Name: כירורגי של השתלת תאים עכבר גזע עצביים לתוך מיתרי השדרה של עכברים נגועים בנגיף הפטיטיס עכבר Neurotropic (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-10T22:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: למד השתלת תאי גזע עצביים לחוט השדרה בעכברים נגועים בנגיף JHMV לקידום רמיאלינציה ושיפור קליני. שיטה זו מאפשרת מחקר תרפיות תאים להחלפה במחלות דמיאלינציה כמו טרשת נפוצה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן Xylazine-קטמין פתרון (קטמין הוא חומר מבוקר. מידע מפורט צריך להישמר ופתרונות מאוחסן במיקום, כספת נעולה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקי מחטאים ציוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן אזור הניתוח על ידי מנגב עם סוכן aseptic ואז מכסה עם מגבת נייר סטרילי, ולהגדיר את micromanipulator. </li></ol> 2. הכנת תאים להשתלה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים צריכים להיות resuspended לריכוז של 100,000 תאים / l אלקטרוני, למרות שרק 250,000 תאים מושתלים לכל עכבר, עודף של התאים נדרשת טעינה למטרות מזרק (להכין לפחות 300,000 תאים לכל עכבר קבלת תאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף התאים המושתלים להיות 3 פעמים ב HBSS חרוטי בקבוקון 50 מ"ל. ספירת התאים לפני הסיבוב האחרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי הספין האחרון למטה, HBSS למזוג ולהשאיר בקבוקון במהופך עמדה כדי למנוע טיפות מלהגיע גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך קירות יבש עם Kimwipe, UV-מוקרן סטרילית. אל תאפשר גלולה להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזקת שפופרת זקוף, לאט מאוד בעדינות resuspend התאים בנפח חצי הרצוי הסופי של HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הנפח הכולל של pipetting רוב ההשעיה אל קצה פיפטה ואז להתאים את החוגה על pipetter עד ההשעיה כולו בקצה פיפטה. זה יגיד לך כמה HBSS יותר דרוש ריכוז הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביאו נפח לכמות הרצויה על ידי הוספת HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים בחזרה על הקרח. בדיקת הכדאיות של תאים אם הם חייבים להיות על הקרח יותר מ 2 שעות. </li></ol> 3. הכנה של עכברים עבור ניתוח השתלת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר באמצעות זריקה intraperitoneal של קטמין (100mg/kg) ו xylazine (10mg/kg) ב ~ 100 מנות μl או הרדמה המקבילה. ההליך כולו מן הרחצה כדי תפירת ייקח 30-40 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונאלי: להחיל ממוספרים, סרט צבעוני לזנב של עכבר כל כדי להבטיח זיהוי) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את האזור הגבי של העכבר מן הגב התחתון אל הצוואר, והארכת 2 ס"מ בין שתי המדינות מ קו האמצע, עם קוצץ חשמלי. השיער צריך לחתוך קרוב ככל האפשר (יתכן שיהיה צורך לעבור על האזור מספר פעמים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר את השיער הנותר, למרוח שכבה דקה של קרם להסרת שיער (Nair) עם גזה היטה המוליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 1-2 דקות, לנגב נאיר את עם גזה הרטובות קלות במי סבון. השטח צריך להיות מוכן עור חשוף ונקי ללא חתיכות תועה של שיער שיכולים להיכנס הפצע במהלך ההליך הכירורגי הבאים. לחטא את האזור עם פתרון מוכן יודיד. </li></ol> 4. Laminectomy <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעתים קרובות שינוי ו / או לעקר כפפות לאורך כל ההליך. מקם את העכבר בצד הגב עם הראש והצביע שמאלה (אם אתם ימניים). הנח בעלי חיים על מנת