התמרה של תאים אנושיים עם Lentivirus פולימר-ומורכבת Ecotropic עבור Enhanced biosafety

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להחדיר אונקוגנים או גנים אחרים בעלי פוטנציאל מסוכן לתאים אנושיים באמצעות lentivirus עם טרופיזם מסוג echo. דבר זה מושג על ידי ייצור של lentivirus פנטרופי, המקודד לרצפטור של רטרו-וירוס עכברי, וכן ייצור של lentivirus עם טרופיזם מסוג echo המקודד לגן המבוקש. התאים עוברים טרנסדוקציה עם הרצפטור של הרטרו-וירוס העכברי, מה שהופך אותם לרגישים לטרנסדוקציה עם וירוס מסוג echo. לאחר מכן, התאים עוברים טרנסדוקציה עם וירוס מסוג echo על מנת להחדיר את האונקוגן, תוך שימוש בקומפלקסציה פולימרית עם poly-lysine ו-chondroitin sulfate לשיפור הטרנסדוקציה. התוצאות המתקבלות מראות טרנסדוקציה סלקטיבית של תאים אנושיים עם lentivirus מסוג echo, על בסיס מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ו-FACS.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון טרנסדוקציה של רטרו-וירוסים מסוג גמא, הוא שחלקיקי לנטי-וירוס יכולים לבצע טרנסדוקציה ביעילות רבה יותר לסוגי תאים רבים, כולל תאים שאינם מתחלקים, כגון תאי גזע. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחומי מחקר הסרטן ותאי הגזע, כגון הבנת התפקוד של אונקוגנים פוטנציאליים. לפני תחילת הליך זה, התייעץ עם קצין הבטיחות במוסדך ופעל לפי הנחיות הבטיחות המומלצות על ידו.

התחל עם תרבית של תאי 2 9 3 T בריאים הגדלים במהירות, בעבודה תחת מנדף לתרביות רקמה. בתנאים אספטיים, השהה מחדש חמישה פעמים 10 של תאי 2 9 3 T ב-10 milliliters של מצע 2 9 3 T נטול אנטיביוטיקה. העבר באמצעות פיפט את תרחיף התאים לצלחת תרבית רקמה של 10 centimeter והדגר את הצלחת למשך לילה במדגרת תרביות רקמה ב-37 °C ו-5% carbon dioxide.

למחרת, התחילו את התעתוק בשעות אחר הצהריים המאוחרות. ראשית, אספו מנה (aliquot) של Optum ואת הפלסמידים של ה-transfer packaging והמעטפה, והמתינו עד שיגיעו לטמפרטורת החדר. העבירו בעזרת פפט 375 µL של Optum למבחנה של מיקרו-צנטריפוגה, ולאחר מכן הוסיפו 25 µL של ריאגנט התעתוק FUgene HD. ודאו כי ריאגנט ה-FUgene מועבר בפפטה ישירות לתוך המצע ואינו נוגע בדפנות המבחנה.

בשלב הבא, בתוך מבחנה מיקרו-צנטריפוגה שנייה, ערבבו 5 µg של פלסמיד ההעברה, 3.75 µg של פלסמיד האריזה ו-1.25 µg של פלסמיד המעטפת בכמות הנדרשת של Optum כדי להביא את הנפח ל-100 µL. לאחר מכן, הוסיפו את תערובת ה-Optum Fuji למבחנה המכילה את תערובת הפלסמידים והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 20 עד 30 דקות. במהלך הדקות האחרונות של הדגירה, שאבו בעדינות רבה את המצע מהצלחת המכילה את תאי 293T והחליפו אותו ב-10 mL של מצע 293T טרי ללא אנטיביוטיקה.

