Name: הערכת התפתחות בלוטת החלב פונקציה ועל מודלים עכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: למדו הערכת התפתחות ותפקוד בלוטת החלב בעכברים באמצעות ניתוח, צביעה ומבחני התכווצות מיואפיתליות בתגובה לאוקסיטוצין. שיטה זו מאפשרת חקר השפעת מוטציות גנטיות על מורפולוגיה ותפקוד בלוטת החלב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקרים אלו מומנו על ידי CIHR ומענקים CBCRA ל DWL. IP מומן על ידי מלגות CIHR מ-STP, FRSQ ו CIHR. MKGS מומן על ידי מלגות OGS CIHR ו-STP. המחברים מודים קווין בר עזרתו עם גידול העכבר.

1. בלוטת החלב לנתיחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר באמצעות שאיפת CO 2. הימנע נקע בצוואר הרחם אם אפשר שכן הוא עלול לפגוע בכלי הדם הגדולים בצוואר לגרום להצטברות של דם סביב בלוטות החלב, עיבוד לנתיחה קשה יותר. עם זאת, אם קריטריונים אחרים יש להעריך אותו עכבר, כגון רמות של אוקסיטוצין, שיטות המתת חסד חלופי עשוי להיות נחוץ, אם כי זה צריך להיות מוערך על ידי IACUC שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על קצף פוליסטירן עטופה בנייר, במקום את העכבר על גבו ולהפיץ את ארבעת הגפיים. הצמד בחוזקה את כל ארבעת הגפיים באמצעות 16-20 מחטים מד (איור 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרסיס העכבר בנדיבות עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, למשוך את העור בבטן בכל קו האמצע ולעשות חתך קטן במספריים חדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מ החתך, לחתוך את העור עד הצוואר של החיה תוך הימנעות ניקוב החללים הבטן או החזה (איור 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את העור על הרגליים הקדמיות על החתך קו האמצע, וכתוצאה מכך "צורת Y" (איור 1B). חותכים את העור של הגפיים האחוריות באותה דרך (איור 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים עוצר דמום, לקלף בעדינות את העור של הבטן החזה בצד של העכבר. במידת הצורך, בעדינות לחתוך רקמות מקשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את העור באמצעות קצף פוליסטירן 16-20 מחטים מד, לחשוף את בלוטות החלב המצורפת התחתון של העור. המשך והשלמה צד אחד בכל פעם (תרשים 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, בעדינות להרים את בלוטת החלב עניין לחתוך בין בלוטת ואת העור במספריים חדות קטן, החל מבחוץ לכיוון עמוד השדרה של החיה. הקפד לחתוך בזהירות, כדי לא פיסות עור או שריר להישאר על בלוטת. בלוטות החלב כל (איור 1) ניתן להסיר באמצעות פרוטוקול זה, אבל בלוטות החלב בטן (מס '4) הם הטובים ביותר עבור כל הרכבה. Nd 2 ו 3 בלוטות rd יש שרירים interdigitated ובעוד הם יכולים לשמש הר היסטולוגיה כולו, הם עלולים שלא להתאים לכל מנתח. </li></ol> 2. שלמה הר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפחות יום אחד לפני לנתיחה, להכין פתרון ארגמן אלום ידי המסת 1g של ארגמן ו 2.5G של אלומיניום סולפט אשלגן 500 מ"ל מים מזוקקים להרתיח במשך 20 דקות בתוך בקבוק 1 ליטר Erlenmeyer. התאמת עוצמת השמע הסופי 500 מ"ל מים. סינון דרך נייר Whatman ולהוסיף כמות קטנה של תימול (גרגרי) כחומר משמר. מכניסים למקרר. לאחר צביעה, פתרון ארגמן אלום ניתן שפכו בחזרה בקבוק המניות ולעשות בהם שימוש חוזר פעמים רבות על פני מספר שבועות. בצע פתרון טרי כאשר צבע הופך קלוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר גוזמות את בלוטת החלב של העכבר (שלב 1), להפיץ אותו ישירות על זכוכית שקופית. נסה לשטח אותו ככל האפשר, תוך שמירה על צורתו המקורית באתרה. בלוטת ידבק בשקופית יפה כאשר נמתח כראוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את בלוטת ידי טבילה זה, בשקופית, ב מקבע של Carnoy (100% EtOH, כלורופורם, חומצה אצטית קרחונית; 06:03:01) במשך 4 שעות בשכונה קטר בטמפרטורת החדר בצנצנת. שים לב ואחרים השתמשו 2 שעות אשר נראה מספיק. לחלופין, בלוטות יכול להיות גם קבוע 4 ° C למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף באתנול 70% במשך 15 דקות. ואז, בהדרגה רעננותם במים על ידי הסרת מחצית הפתרון אתנול מצנצנת והחלפתו DDH 2 O. דגירה של 5 דקות. חזור 3 פעמים. לחלופין, השתמש ב -70% - 35% -, 15% - אמבטיות אתנול ומים במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו במים מזוקקים למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם אלום ארגמן לילה בטמפרטורת החדר. יצוין כי מכתים עשויה להימשך זמן רב בהתאם לעובי של בלוטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר אלום ארגמן כתם על שימוש חוזר בהדרגה מייבשים רקמה צבעונית באמצעות אמבטיות אתנול סדרתי (50%, 70%, 95%, 100%) במשך 5 דקות כל אחד וברור קסילן, או חלופה רעיל כמו histo, ברור, בן לילה. גם התייבשות עלולה גם דורשים ניקוי incubations כבר עם דגימות עבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוטת החלב לטבול salicylate מתיל. בלוטות החלב יכולים להישמר salicylate מתיל במנדף קטר עד דימויים מוכנים לקחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמויות יכולות להילקח במנדף קטר עם מצלמה דיגיטלית רגילה ממוקם על חצובה (שימוש בפונקציה "מאקרו" אם קיים), על ידי הצבת את השקופיות על שולחן אור. שימוש במיקרוסקופ לנתח עבור ההגדלה גבוה יותר. לחלופין, בלוטות החלב יכול להיות מותקן בכלי התקשורת כגון Permount (לאחר שלב 2.7) המאפשר תמונות להילקח מחוץ למכסה המנוע כימי עשן על כל פלטפורמה הדמיה מתן mounts הם דקים מספיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לכמת את התפתחות בלוטת החלב באמצעות הר שלמה, מדידות כגון מספר השלכות (או תופעות סניפים) לאורך חלקים של הצינורות, את אורך הצינורות העיקרי, או יחס של אפיתל לאזור רקמת שומן יכולה להעריך. לבסוף, לאחר documen הצילום, סימטרייה הר בלוטת החלב כולו יכול להיות מוטבע פרפין עבור חתך והכתים היסטולוגית קונבנציונאלי. </li></ol> 3. אוקסיטוצין-Induced חלב פליטה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את הגורים מן הסכר רק לאחר שהם כבר נמאס. חכו 1 שעה לפני ביצוע assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקורבן האם לחשוף את בלוטות החלב כפי שתואר קודם לכן (שלבים 1.1-1.8), מבלי להסיר אותם מן החיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את assay באופן שווה על ידי הפלה או PBS או פתרון אוקסיטוצין ישירות על בלוטת החלב של עניין, בעזרת פיפטה ההעברה. ספקטרום רחב של מנות יכול לשמש; ~ 8 pg / ml (מנה פיזיולוגיים) משמש בדרך כלל. עם זאת, גבוהה שאינם מינונים פיזיולוגיים (עד 1 מ"ג / מ"ל) ניתן להשתמש כדי להבטיח את העדר התגובה מודלים עכבר מהונדס גנטית. עבור הליך זה, מומלץ להשתמש החזי (# 03/02) בלוטות, באמצעות