הערכת התפתחות בלוטת החלב פונקציה ועל מודלים עכבר

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להעריך את התפתחות בלוטות החלב בעכברים מסוג בר (wild type) ובעכברים מוטנטיים. זאת על ידי נתיחה ראשונית של העכבר כדי לחשוף את בלוטות החלב. לאחר מכן, בלוטות החלב נאספות כראוי ונפרסות על שקופיות זכוכית, calm lum.

לאחר מכן משתמשים בצביעה כדי לנתח את מידת התפתחות האפיתל. לבסוף, מבוצע ניתוח של התכווצויות המיו-אפיתל בעקבות חשיפה לאוקסיטוצין, INEA J. בסופו של דבר, התוצאות המתקבלות יחשפו אם צינורות בלוטת העלה והאלבאולי נוצרו כראוי, והאם ניתן להביא את המיו-אפיתל להתכווץ ולהפריש חלב בעקבות חשיפה לאוקסיטוצין. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח הקשורות להתפתחות ודיפרנציאציה של בלוטת העלה, כגון השפעת מוטציה גנטית או knockout על המורפולוגיה והתפקוד של בלוטת העלה.

הדגמה חזותית של שיטה זו מבטיחה דיסקציה נכונה של בלוטת החלב, שכן הן הרכבת החורים והן הבדיקה המבוססת על אוקסיטוצין דורשות בלוטות חלב שהוכנו היטב. דיסקציה לקויה של הבלוטה עלולה להוביל להיעדרם של חלק מהצינורים האפיתליאליים או לנוכחות של רקמות זרות, כגון עור או רקמת שריר. לפחות יום אחד לפני הדיסקציה, הכינו תמיסת CalMin alum על ידי המסה של גרם אחד של CalMin ו-2.5 גרם של אלומיניום פוטסיום סולפט ב-500 milliliters של מים מזוקקים.

הרתח את התמיסה למשך 20 דקות בבקראך של ליטר אחד, והשלם את הנפח הסופי ל-500 milliliters באמצעות מים. סנן את התמיסה דרך נייר watman והוסף מספר גרגירי thiol כחומר משמר. לאחר הצביעה, קירר את התמיסה במקרר.

ניתן לשפוך את תמיסת האלומיגון (Carbon alum) חזרה לבקבוק המלאי ולהשתמש בה שוב פעמים רבות לאורך מספר שבועות. הכינו תמיסה טרייה כאשר הצבע הופך לדהה. כדי להתחיל בדיסקציה של בלוטת הזיכרון, הקריבו עכבר באמצעות שאיפת פחמן דו-חמצני.

הימנעו מפריקה של הצוואר במידת האפשר, שכן היא עלולה לגרום לנזק לכלי דם מרכזיים בצוואר ולהוביל להצטברות דם סביב בלוטת העניבה. ראשית, הדבר מקשה על הניתוח כאשר העכבר מונח על קצף פוליסטירן עטוף בנייר כסוף. הניחו את העכבר על גבו פרסו את ארבעת הגפנים.

קבעו בחוזקה את ארבע הגפיים באמצעות מחטים בקוטר 16 עד 20 gauge. רססו את העכבר בנדיבות ב-70% ethanol באמצעות פינצטה. משכו מעלה את עור הבטן בקו האמצע ובצעו חתך קטן עם מספריים חדים החל מאזור החתך.

חתכו את העור עד לצווארו של בעל החיים, תוך הימנעות מניקור של חלל הבטן או חלל בית החזה. חתכו את העור ברגליים הקדמיות עד לחתך המרכזי, כך שיתקבלת צורת Y. חתכו את העור בגפיים האחוריות באופן דומה.

השתמשו בפינצטה המוסטטית. קלפו בעדינות את עור הבטן והבית אל צדי העכבר במידת הצורך. חתכו בעדינות את הרקמה החיבורית.

קבעו את העור לקצף הפוליסטירן באמצעות מחטים במידה 16 עד 20, כך שבלוטות העטרה המחוברות לצד התחתון של העור יהיו חשופות. בצעו דיסקציה לבלוטה אחת בכל פעם באמצעות פינצטה. הרימו בעדינות את בלוטת העטרה הרלוונטית וגזרו בין הבלוטה לעור בעזרת מספריים קטנים וחדים, החל מהצד החיצוני לכיוון עמוד השדרה של בעל החיים.

יש לחתוך בזהירות כדי לוודא שלא נותרים חלקי עור או שריר על בלוטת החלב. ניתן להסיר את כל בלוטות החלב באמצעות פרוטוקול זה, אך בלוטות החלב הבטניות מספר ארבע הן המתאימות ביותר לקיבוע שלם (whole mounting). לאחר הסרת בלוטת החלב מהעכבר, פרסו אותה ישירות על גשרי זכוכית.

נסו לשטח את הרקמה ככל האפשר. כאשר תישמר הצורה המקורית במקומה (in situ), הבלוטה תיצמד למסבכה בצורה טובה. לאחר מתיחה נכונה במנדף, קבעו את הבלוטה על ידי טבילת המסבכה בצנצנת של car noise.