להבטיח סטריליות וכי רק את האזור מגולח חשוף. ביצוע חתך אנכי (~ 1.3cm) על אתר laminecomy פורש מ על חוליות בית החזה T8 ל T12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים גרפה החזיק ביד שמאל, בנחישות להבטיח את עמוד השדרה על מילון T9 (איור 1A) ולהרים את העכבר עד להגזים עקמת שדרתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באזמל כדי להבקיע את הצומת בין T10 ו T11, את החלל בין שתי בליטות קוצני. יתר על כן לחשוף את צומת בקפידה על ידי מבטל את שכבת השריר משם לחשוף את העצם (ראה איור 1 ב ', ג'). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים כדי לקדם את השריר ברור הרחק lamina וסביב pedicle עם חיתוכים קטנים. זו תפתח את חלל קטן בין החוליות. לאט לאט ובעדינות להוסיף אחת של להב המספריים לתוך הפער הזה לגזור pedicle. ודא את העקמומיות של המספריים ממוקם תמיד רוחבית, הרחק חוט. חזרי על הפעולה בצד השני. (ראה איור 1D, ה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את lamina לחשוף את כבל ובזהירות לגזור אותו. הקפידו לא להשאיר את כל שברי עצמות חינם או משונן מאחור. (ראה איור 1F) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הזריקה, לנקות דם משם עם צמר גפן סטרילי. </li></ol> 5. הזרקה של תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את המחט עם אגוז המחט במזרק המילטון לנקות אותם על ידי שטיפה מספר פעמים עם מים, אז 70% אתנול, ו HBSS לבסוף. הכנס הבוכנה לאחר מילוי כל אחד עם מים, אתנול 70%, או HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המזרק המילטון לטעינת התא על ידי הסרת הבוכנה ואת משחררת את אגוז מחט ומושך את המחט מן המזרק כדי למנוע backpressure. ודא כי טיפול זהיר של המחט ואגוזים נעשים עם כפפות סטריליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 15μl של תאים לתוך פיפטה קצה ולחץ בחוזקה את קצה אל הקצה האחורי של המזרק כדי לטעון את התאים לתוך המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הבוכנה על 5 מ"מ, ואז להדק את האום מחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדכא הבוכנה האו"םtil חלק ההשעיה תא נתפסת היציאה מחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שאין בועות במזרק ולהניח את המזרק במצב האופקי כדי למנוע את התאים מפני ביצוע הדרגתי על ידי כוח הכבידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחוז בעכבר laminectomized על ידי השריר spinalis dorsi המחבר את עמוד השדרה של T8 ו T9 (איור 2 ב, ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלאמפ hemostat לזרוע (אנכי) שמאל micromanipulator כך רגליו הקדמיות של העכבר נמצאים באוויר רגליו האחוריות נוגע קלות פלטפורמה של מגבות נייר סטרילי כמו דמויות 2A ו 2B. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את המזרק בזרוע micromanipulator ימינה (בזווית של ° 70) והחלק את המזרק למצב הנמוכה ביותר האפשרית בטרם יבלעו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצב את העכבר על ידי הצמדת זנבו נגד מגבות נייר ולאט לאט להוריד את המזרק (2B איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את המחט לכיוון חוט והכנס את 1mm מחט לתוך חצי הכדור השני דרך קו האמצע הגבי (איור 2C). קצה המחט צריכה להיות בחומר האפור קרוב לתעלה המרכזית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להזריק 2.5μl של תאים. הזרק בשיעור של 1μl / 5 שניות. לאחר הזרקת תאים, להמתין 10 שניות לחזור בו את המחט עשירית סיבוב בכל פעם כל 10 שניות עד שהמחט יוצא של חוט. שימו לב בזרימת אפשרית של השעיה התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסגת במהירות את המזרק ולנתק אותו מן היד micromanipulator. הנח את המזרק אופקית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר את העכבר ולהעביר אל שולחן התפירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 5.7-5.14 עבור כל עכבר עד מזרק מרוקנת. לעקר כלים (ב מעקר) ואת המחט (על ידי מנגב עם אתנול) בין בעלי חיים. מחק תאים מחדש אם clumping גלוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את המזרק כמו בשלב 5.1 בין המון. </li></ol> 6. התפרים ואת מנותחות טיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפר את החתך. מחט תפר מוכנס לתוך fascia השטחי משני צידי החתך. חוט מתוח היא דרך, מושך fascia השטחית יחד (איור 3A), ובכך מכסה את חוט השדרה חשוף באתר lamina הוסרו. אל תפר את השריר עורית המצורפת עור או שריר השלד של הגב. משוך את החוט כולו דרך, והשאיר כ 1 / 2 ". שימוש מחזיק מחט, שלושה קשרים נוצרים חוט חיתוך קרוב הקשר האפשרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגירת החתך על ידי יישום 02:58 סיכות (בהתאם לגודל של החתך) על העור (איור 3B). משוך בזהירות העור הרחק העכבר כדי למנוע הידוק השרירים הבסיסית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש 26G3 / 8 המחט להזריק האצבעות Lactated 0.5ml משנה cutaneously בגב התחתון מן החתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום העכבר לכלוב שלו. כדי להבטיח זאת הוא מסוגל לנשום בנוחות בזמן הרדמה, העכבר צריך להיות ממוקם בצד שלה בכלוב, הימנעות ממגע בין האתר הניתוח ומצעים כלוב. כלובים צריך להיות ממוקם על כריות חימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים מנוטרים לאחר הרדמה פגה כדי להבטיח שוך דימום, התפרים נשארים סגורים, עכברים לחזור ניידות ניתוח מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התייחס עכברים פעם אחת עם עצירות כאבים (0.05-0.1 מ"ג / ק"ג) לאחר הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא עכברים לקויי גישה מספיק אוכל ומים: בקבוקי מים מצוידים 3.5 אינטש פיות המורחבת ועכברים אינם מסוגלים ללכת יד הם האכילו מים ו / או עתירי קלוריות תוסף תזונה (Nutri-Cal, Tomlyn). </li></ol> 7. נציג תוצאות: התוצאות הרצויות יהיה ניתן לזיהוי על ידי חוסר בזרימת ההשעיה התא במהלך זריקה ועל ידי הופעת שלם של חוט השדרה בעקבות ההליך. לשם כך, חיוני לקיים תאורה בהיר ישירות על עמוד השדרה של העכבר במהלך laminectomy ובמהלך הזריקה. תאורה אופטימליים הוא הקל על ידי תאורה סיבים אופטיים (איור 2 א). <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> איור 1 - Laminectomy (א) לאחר חוליה T9 מוחזק ביציבות עם מלקחיים גרפה, (B, C) ​​ציון את עמוד השדרה עם האיזמל בין T10 ו T11 כדי להקל על כניסתם של המספריים מיקרו.. (ד) להחליק בזהירות את המספריים מיקרו בחלל שבין T10 ו T11 (החצים הבלעה, E) לחתוך את pedicles בכל צד (מקפים, E) לשחרר את lamina הגבי. (F) תהפכו את lamina עד rostrally ולנתק אותה. <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. הזרקת NSCs. (א) ההגדרה הכללית של micromanipulator עם hemostat שמחזיק את העכבר מחובר בזרוע שמאל את המזרק המילטון על זרוע ימין בזווית של 70. (ב) hemostat להחזיק את השריר spinalis dorsi המחבר את עמוד השדרה של T8 ו T9. (ג) הוא הוריד את המחט דרך tהוא קו האמצע אל החומר האפור על הכדור השני, הפרוקסימלי לתעלה המרכזית. <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. Sutures וסגירת הפצע. (א) Sutures מוחלים fascia השטחי משני צידי החתך. (ב) החתך נסגר עם סיכות 2-3 לפי הצורך (אחד מצרך המוצג פצע צורך 3).