לבסוף, הוסיפו את תערובת הפלסמיד של גן ה-FU בטיפות לתוך המצע בצלחת ה-10 סנטימטר. הניחו את הצלחת באינקובטור לתרביות רקמה המכוון ל-37 °C ו-5% carbon dioxide והדגירו למשך לילה. למחרת, שאבו בעדינות רבה את המצע מהצלחת והחליפו אותו במצע 2 9 3 T טרי ללא אנטיביוטיקה.

לאחר מכן, החזירו את הפיתח למדגרה לתרביות רקמה והדגירו למשך יומיים נוספים. שלושה ימים לאחר הטרנספקציה, שאבו מהפיתח את המדיום המכיל את הנגיף וסננו אותו באמצעות מסנן של 0.45 מיקרון עם קישוריות חלבון נמוכה. לאחר סינונו של הנגיף, הכינו דילולים סדרתיים של נגיף בקרה פלואורסצנטי במדיום טרי ללא אנטיביוטיקה עם 6 µg/mL polybrene, והשתמשו בדילולים אלו להדבקה (transduction) של תאים מסוג שורת התאים המתאימה. ביום למחרת, בפיתח של 24 בארות, החליפו את המדיום למדיום טרי ללא אנטיביוטיקה והמשיכו בדגירה למשך יומיים נוספים כדי לאפשר לתאים לבטא את החלבון הפלואורסצנטי.

השתמשו בעובדות כדי לקבוע את חלק התאים שעברו טרנסדוקציה עבור כל דילול ויראלי. לאחר מכן, חשבו את הטיטר ביחידות טרנספורמציה למיליליטר בהתבסס על דילולים שביניהם שיעור הטרנסדוקציה נמוך מ-15%, כדי למזער אירועי טרנסדוקציה מרובים. הטיטר של לנטיווירוסים לא פלואורסצנטיים אחרים שהופקו במקביל נחשב כדומה לזה של הוירוס הפלואורסצנטי.

כדי לבצע טרנסדוקציה של תאי המטרה, התחילו בבחירת ריבוי זיהום (multiplicity of infection) הגבוה משני, כדי להבטיח שמרבית התאים יעברו טרנסדוקציה. ראשית, דללו את העל-נוזל הויראלי לריבוי הזיהום הנדרש במצע תרבית מלא וטרי, בתוספת של 6 µg/mL של polybrene, עד לנפח סופי של 1 mL.

שאבו את המצע מתוך צלחת של 35 מילימטרים של תאי מטרה והוסיפו מיליליטר אחד של סופרנאט ויראלי מדולל. הדגרימו במדגרית לתרביות רקמה למשך 24 עד 48 שעות כדי לאפשר ביטוי מספיק של רספטור SLC7A1, במידת הצורך. השתמשו בברירה אנטיביוטית באמצעות blasticidin כדי לבחור תאים שעברו טרנסדוקציה יציבה ומבטאים SLC7A1, בהתאם להוראות בנוהל הכתוב.

כדי להתחיל בקביעת הרעילות, הכין תמיסת סטוק של 20 mg/mL של chondroitin sulfate ותמיסת סטוק של 20 mg/mL של Poly brain במים וסנן בסינון סטרילי. ניתן לשמור תמיסות סטוק עודפות בטמפרטורה של 20°C- עד למועד השימוש.

בשלב הבא, קבעו את מספר תרביות התאים בלוחיות 96 בארות הדרושות כדי לקבוע במדויק את הרעילות של קומפלקס הפולימר. באמצעות בדיקת MTT, יש לבחון לפחות שישה ריכוזים של chondroitin sulfate ו-poly green בשלוש חזרות. בנוסף, יש לכלול תאים ללא טיפול ותאים שגודלו ללא סרום.

