הוא רקמת הבטן האדומה הגדולה ביותר הממוקמת מתחת ללב קטן בהרבה. כדי לנתח את הכבד העוברי, השתמש במלקחיים כדי לשתק את העובר משני צידי הכבד ולדחוף בעדינות את הכבד מהבטן לתוך המדיום.

העביר בעדינות את הכבד לצינור המכיל מאגר מכתים טרי. לאחר שכל כבדי העובר נותחו והועברו לצינור המכיל כתמים טריים. בופר מנתק את הכבדים באופן מכני על ידי פיפטינג, ואז מסנן את התאים המנותקים דרך תאי שטיפת רשת ניילון של 40 מיקרון פעמיים על ידי צנטריפוגה, משליך את הסופרנטנט והרסוס מושהה במאגר הצביעה.

לאחר הכביסה השנייה, מכתימים תאים בכחול טריאן וסופרים בעזרת ציטומטר המו. לכבד עוברי ב-E 13.5 יש בערך 10 עד השביעי. תאים משעים את התאים באחת עד פעמיים 10 עד שישית תאים לכל דגימה של 200 מיקרוליטר לניתוח זרימה ציטומטרי.

למטרות פרוטוקול וידאו זה, צביעת נוגדנים לזרימה ציטומטרית תודגם רק על תאי הכבד העובריים. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו תערובת ראשונית לצביעת נוגדנים המכילה את ה-IgG המטוהר הבא לחסימת קולטני FC בתאי עכבר CD 71 FETR אחד 19 PE ונוגדנים המכוונים לחלבון פני התא במהירות. ערבבו את תמיסת הנוגדנים בעדינות על ידי היפוך הצינורית פעמיים עד שלוש, הוסיפו 200 מיקרוליטר של הנוגדנים העיקריים, צבעו מעורבב מראש לדגימת תאי הכבד של העובר שהוכנו קודם לכן, והעבירו פיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי להשהות מחדש את התאים.

לאחר מכן, הכינו את שש דגימות תאי הביקורת הללו. דגימה לא מוכתמת שבה תאים נותרים במאגר צביעה כדי לספק את האוטו-פלואורסצנציה של התאים, צבע יחיד לכל נוגדן או צבע המשמש בפרוטוקול לתיקון חפיפה ספקטרלית בין ערוצים, אשר בניסוי זה הם TUR אחד 19 PE CD 71 fz מהיר, ביוטין וסטרפטווידין A PC ושבע פלואורסצנטיות A A DA מינוס בקרה אחת לביוטין מהיר, המספק את הרקע האמיתי לאותה ערוץ שבו התאים מוכתמים בכל הצבעים או הנוגדנים בפרוטוקול למעט ביוטין מהיר. דגרו את הדגימה והבקרות הרלוונטיות בכתם הנוגדנים העיקרי על הקרח למשך 45 דקות עד שעה בחושך.

בתום הדגירה, שטפו את התאים על ידי הוספת שלושה מיליליטר של מאגר מכתים לכל צינור דגימה וסובבו במשך שלוש עד חמש דקות בערך פי 400 מכוח הכבידה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, מרחו את הסטרפטוקוס במחשב, ודגרו את הצינורות על קרח למשך 30 עד 45 דקות. בסיום הדגירה יש לשטוף את התאים כמו לכתם הנוגדנים הראשון.

לבסוף, השעו תאים בתמיסת צביעה המכילה את התא אטום, צבע DNA שבע a a d כדי לא לכלול תאים מתים. הדגימות מוכנות כעת לניתוח ציטומטריית זרימה. ההיבט הקשה ביותר בהליך זה הוא ניתוח שער נכון של אירועים ציטומטריים זרימה המאפשר זיהוי אמין של תת-קבוצות אריתרובלסטים.

זה דורש הגדרה קפדנית של מכונה את כל דגימות הבקרה הנכונות, פיצוי זהיר על חפיפה ספקטרלית ושער שלאחר מכן שאינו כולל תאים מתים, אגרגטים ואירועים קטנים מאוד. בתחילת ניתוח הנתונים. הדגימה הלא מוכתמת ודגימות בקרת הצבע הבודדות משמשות להגדרת הפיצוי עבור חפיפה ספקטרלית עבור כל שילוב צבעים.