צד אחד כביקורת (חשופים PBS) ואת הצד השני כדי לבדוק פליטה חלב (חשיפה אוקסיטוצין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דקה 1 ולהסיר את הפתרון על ידי בקפידה aspirating אותו עם טפטפת ההעברה. כניסה חלב לתוך הצינורות ניתן לנטר באמצעות הקלטת וידאו, או על ידי לקיחת תמונות לפני ואחרי החשיפה PBS או אוקסיטוצין. </li></ol> 4. נציג תוצאות: בהר שלמה טובה, בלוטת החלב היא התפשטה יפה הצינורות האפיתל הם נצפות בקלות (איור 2 א). אם בלוטת אינו היטב להתפשט, זה יכול להרים בחלקו או לחלוטין שקופית כאשר הניח הפתרון מקבע. בלוטת יהפוך קשה שמיש (2B איור). באופן דומה, אם הבלוטה לא גזור טוב, או חלק האפיתל יכול להיות חסר (איור 2C) או שאר חלקי העור או שרירי הבטן יפריע ניתוח של בלוטת (איור 2 ד). עבור assay אוקסיטוצין, חשוב להפריד את הגורים יונק מן הסכר עבור אותה כמות של זמן בכל הזדמנות. בדרך זו תוכלו לוודא כי אין חלב או כמויות קטנות של חלב קיים הצינורות לפני החשיפה אוקסיטוצין, אבל גם זה מספיק חלב קיים alveoli שיכול להפלט לתוך הצינורות על ידי התכווצויות myoepithelial (איור 3A) . אם הגורים יוסרו מוקדם מדי, חלב יכול לצבור את alveoli ועל הצינורות טיוח את ההשפעה של אוקסיטוצין קשה לעקוב (איור 3B). לחילופין, אם הניסוי מבוצע מוקדם מדי לאחר הסרת הגור, חלב לא יהיה לך זמן לצבור את alveoli אוקסיטוצין ו-Induced התכווצויות של תאים myoepithelial לא יפעילו לשחרר מספיק חלב לתוך הצינורות כדי לצפות (איור 3 ג). <img src="/files/ftp_upload/2828/2828fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. לנתיחה עכבר בלוטת החלב. הצמד את העכבר על גבו על ידי ארבעת הגפיים (A). חותכים את העור הראשון מתוך הבטן עד צוואר. ואז לעשות חתכים בניצב ממרכז הבטן אל כל איבר, כפי שמוצג ע"י הקו המקווקו (B). לקלף בעדינות את העור בצד של החיה ומהדקת אותו, לחשוף את בלוטות החלב (C). <img src="/files/ftp_upload/2828/2828fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> 2. איור עכבר כל בלוטת החלב הר. צינוריות אפיתל (חיצים) ואת הלימפה (ראש חץ) הם נצפו בקלות בהר להפיץ יפה בלוטת החלב שלמה של בלוטת # 4 (א). בלוטת החלב התפשטות לקוי עלול להיות מנותקת לשקופית והתמוטט, טיוח זה לא שמיש (B). בלוטת החלב נכרת שלא כדין יכולים להיות חלקים חסרים (ג) או פיסות עור או שריר הנותרים (ד '). שים לב nd 2 ו 3 בלוטות rd יש interdigitated שרירים, אבל עדיין יכול לשמש הר כולו או היסטולוגיה. <img src="/files/ftp_upload/2828/2828fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. אוקסיטוצין-Induced פליטה חלב ניתן לצפות צינוריות אפיתל (חיצים) בעקבות חשיפת אוקסיטוצין (A). עם זאת, אם הצינורות מלאים כבר בתחילת assay בשל תקופה ארוכה של חביון הולם אחרי האחרונה של יונק את הגורים, הצטברות נוספת של חלב בתוך הצינורות (חיצים) לאחר החשיפה אוקסיטוצין עם חלב (חיצים) קשה לצפות (B). לחילופין, תקופת חביון קצר לאחר הגור יונק לא יאפשר צבירת מספיק חלב לתוך alveoli כדי לצפות כראוי אחרי חשיפה אוקסיטוצין (ג) את צינוריות (חיצים). תמונות שנלקחו לפני ואחרי החשיפה אוקסיטוצין באמצעות מצלמה מספרי (Cybershot, סוני). <img src="/files/ftp_upload/2828/2828fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. ייצוגים סכמטי של כל מבחני טיפול גובר אוקסיטוצין.