יש לכלול מצע כדי לספק קו בסיס לתאים בריאים ובשביל לבקר את עיכוב הגדילה, בהתאמה. לאחר שנקבע מספר הבארות הדרוש, זרעו 5,000 תאי מטרה בכל בארה של פלטת 96 בארות, ובמקביל זרעו תאים בפלטת 24 בארות לצורך ניתוח מיקרוסקופי או ניתוח מבוסס עובדות של יעילות התעתוק בכל תנאי ניסויי; אפשרו לשתי קבוצות התאים לגדול למשך הלילה. למחרת, הוסיפו מנה של תמיסת מלאי של chondroitin sulfate ומנה של תמיסת מלאי של poly brain.

לאחר מכן, דללו את הווירוס המקודד ל-GFP במצע ללא אנטיביוטיקה המכיל 6 µg/mL poly brain, עד לריכוז של multiplicity of infection המספיק כדי להוביל טרנסדוקציה של כ-10 עד 50% מתאי המטרה בכל באר. ודאו שיש מספיק וירוס מדולל עבור כל תנאי ניסוי בתוספת בארי ביקורת בכל פלטה. סמנו קבוצת מבחנות עבור כל ריכוז של chondroitin sulfate ושל פולימר poly green שייבדקו.

לאחר מכן, חלקו לנבובות נפח מספיק של תרחיף הנגיפים עבור כל תנאי, בשלוש חזרות. לאחר מכן, טפטפו לנבובות באופן עוקב את הנפח הנדרש של תמיסת מלאי של chondroitin sulfate ו-poly brain כדי להגיע לריכוזי הבדיקה. מיד לאחר הוספת ה-chondroitin sulfate וה-poly green, נערו את הנבובת כדי לערבב.

הניחו לתערובות ה-virus chondroitin sulfate poly green להדגיר בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. התערובת עשויה להפוך עכורה כתוצאה מהיווצרות משקעים ויראליים. לאחר ההדגירה, שאבו את המדיום מבארות פלטת ה-96 well plate.

לאחר מכן, הוסיפו לבארות את תערובת הווירוס, הכונדרויטין סולפט וה-poly green כפי שתוכנן. כמו כן, העבירו באמצעות פיפט את הבקרות ומצע ללא סרום לבארות המתאימות. חזרו על התהליך עבור פלטת 24 הבארות והדגירו למשך לילה באינקובטור לתרביית רקמות.

בשלב הבא, שאבו את המצע המכיל את הווירוס מהצלחות והחליפו אותו במצע טרי. החזירו את הצלחות לאינקובטור למשך 48 שעות. לאחר 48 שעות, הוציאו את הפלטה בעלת 24 הבארים והשתמשו ב-facts כדי לנתח את יעילות הטרנסדוקציה של כל ריכוז של כונדרויטין סולפט ושל poly brain.

ביום למחרת. שאבו את המצע מכל בארות פלטת 96 הבארות והחליפו ב-100 µL של תמיסת MTT; דגרו למשך שלוש שעות באינקובטור לח, כדי לאפשר את חיזול ה-MTT במיטוכונדריה של תאים פעילים מטבוליים. לאחר שלוש שעות, שאבו את תמיסת ה-MTT והחליפו ב-200 µL של תמיסת ממס.

דגרו את הפלטה למשך שעתיים בטמפרטורת החדר או עד שכל ה-MTT הסגול נוצר והמשקב התמוסס. מדדו את הבליעה (absorbence) באמצעות קורא מיקרופלטות באורך גל של 570 nanometers, תוך הפחתת קריאת הרקע באורך גל של 690 nanometers. ריכוז הפולימר האופטימלי יניב שיפור מרבי של הטרנסדוקציה כפי שנקבע על ידי העובדות, עם השפעה מינימלית על הפעילות המטבולית כפי שנקבע על ידי MTT עבור hdfs.

100 µg/mL של chondroitin sulfate. ריכוז הפולימר ב-poly brain הוא האופטימלי כפי שנקבע בשיטה זו. ראשית, הכינו כמות מספיקה של תערובת 100 µg/mL chondroitin sulfate poly green viral sup natant להדבקת מספר הצלחות ה-35 mm הנדרש של תאי HDF המבטאים קולטן SLC7A1. דגרו את התערובת למשך חמש דקות כדי לאפשר היווצרות של קומפלקסי פולימר.