בדוגמה זו, נראה כיצד פלואורסצנטיות e מתאימה נשפכת לתוך תעלת PE וכיצד חפיפה ספקטרלית זו מתוקנת לאחר פיצוי. ראשית, באמצעות הבקרה הלא מוכתמת, אנו מגדירים אזור חיובי E מתאים ואזור PE שלילי. לאחר מכן, באמצעות בקרת הצבע היחיד Fit E, אנו יכולים לדמיין את הזליגה הספקטרלית לתוך ערוץ PE.

לאחר פיצוי דיגיטלי עם תוכנת FlowJo, אות ה-E המתאים לגלישה בערוץ PE ממוזער. לאחר פיצוי תאים מתים, ניתן להסיר אגרגטים ואירועים קטנים. אגרגטים וכפילי תאים מוסרים על ידי התוויית גובה פיזור קדימה לעומת אזור פיזור קדימה ובחירה עבור אירועים בתוך שער אלכסוני צר.

תאים מתים מוסרים על ידי בחירת תאים שליליים לדאפי DNA אטום של תא מת. שער התא השלילי DAPI אינו כולל גם אירועים קטנים מאוד כגון גרעינים או פסולת, שיש להם פיזור קדימה נמוך מאוד. לאחר מכן, נציג את אסטרטגיית השער של תאי כבד עובריים.

תאים טריים שנקטפו סומנו עבור CD 71 TUR אחד 19, וקוקטייל של נוגדנים מסומנים ב-ZI המכוונים לסמני שושלת שאינם אריתרואידים. בדוגמה זו, דגימות כבר פוצו על חפיפה ספקטרלית ולאחר מכן מגודרות כדי לא לכלול אגרגטים תאים מתים ואירועים קטנים מאוד. אנו משתמשים בדגימת FMO המכילה את כל הצבעים למעט כתם הפיצי החיובי של השושלת כדי לשרטט היסטוגרמה של פיצי ולהגדיר את שער התא השלילי של השושלת, לאחר מכן אנו מיישמים שער זה על דגימת תאי הכבד העובריים שהוכתמה בסמני שושלת מצומדים של ZI.

תאים שליליים של שושלת נבחרים ומשורטטים עם CD 71 על ציר Y ו-TER אחד 19. בציר A, התאים מוכנים כעת לחלוקה לתת-קבוצות S אפס עד S חמש. תת-הקבוצה של אפס S מדולדל לין מכילה בעיקר תאים עם פוטנציאל CFUE לפני תחילת התלות ב-EPO.

תת-קבוצה אחת של S מכילה תאי CFUE תלויי EPO בעיקר בשלב S של מחזור התא. תאי תת-קבוצה S איבדו את הפוטנציאל ליצירת מושבה ומתחילים לבטא המוגלובין S3 תאי תת-קבוצה הם בעיקר אריתרובלסטים בזופילים S ארבע ו-S חמש מכילים אריתרובלסטים מאוחרים. מוצגת כאן אסטרטגיית הניתוח בעקבות איסוף הנתונים מתאי הטחול שעובדו וסומנו בנוגדנים המכוונים ל-CD 71 ו-TER 19, כמו גם היסטוגרמה מהירה של קולטן המוות.

האחד מציג את כל האירועים הנרכשים שבהם השער האלכסוני מייצג אירועים שסביר להניח שהם תאים בודדים, למעט כפולות או אגרגטים גדולים יותר. תאים בשער זה מנותחים עוד בהיסטוגרמה שתיים כאן. אירועים קטנים מאוד ככל הנראה גרעינים או פסולת אינם נכללים.

התאים המגודרים מוצגים בהיסטוגרמה שלוש שבה תאים חיוביים ל-DAPI שהם ככל הנראה תאים אפופטוטיים חדירים לממברנה אינם נכללים בניתוח נוסף. היסטוגרמה 4 מציגה את האוכלוסייה המתקבלת של תאי טחול ברי קיימא. ה-pro eGate מכיל CD 71 TER גבוה אחד 19 תאי ביניים tur R אחד 19 תאים גבוהים מנותחים עוד בהיסטוגרמה חמש.