<ol><li>Geddes, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inside+the+lactating+breast%3A+the+latest+anatomy+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Midwifery+Womens+Health%22%5BJournal%5D)">Inside the lactating breast: the latest anatomy research.</a> J Midwifery Womens Health. 52, 556-556 (2007).</li>
<li>Sternlicht, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+stages+in+mammary+gland+development%3A+the+cues+that+regulate+ductal+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis.</a> Breast Cancer Res. 8, 201-201 (2006).</li>
<li>Silberstein, G. B., Flanders, K. C., Roberts, A. B., Daniel, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mammary+morphogenesis%3A+evidence+for+extracellular+matrix-mediated+inhibition+of+ductal+budding+by+transforming+growth+factor-beta+1%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of mammary morphogenesis: evidence for extracellular matrix-mediated inhibition of ductal budding by transforming growth factor-beta 1.</a> Dev Biol. 152, 354-354 (1992).</li>
<li>Daniel, C. W., Robinson, S., Silberstein, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+TGF-beta+in+patterning+and+growth+of+the+mammary+ductal+tree%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">The role of TGF-beta in patterning and growth of the mammary ductal tree.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 1, 331-331 (1996).</li>
<li>Neville, M. C., Daniel, C. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNeville%2C+MC+%22The+Mammary+gland+%3A+development%2C+regulation%2C+and+function%22">The Mammary gland : development, regulation, and function</a>. , Plenum Press. New York. (1987).</li>
<li>Oakes, S. R., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alveolar+switch%3A+coordinating+the+proliferative+cues+and+cell+fate+decisions+that+drive+the+formation+of+lobuloalveoli+from+ductal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium.</a> Breast Cancer Res. 8, 207-207 (2006).</li>
<li>Anderson, S. M., Rudolph, M. C., McManaman, J. L., Neville, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+stages+in+mammary+gland+development.+Secretory+activation+in+the+mammary+gland%3A+it%27s+not+just+about+milk+protein+synthesis%21%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Key stages in mammary gland development. Secretory activation in the mammary gland: it's not just about milk protein synthesis!</a> Breast Cancer Res. 9, 204-204 (2007).</li>
<li>Reversi, A., Cassoni, P., Chini, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxytocin+receptor+signaling+in+myoepithelial+and+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Oxytocin receptor signaling in myoepithelial and cancer cells.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10, 221-221 (2005).</li>
<li>Haslam, S. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+to+cell+interactions+and+normal+mammary+gland+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dairy+Sci%22%5BJournal%5D)">Cell to cell interactions and normal mammary gland function.</a> J Dairy Sci. 71, 2843-2843 (1988).</li>
<li>Plante, I., Laird, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+levels+of+connexin43+result+in+impaired+development+of+the+mammary+gland+in+a+mouse+model+of+oculodentodigital+dysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Decreased levels of connexin43 result in impaired development of the mammary gland in a mouse model of oculodentodigital dysplasia.</a> Dev Biol. 318, 312-312 (2008).</li>
<li>Talhouk, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterocellular+interaction+enhances+recruitment+of+alpha+and+beta-catenins+and+ZO-2+into+functional+gap-junction+complexes+and+induces+gap+junction-dependant+differentiation+of+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Heterocellular interaction enhances recruitment of alpha and beta-catenins and ZO-2 into functional gap-junction complexes and induces gap junction-dependant differentiation of mammary epithelial cells.</a> Exp Cell Res. 314, 3275-3275 (2008).</li>
<li>Palmer, C. A., Neville, M. C., Anderson, S. M., McManaman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+lactation+defects+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Analysis of lactation defects in transgenic mice.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 11, 269-269 (2006).</li>
<li>Howlin, J., McBryan, J., Martin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pubertal+mammary+gland+development%3A+insights+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Pubertal mammary gland development: insights from mouse models.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 11, 283-283 (2006).</li>
<li>You, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+mammary+gland+development+in+prepubertal+male+rats+exposed+to+genistein+and+methoxychlor%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Modulation of mammary gland development in prepubertal male rats exposed to genistein and methoxychlor.</a> Toxicol Sci. 66, 216-216 (2002).</li>
<li>Grill, C. J., Cohick, W. S., Sherman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postpubertal+development+of+the+rat+mammary+gland+is+preserved+during+iron+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Postpubertal development of the rat mammary gland is preserved during iron deficiency.</a> J Nutr. 131, 1444-1444 (2001).</li>
<li>Hennighausen, L., Robinson, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Think+globally%2C+act+locally%3A+the+making+of+a+mouse+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Think globally, act locally: the making of a mouse mammary gland.</a> Genes Dev. 12, 449-449 (1998).</li>
<li>Aupperlee, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-specific+differences+in+the+mechanisms+of+progesterone+regulation+of+murine+mammary+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Strain-specific differences in the mechanisms of progesterone regulation of murine mammary gland development.</a> Endocrinology. 150, 1485-1485 (2009).</li>
<li>Montero Girard, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+estrogen+receptor-alpha+and+progesterone+receptor+A+expression+with+hormonal+mammary+carcinogenesis%3A+role+of+the+host+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Association of estrogen receptor-alpha and progesterone receptor A expression with hormonal mammary carcinogenesis: role of the host microenvironment.</a> Breast Cancer Res. 9, R22-R22 (2007).</li>
<li>Moore, D. M., Vogl, A. W., Baimbridge, K., Emerman, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+calcium+on+oxytocin-induced+contraction+of+mammary+gland+myoepithelium+as+visualized+by+NBD-phallacidin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Effect of calcium on oxytocin-induced contraction of mammary gland myoepithelium as visualized by NBD-phallacidin.</a> J Cell Sci. 88, 563-563 (1987).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