קיבוע למשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר. לחלופין, ניתן לקבע את בלוטת ה-gland למשך לילה בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס. לאחר מכן, יש לשטוף את הרקמה ב-70% ethanol למשך 15 דקות.

לאחר מכן, בצעו רהידרציה הדרגתית במים על ידי הסרת מחצית מתמיסת האתנול מהצנצנת והחלפתה במים מזוקקים פעמיים. דגרו למשך חמש דקות. חזרו על הפעולה שלוש פעמים, שטפו במים מזוקקים למשך חמש דקות.

לאחר מכן, צבע את בלוטת החלב ב-carbon alum למשך לילה בטמפרטורת החדר. למחרת, הסר את צבע ה-carbon alum לשימוש חוזר ובצע דהידרציה הדרגתית של הרקמה הצבועה באמצעות רחצי אתנול סדרתיים למשך חמש דקות כל אחד. לאחר מכן, בצע שקיפות (clearing) של הרקמה ב-xylene למשך לילה. לאחר השקיפות, טבול את בלוטת החלב ב-methyl salicylate, תוך שמירת ה-methyl salicylate במכססת כימיים עד שהתמונות יהיו מוכנות לצילום. ניתן לכמת את התפתחות בלוטת החלב על ידי ספירת מספר ההסתעפויות או הענפים הצדדיים לאורך מקטעי הצינורות, או על ידי הערכת אורכן של הצינורות הראשוניים או היחס בין שטח הרקמה האפיתליאלית לשטח הרקמה השומנית.

בדיקה שנייה המשמשת להערכת התפתחות ותפקוד בלוטות החלב כוללת חשיפה של הבלוטה לאוקסיטוצין והערכת פליטת החלב אל תוך התעלות האפיתליאליות. לביצוע בדיקה זו, יש לגמול גורים שהוזנו זה עתה מהאם ולהחזיק את האם בבידוד למשך שעה אחת. לאחר מכן, יש להקריב את האם ולחשוף את בלוטות החלב כפי שמתואר בפרוטוקול לניתוח בלוטת החלב.

עם זאת, השאירו אותם בתוך בעל החיים. התחילו את הבדיקה באמצעות פיפטת העברה על ידי טפטוף אחיד של שלושה עד חמישה מיליליטרים של PBS או של תמיסת oxytocin ישירות על בלוטת התרך הרלוונטית. עבור הליך זה, מומלץ להשתמש בבלוטות החזה, כאשר צד אחד משמש כביקורת והצד השני לבדיקת פליטת החלב.

דגרו את הבלוטות למשך דקה אחת והסירו את התמיסות על ידי שאיבה זהירה באמצעות פיפטת העברה; עקבו אחר כניסת החלב אל התעלות באמצעות הקלטת וידאו או על ידי צילום תמונות לפני ואחרי חשיפה ל-PBS או לאוקסיטוצין. להלן דוגמאות לזיכרון עכבר. ניתן להבחין בקלות באפיתליום של תעלות בבלוטה שלמה (מסומנות בחצים), ובקשריה לימפה (מסומנים בראש חץ) בבלוטת חלב שלמה הפרוסה היטב.

בלוטת חלב שאינה פרוסה כהלכה עלולה להתנתק מהשקופית ולקרוס, מה שיהפוך אותה לבלתי שמישה. בלוטת חלב שלא חולצה כראוי עלולה להיות חסרה חלקים, או שעלולים להישאר בה חתיכות של שריר או עור. ניתן להבחין בהפרשת חלב בהשראת אוקסיטוצין בברווזי epithelium לאחר חשיפה לאוקסיטוצין.

עם זאת, אם צינורות החלב כבר מלאים בחלב בתחילת הבדיקה, עקב תקופת השהיה ארוכה מדי לאחר ההנקה האחרונה של הגורים, יהיה קשה להבחין בהצטברות נוספת של חלב בצינורות לאחר חשיפה לאוקסיטוצין. לחלופין, תקופת השהיה קצרה לאחר הנקת הגורים תמנע הצטברות של מספיק חלב באלוולואים כדי שניתן יהיה להבחין בו כראוי בצינורות לאחר חשיפה לאוקסיטוצין, בעקבות נתיחה של בלוטות החלב. במקום ביצוע הרכבה שלמה או הערכה של פליטת חלב המושרה על ידי אוקסיטוצין, ניתן להקפיא את בלוטות החלב, לבצע חיתוך קריוגני ולבצע סימון אימונו-היסטוכימי עבור כל מספר של חלבונים השוהים בבלוטות החלב.

לחלופין, ניתן להמיס את הבלוטות באמצעות בסיס (lyed) ולהכינן אותן עבור western blotting. יחד, שתי שיטות הערכה אלו אפשרו למענה על שאלות יסוד הקשורות להתפתחות, דיפרנציאציה ותפקוד של בלוטות בכל מספר של מודלי עכבר שהונדסו כך שיהיו חסרים גנים מרכזיים או יעניקו מוטציות של גנים.