לאחר מכן, שאבו את המצע מהתאים המבטאים את קולטן המטרה והחליפו אותו בתערובת הנגיפית; דגרו למשך לילה ב-37 degrees Celsius וב-5% carbon dioxide. לאחר הסרת התערובת הנגיפית, שטפו פעמיים את פני התאים ב-PBS כדי לסייע בהסרת קומפלקסים נגיפיים. הסרה מלאה אינה נחוצה, שכן לא נצפו השפעות שליליות על בריאות התאים כתוצאה מקומפלקסים פולימריים שנותרו.

תמונה זו ממכמיר פלואורסצנציה ממחישה טרנסדוקציה מספקת של תאי סרקומה אנושיים, המבטאים באופן יציב את SLC7A1, באמצעות וירוס טרופי כאשר משתמשים בוקטורי בקרה פלואורסצנטיים לניטור יעילות הטרנסדוקציה. כימות הפלואורסצנציה באמצעות ניתוח FACS מדגים יעילות טרנסדוקציה של מעל 90%. שיעורי הטרנסדוקציה של HDFs נמוכים בדרך כלל מכיוון שהתאים לא עברו בחירה עבור ביטוי רספטורים; טיטרים של לנטיווירוס אטרופי הם בדרך כלל 10% עד 20% מווירוס פסאודו-טיפ של VSV שנמדדו ב-S-L-C-H-S-C. בדיקת חיוניות MTT מאפשרת זיהוי רגיש של עצירת גדילה בתאי מטרה כפי שניתן לראות כאן, בעקבות טרנסדוקציה עם וירוס בתוספת ריכוזים של כונדרויטין סולפט.

ריכוזים של Poly brain עד 800 micrograms per milliliter אינם משפיעים על חילוף החומרים של HDF. ניתוח Fax של HDFS שהועברו תעתוק באמצעות וירוס בתוספת ריכוזים שונים של כונדרויטין סולפט. Poly green מראה שיפור בתעתוק בהשוואה ל-poly green לבדו.

השיא של השבחת האות מתרחש בריכוז של 100 µg/mL. עבור chondroitin sulfate poly brain, הערכים נמוכים פי כמה מהערכים שדווחו בעבר. לכן, חשוב לבצע אופטימיזציה של התנאים עבור קומפלקסציה של כל סוג תא נתון עם chondroitin sulfate.

Poly brain מגביר את הטיטר הנצפה, בערך פי שלושה ב-S-L-C-H-S-C. בפועל, הדבר מניב השפעה גדולה יותר על יעילות הטרנסדוקציה בריכוזי וירוס נמוכים מאשר בריכוזים גבוהים יותר, מה שנובע ככל הנראה מתאים טרנסדוקטיביים מרובים ומרוויית רצפטורים בריכוזי וירוס גבוהים יותר. טרנסדוקציה עם וירוס טרופי היא ספציפית לתאים המבטאים רצפטור לווירוס רטרו של נוירונים.

בעת הדבקה (transduction) של תאי אדם לא מושנים באמצעות נגיף טרופי, לא נצפתה פלורסצנציה הגבוהה מרמת הרקע הבלתי מופחת, כפי שנראה בניתוח FACS ובבדיקה מיקרוסקופית. תאי HDFS אינם מראים הדבקה בהיעדרו של קולטן, בעוד שהדבקה מוקדמת עם קולטן מובילה לתאים פלורסצנטיים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לוודא שהנגיף לא יבצע הדבקה בתאי אדם מושנים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תגבירו את הבנתכם באופן השימוש בלנטי-וירוס טרופי להחדרה של גנים שעלולים להיות מסוכנים לתאים אנושיים, כולל שימוש בקומפלקסציה של פולימרים לשיפור התעתוק.