התפתחות בלוטת החלב הם פונקציה מתוזמר היטב. עכברים Mutant עשוי הנמל מוטציות גנטיות שיכולות לפגוע בהתפתחות בלוטת החלב לתפקד הדגשת הצורך להעריך ארכיטקטורה בלוטת 13,12. הרכבה שלם ניתן לבצע כפי שמתואר במאמר זה בכל שלבי התפתחות בלוטת החלב. בדרך כלל, פיתוח של האפיתל נבחנת בתחילת גיל ההתבגרות (~ 4 שבועות), בעיצומו של גיל ההתבגרות (~ 6 שבועות) ואחרי גיל ההתבגרות (~ 10-12 שבועות) 2,10. בשלבים אלה, בסכום של צינור הסתעפות, במספר סוף ניצנים מסוף אורך הצינורות ניתן לקבוע ע...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> ארגמן </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> C1022 </td></tr><tr><td> אשלגן אלומיניום גופרתי </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> A6435 </td></tr><tr><td> תימול </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> T0501 </td></tr><tr><td> מתיל salicylate </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> M6752 </td></tr><tr><td> אוקסיטוצין </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> O3251 </td></tr></tbody></table>

הערכת התפתחות בלוטת החלב פונקציה ועל מודלים עכבר

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

בלוטת החלב האנושי מורכב האונות 15-20 כי חלב מפרישים לתוך הפתח הסתעפות מערכת צינור לעבר הפטמה. אונות אלו הן עצמם מורכבת ממספר יחידות מסוף אונתית צינור עשוי alveoli הפרשה ותעלות מתכנסים 1. בעכברים, ארכיטקטורה דומה שנצפה הריון שבו צינוריות ו alveoli משובצים בתוך stroma רקמת החיבור. אפיתל עכבר בלוטת החלב הוא עץ כמו מערכת של צינורות מורכב משתי שכבות של תאים, השכבה הפנימית של תאים luminal מוקף שכבה חיצונית של תאים myoepithelial כונה על ידי לגבולות קרום המרתף 2. בזמן הלידה, רק עץ ductal rudimental קיים, המורכב סניפים הדביק 15-20 העיקרי. סניף התארכות ולהתחיל הגברה בתחילת גיל ההתבגרות, סביב 4 שבועות, תחת השפעה של הורמונים 3,4,5. ב 10 שבועות, רוב stroma הוא פלש ידי מערכת מורכבת של צינורות כי יעברו מחזורים של הסתעפות ונסיגה כל מחזור הייחום עד ההריון 2. עם תחילת ההריון, השלב השני של הפיתוח מתחיל, עם התפשטות והבחנה של אפיתל ליצירת ענבים בצורת הפרשה חלב מבנים קרא alveoli 6,7. לאחר הלידה ובמהלך ההנקה, החלב מיוצר על ידי תאים הפרשה luminal ו מאוחסן בתוך לומן של alveoli. לשחרר אוקסיטוצין, מגורה על ידי רפלקס עצבי המושרה על ידי היניקה של הגורים, גורמת להתכווצויות מסונכרן של תאים myoepithelial סביב alveoli לאורך צינורות, המאפשר חלב להיות מועבר דרך הצינורות אל הפטמה שבה הוא הופך להיות זמין עד 8 ​​גורים. התפתחות בלוטת החלב בידול, ותפקוד הם דורשים מתוזמר היטב, לא רק אינטראקציות בין stroma את האפיתל, אך גם בין תאים myoepithelial ו luminal בתוך האפיתל 9,10,11. ובכך, מוטציות בגנים רבים מעורבים אינטראקציות אלה עלולים לפגוע גם התארכות ductal במהלך היווצרות ההתבגרות או alveoli במהלך ההריון התמיינות מוקדם במהלך ההריון המאוחרות ההפעלה הפרשה המוביל הנקה 12,13. במאמר זה, אנו מתארים כיצד לנתח בלוטות החלב עכבר ולהעריך את התפתחותם באמצעות mounts כולו. אנחנו גם מדגימים כיצד להעריך התכווצויות myoepithelial ואת פליטת חלב באמצעות לשעבר vivo אוקסיטוצין מבוססי assay תפקודית. ההשפעה של מוטציה בגן על התפתחות בלוטת החלב לתפקד ולכן יכול להיקבע באתרו על ידי ביצוע שתי הטכניקות הללו בעכברים מוטציה מלאה ו wild-type.

שיטה זו מתארת ​​כיצד לנתח ולהעריך התפתחות תפקוד בלוטת החלב ומן העכברים. בלוטות החלב נכרת מוערכים לתואר הפיתוח באמצעות הר שלם תוך פליטה החלב מוערך באמצעות אוקסיטוצין מבוססי assay myoepithelial התכווצות התא.