כאן, תאים גבוהים CD 71 מחולקים לשטח גדול פחות בוגר, אריתרובלסטים ואריתרובלסטים קטנים ובוגרים יותר מסוג A B. ניתן למדוד את הביטוי של חלבוני פני התא בו-זמנית עבור כל אחת מתת-הקבוצות הללו על ידי הוספת הנוגדנים הרלוונטיים במקביל ל-TER R 19 ו-CD 71. צביעת היסטוגרמה שש מציגה ביטוי מהיר של קולטן המוות על פני התא, במיוחד באזור, תת-קבוצה בעכברים במצב הבסיסי ובעכברים שהוזרקו להם מנה אחת של E ppo.

התוצאות מצביעות על כך ש-EPO מדכא ביטוי מהיר באזור. ניתן למדוד גם ביטוי in vivo של חלבונים תוך-תאיים או מצב מחזור התא עבור תאים בכל תת-קבוצה. בניתוח מחזור התא המייצג הזה, עכברים הוזרקו תוך צפקית עם BRDU ומח עצם נקצר 30 עד 60 דקות לאחר מכן.

בנוסף להיותם מוכתמים עבור CD 71 ו-TER אחד 19, תאים נצבעו לשילוב BRDU בתאים החיוביים המשכפלים שלהם D-N-A-B-R-D-U נמצאים בשלב S של המחזור. תאי ממשק הם שליליים BRDU וניתן לפתור אותם לשלבים G אחד או G שני M. באמצעות ה-DNAD ניתן למיין שבעה תאי A A D מכל אחת מתת-הקבוצות של אזור PRO E A, A, B ו-A EC.

כאן הם מוצגים בתכשירי ציטוזין המראים התבגרות רציפה עם ירידה בגודל התא, עיבוי גרעיני וצבע חום גובר המשקף ביטוי המוגלובין. לבסוף, ניתוח מחזור תא מייצג של תת-קבוצה S3 בכבד עוברי E 13.5 מוצג כאן. לעכברים בהריון הוזרקו BRDU.

כבד עוברי נקצר כעבור 30 עד 60 דקות, תוקן ונצבע בנוגדנים נגד CD 71, TER one 19 ו-BRDU. מצב מחזור התא של תאי S3 מנותח היכן נמצאים תאי שלב S. תכולת BRDU חיובית ותכולת DNA מכומתת על ידי צביעה לצבע ה-DNA 7 A a d.

הגישה הציטומטרית שאנו מתארים מאפשרת חקירה בו זמנית של תפקודים תאיים כגון ביטוי סמני פני התא וחלבונים אחרים, איתות תאי הישרדות תאים באמצעות נוגדנים ספציפיים לפוסו ומצב מחזור התא. לכן זה מאפשר לנו לחקור את התגובות המולקולריות של אריתרובלסטים, שלב התבגרות שונה למגוון רחב של גירויים או השפעת מוטציות גנטיות. יש לציין כי תת-קבוצות ההתבגרות הציטומטרית של הזרימה מוגדרות במונחים של ביטוי סמני פני התא ופיזור קדימה.

מצאנו שבאופן כללי, תאים בכל תת-קבוצה מתאימים לשלב אריתרובלסט מורפולוגי דומה במגוון רחב של מודלים של עכברים. עם זאת, אנו ממליצים לאמת זאת בעת בחינת דגם עכבר חדש. על ידי מיון תאים מכל תת-קבוצה ובחינת המורפולוגיה שלהם, ניתן גם למיין תאים מכל תת-קבוצה לניתוח RNA או טרנסקריפטום, ניסויי מיון משתמשים בלחצי מיון נמוכים ואפים רחבים על מנת למזער את הלחץ העצום על התאים.

אנו ממליצים גם לבדוק את טוהר התאים ואת כדאיות התאים לאחר כל ניסוי מיון. לבסוף, כאשר מזהים שינוי בתדירות של תת-קבוצה נתונה, חשוב לקבוע אם זה נובע משינוי אמיתי במספר התאים באותה תת-קבוצה או שמא זה נובע משינויים בתת-קבוצות אחרות. לכן, בנוסף למדידת תדרי תת-קבוצות, תמיד יש צורך למדוד גם את המספר המוחלט של תאים בכל תת-קבוצה.