בלוטת החלב האנושית מורכבת מ-15 עד 20 אונונים המפרישים חלב למערכת צינורות מסתעפת הנפתחת בפטמה. אונונים אלו הם בעצמם...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להעריך את התפתחות בלוטות החלב בעכברים מסוג בר (wild type) ובעכברים מוטנטיים. זאת על ידי נתיחה ראשונית של העכבר כדי לחשוף את בלוטות החלב. לאחר מכן, בלוטות החלב נאספות כראוי ונפרסות על שקופיות זכוכית, calm lum.לאחר מכן משתמשים בצביעה כדי לנתח את מידת התפתחות האפיתל. לבסוף, מבוצע ניתוח של התכווצויות המיו-אפיתל בעקבות חשיפה לאוקסיטוצין, INEA J. בסופו של דבר, התוצאות המתקבלות יחשפו אם צינורות בלוטת העלה והאלבאולי נוצרו כראוי, והאם ניתן להביא את המיו-אפיתל להתכווץ ולהפריש חלב בעקבות חשיפה לאוקסיטוצין. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח הקשורות להתפתחות ודיפרנציאציה של בלוטת העלה, כגון השפעת מוטציה גנטית או knockout על המורפולוגיה והתפקוד של בלוטת העלה.הדגמה חזותית של שיטה זו מבטיחה דיסקציה נכונה של בלוטת החלב, שכן הן הרכבת החורים והן הבדיקה המבוססת על אוקסיטוצין דורשות בלוטות חלב שהוכנו היטב. דיסקציה לקויה של הבלוטה עלולה להוביל להיעדרם של חלק מהצינורים האפיתליאליים או לנוכחות של רקמות זרות, כגון עור או רקמת שריר. לפחות יום אחד לפני הדיסקציה, הכינו תמיסת CalMin alum על ידי המסה של גרם אחד של CalMin ו-2.5 גרם של אלומיניום פוטסיום סולפט ב-500 milliliters של מים מזוקקים.הרתח את התמיסה למשך 20 דקות בבקראך של ליטר אחד, והשלם את הנפח הסופי ל-500 milliliters באמצעות מים. סנן את התמיסה דרך נייר watman והוסף מספר גרגירי thiol כחומר משמר. לאחר הצביעה, קירר את התמיסה במקרר.ניתן לשפוך את תמיסת האלומיגון (Carbon alum) חזרה לבקבוק המלאי ולהשתמש בה שוב פעמים רבות לאורך מספר שבועות. הכינו תמיסה טרייה כאשר הצבע הופך לדהה. כדי להתחיל בדיסקציה של בלוטת הזיכרון, הקריבו עכבר באמצעות שאיפת פחמן דו-חמצני.הימנעו מפריקה של הצוואר במידת האפשר, שכן היא עלולה לגרום לנזק לכלי דם מרכזיים בצוואר ולהוביל להצטברות דם סביב בלוטת העניבה. ראשית, הדבר מקשה על הניתוח כאשר העכבר מונח על קצף פוליסטירן עטוף בנייר כסוף. הניחו את העכבר על גבו פרסו את ארבעת הגפנים.קבעו בחוזקה את ארבע הגפיים באמצעות מחטים בקוטר 16 עד 20 gauge. רססו את העכבר בנדיבות ב-70% ethanol באמצעות פינצטה. משכו מעלה את עור הבטן בקו האמצע ובצעו חתך קטן עם מספריים חדים החל מאזור החתך.חתכו את העור עד לצווארו של בעל החיים, תוך הימנעות מניקור של חלל הבטן או חלל בית החזה. חתכו את העור ברגליים הקדמיות עד לחתך המרכזי, כך שיתקבלת צורת Y. חתכו את העור בגפיים האחוריות באופן דומה.השתמשו בפינצטה המוסטטית. קלפו בעדינות את עור הבטן והבית אל צדי העכבר במידת הצורך. חתכו בעדינות את הרקמה החיבורית.קבעו את העור לקצף הפוליסטירן באמצעות מחטים במידה 16 עד 20, כך שבלוטות העטרה המחוברות לצד התחתון של העור יהיו חשופות. בצעו דיסקציה לבלוטה אחת בכל פעם באמצעות פינצטה. הרימו בעדינות את בלוטת העטרה הרלוונטית וגזרו בין הבלוטה לעור בעזרת מספריים קטנים וחדים, החל מהצד החיצוני לכיוון עמוד השדרה של בעל החיים.יש לחתוך בזהירות כדי לוודא שלא נותרים חלקי עור או שריר על בלוטת החלב. ניתן להסיר את כל בלוטות החלב באמצעות פרוטוקול זה, אך בלוטות החלב הבטניות מספר ארבע הן המתאימות ביותר לקיבוע שלם (whole mounting). לאחר הסרת בלוטת החלב מהעכבר, פרסו אותה ישירות על גשרי זכוכית.נסו לשטח את הרקמה ככל האפשר. כאשר תישמר הצורה המקורית במקומה (in situ), הבלוטה תיצמד למסבכה בצורה טובה. לאחר מתיחה נכונה במנדף, קבעו את הבלוטה על ידי טבילת המסבכה בצנצנת של car noise.קיבוע למשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר. לחלופין, ניתן לקבע את בלוטת ה-gland למשך לילה בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס. לאחר מכן, יש לשטוף את הרקמה ב-70% ethanol למשך 15 דקות.לאחר מכן, בצעו רהידרציה הדרגתית במים על ידי הסרת מחצית מתמיסת האתנול מהצנצנת והחלפתה במים מזוקקים פעמיים. דגרו למשך חמש דקות. חזרו על הפעולה שלוש פעמים, שטפו במים מזוקקים למשך חמש דקות.לאחר מכן, צבע את בלוטת החלב ב-carbon alum למשך לילה בטמפרטורת החדר. למחרת, הסר את צבע ה-carbon alum לשימוש חוזר ובצע דהידרציה הדרגתית של הרקמה הצבועה באמצעות רחצי אתנול סדרתיים למשך חמש דקות כל אחד. לאחר מכן, בצע שקיפות (clearing) של הרקמה ב-xylene למשך לילה. לאחר השקיפות, טבול את בלוטת החלב ב-methyl salicylate, תוך שמירת ה-methyl salicylate במכססת כימיים עד שהתמונות יהיו מוכנות לצילום. ניתן לכמת את התפתחות בלוטת החלב על ידי ספירת מספר ההסתעפויות או הענפים הצדדיים לאורך מקטעי הצינורות, או על ידי הערכת אורכן של הצינורות הראשוניים או היחס בין שטח הרקמה האפיתליאלית לשטח הרקמה השומנית.בדיקה שנייה המשמשת להערכת התפתחות ותפקוד בלוטות החלב כוללת חשיפה של הבלוטה לאוקסיטוצין והערכת פליטת החלב אל תוך התעלות האפיתליאליות. לביצוע בדיקה זו, יש לגמול גורים שהוזנו זה עתה מהאם ולהחזיק את האם בבידוד למשך שעה אחת. לאחר מכן, יש להקריב את האם ולחשוף את בלוטות החלב כפי שמתואר בפרוטוקול לניתוח בלוטת החלב.עם זאת, השאירו אותם בתוך בעל החיים. התחילו את הבדיקה באמצעות פיפטת העברה על ידי טפטוף אחיד של שלושה עד חמישה מיליליטרים של PBS או של תמיסת oxytocin ישירות על בלוטת התרך הרלוונטית. עבור הליך זה, מומלץ להשתמש בבלוטות החזה, כאשר צד אחד משמש כביקורת והצד השני לבדיקת פליטת החלב.דגרו את הבלוטות למשך דקה אחת והסירו את התמיסות על ידי שאיבה זהירה באמצעות פיפטת העברה; עקבו אחר כניסת החלב אל התעלות באמצעות הקלטת וידאו או על ידי צילום תמונות לפני ואחרי חשיפה ל-PBS או לאוקסיטוצין. להלן דוגמאות לזיכרון עכבר. ניתן להבחין בקלות באפיתליום של תעלות בבלוטה שלמה (מסומנות בחצים), ובקשריה לימפה (מסומנים בראש חץ) בבלוטת חלב שלמה הפרוסה היטב.בלוטת חלב שאינה פרוסה כהלכה עלולה להתנתק מהשקופית ולקרוס, מה שיהפוך אותה לבלתי שמישה. בלוטת חלב שלא חולצה כראוי עלולה להיות חסרה חלקים, או שעלולים להישאר בה חתיכות של שריר או עור. ניתן להבחין בהפרשת חלב בהשראת אוקסיטוצין בברווזי epithelium לאחר חשיפה לאוקסיטוצין.עם זאת, אם צינורות החלב כבר מלאים בחלב בתחילת הבדיקה, עקב תקופת השהיה ארוכה מדי לאחר ההנקה האחרונה של הגורים, יהיה קשה להבחין בהצטברות נוספת של חלב בצינורות לאחר חשיפה לאוקסיטוצין. לחלופין, תקופת השהיה קצרה לאחר הנקת הגורים תמנע הצטברות של מספיק חלב באלוולואים כדי שניתן יהיה להבחין בו כראוי בצינורות לאחר חשיפה לאוקסיטוצין, בעקבות נתיחה של בלוטות החלב. במקום ביצוע הרכבה שלמה או הערכה של פליטת חלב המושרה על ידי אוקסיטוצין, ניתן להקפיא את בלוטות החלב, לבצע חיתוך קריוגני ולבצע סימון אימונו-היסטוכימי עבור כל מספר של חלבונים השוהים בבלוטות החלב.לחלופין, ניתן להמיס את הבלוטות באמצעות בסיס (lyed) ולהכינן אותן עבור western blotting. יחד, שתי שיטות הערכה אלו אפשרו למענה על שאלות יסוד הקשורות להתפתחות, דיפרנציאציה ותפקוד של בלוטות בכל מספר של מודלי עכבר שהונדסו כך שיהיו חסרים גנים מרכזיים או יעניקו מוטציות של גנים.

evaluation-of-mammary-gland-development-and-function-in-mouse-models

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מאמר זה מדגים את נוהל שפותח על ידי DeOme...

החלב להשתלות אפיתל נוהל

הדמית זמן לשגות משמשת כדי להעריך את ההתנהגות של תאים ראשוניים preneoplastic חלב האפיתל הנגזרים ממודלי עכבר מהונדס גנטי של סיכון לסרטן שד על מנת לקבוע אם יש קשר בין פרמטרים התנהגותיים ספציפיים ונגעים גנטיים מובחנים.

הדמית זמן לשגות של תאי אפיתל חלב Preneoplastic ראשוניים הנגזרת ממודלי עכבר מהונדס גנטי של סרטן השד

פרוטוקול immunofluorescence העקיף המתואר במאמר זה מאפשר זיהוי והלוקליזציה של חלבונים בבלוטת החלב עכבר. שיטה שלמה ניתן להכין דגימות בלוטת החלב, לבצע אימונוהיסטוכימיה, לתמונת סעיפי רקמות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ולשחזר תמונות.

Immunofluorescence עקיף על סעיפים קפואים של עכבר בלוטת החלב

כאן, אנו מציגים עבור בידודו של שלמה, שלמה עכבר פרוטוקול עטין לחקור מורפולוגיה ductal וביטוי מטריצה חוץ-תאית (ECM). בלוטות בטן העכבר #4 היו מופק עכברים nulliparous נקבה שבוע 8-10, קבוע בפורמלין במאגר נייטרלי, למחלקה והמוכתמות בעזרת אימונוהיסטוכימיה ECM חלבונים.

בידוד של בלוטות מוגדלות ללא פגע, כל עכבר לניתוח של בלוטת מורפולוגיה וביטוי מטריצה חוץ-תאית

המטרה של הפרוטוקול הזה היא לתאר את הגישה החדשה מידול סרטן השד מבוסס על הזרקת הפנים של יצור-הבעת אדנווירוס לתוך בלוטות החלב של העכבר. גישה זו מאפשרת גם מניפולציה ייחודית לסוג תא ולעוגב של אירועים אונגניים באופן זמני מבוקר.

דוגמנות סרטן השד באמצעות הזרקת הפנים של המין-אדנווירוס המבטא לתוך בלוטת החלב של העכבר

מאמר זה מתאר שיטת השתלת להשתיל השתל בפטמות האפיתל התאים לתוך משטח שומן לבן של בעלי חיים הנמען. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לבחון את השפעות המארחים ו/או התורמים בהתפתחות האפיתל של הפטמות ומבטלת את הצורך בניקוי מראש, ובכך מרחיב את התועלת שבטכניקה זו.

חולדה השתלת תא האפיתל לתוך משטח שומן לבן הגלימה

בלוטת החלב היא מבנה מחודד, המורכב מיואפיתל חיצוני ותאי אפיתל הפנים הפנימיים. המוצג הוא פרוטוקול להכין אורגנואידים. באמצעות טריסיזציה דיפרנציאלית שיטה יעילה זו מאפשרת לחוקרים לטפל באופן נפרד בשני סוגי תאים אלה כדי לחקור שאלות הנוגעות לתפקידם בצורת בלוטת החלב ובתפקוד.

הדור של הפסיפס של חלב באמצעות טריסיזציה דיפרנציאלית

מודלים של קסנוגרפט (PDX) שמקורם בחולה ומודלים של עכברים מהונדסים גנטית הניתנים להשתלה מחדשים בנאמנות מחלות אנושיות והם מודלים מועדפים לחקר בסיסי ותרגום של סרטן השד. כאן, שיטה מתוארת להשתלה אורתוטופית שברי גידול השד לתוך כרית השומן הממארי כדי ללמוד ביולוגיה של הגידול ולהעריך את תגובת התרופה.

השתלה אורתוטופית של גידולי שד כמודלים פרה-אקליניים לסרטן השד

פרוטוקול זה מתאר חלון הדמיה חדש של יונקים עם מכסה הניתן להחלפה (R.MIW). מיקרוסקופיה תוך-ורידית לאחר השתלת ה-R.MIW מאפשרת הדמיה אורכית ורב-יומית של בלוטת החלב הבריאה והחולה עם רזולוציה תאית בשלבי ההתפתחות השונים.

מיקרוסקופיה תוך-ורידית אורכית באמצעות חלון הדמיה של יונקים עם מכסה הניתן להחלפה

הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקה קלה להדמיה תוך-חיונית של בלוטת החלב של עכבר מניק, באמצעות סריקת לייזר, מיקרוסקופ קונפוקלי ומולטיפוטון.

מיקרוסקופיה תת-תאית תוך חיונית של בלוטת החלב

פרוטוקול זה מתאר גישת סקר CRISPR תוך-צינורית ניתנת להרחבה, המאפשרת מחקרים מקבילים של הכיבוי וההפעלה של הגנים בחיים בבלוטת השד של העכבר.

סקר מקביל ב-vivo של השמדת גנים והפעלה בבלוטת השד של העכברים

למדו הערכת התפתחות ותפקוד בלוטת החלב בעכברים באמצעות ניתוח, צביעה ומבחני התכווצות מיואפיתליות בתגובה לאוקסיטוצין. שיטה זו מאפשרת חקר השפעת מוטציות גנטיות על מורפולוגיה ותפקוד בלוטת החלב.

הערכת התפתחות בלוטת החלב פונקציה ועל מודלים עכבר

גלה סרטונים נוספים