<ol><li>Bergmann, C. C., Lane, T. E., Stohlman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronavirus+infection+of+the+central+nervous+system%3A+host-virus+stand-off%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Coronavirus infection of the central nervous system: host-virus stand-off.</a> Nat Rev Microbiol. 4, 121-132 (2006).</li>
<li>Weiner, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenge+of+multiple+sclerosis%3A+how+do+we+cure+a+chronic+heterogeneous+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">The challenge of multiple sclerosis: how do we cure a chronic heterogeneous disease.</a> Ann Neurol. 65, 239-248 (2009).</li>
<li>Fleming, J. O., Trousdale, M. D., Bradbury, J., Stohlman, S. A., Weiner, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+demyelination+induced+by+coronavirus+JHM+%28MHV-4%29%3A+molecular+identification+of+a+viral+determinant+of+paralytic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Pathog%22%5BJournal%5D)">Experimental demyelination induced by coronavirus JHM (MHV-4): molecular identification of a viral determinant of paralytic disease.</a> Microb Pathog. 3, 9-20 (1987).</li>
<li>Totoiu, M. O., Nistor, G. I., Lane, T. E., Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remyelination%2C+axonal+sparing%2C+and+locomotor+recovery+following+transplantation+of+glial-committed+progenitor+cells+into+the+MHV+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Remyelination, axonal sparing, and locomotor recovery following transplantation of glial-committed progenitor cells into the MHV model of multiple sclerosis.</a> Exp Neurol. 187, 254-265 (2004).</li>
<li>Carbajal, K. S., Schaumburg, C., Strieter, R., Kane, J., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+engrafted+neural+stem+cells+is+mediated+by+CXCL12+signaling+through+CXCR4+in+a+viral+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Migration of engrafted neural stem cells is mediated by CXCL12 signaling through CXCR4 in a viral model of multiple sclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 11068-11073 (2010).</li>
<li>Hardison, J. L., Nistor, G., Gonzalez, R., Keirstead, H. S., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+glial-committed+progenitor+cells+into+a+viral+model+of+multiple+sclerosis+induces+remyelination+in+the+absence+of+an+attenuated+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Transplantation of glial-committed progenitor cells into a viral model of multiple sclerosis induces remyelination in the absence of an attenuated inflammatory response.</a> Exp Neurol. 197, 420-429 (2006).</li>
<li>Blakemore, W. F., Crang, A. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBlakemore%2C+WF+%22Transplantation+of+glial+cells+into+areas+of+demyelination+in+the+adult+rat+spinal+cord%22">Transplantation of glial cells into areas of demyelination in the adult rat spinal cord</a>. , Oxford UP. Oxford. (1992).</li>
<li>Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+differentiate+into+oligodendrocytes+and+myelinate+in+culture+and+after+spinal+cord+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 6126-6131 (2000).</li>
<li>Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+oligodendrocyte+progenitor+cell+transplants+remyelinate+and+restore+locomotion+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury.</a> J Neurosci. 25, 4694-4705 (2005).</li>
<li>Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+patient+enters+trial+to+test+safety+of+stem+cells+in+spinal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">First patient enters trial to test safety of stem cells in spinal injury.</a> BMJ. 341, c5724-c5724 (2010).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

ההשתלה מבוצע היטב יהיה בעיקר על ציר laminectomy הזריקה זהירה של התאים. מכשול יסודי להימנע במהלך laminectomy היא פגיעה של חוט השדרה. זה יכול להתרחש במהלך ההליך עצמו או על ידי נזק שנגרם עקב שברי עצמות חדות השאיר אחריו ביצוע ההליך. כדי להימנע אלה, להבטיח את הנקודות של המספריים מיקרו מעוקל תמיד פונה הרחק חוט לבחון היטב את עמוד השדרה laminectomized מנת להבטיח כי כל שברי עצמות נמחקים וזה הקצוות מבנה השדרה הנותרים אין בגלוי בולטות או משוננים. כאמור, זיהוי של בזרימת יהיה אפשרי אם אור זורחת בעליזות ישירות על חוט השדרה חשוף במהלך ההזרקה. בזרימת סביר להניח שיקרה עם 30 מחטים מד (לעומת 33 מד) ואם זריקה נעשה מהר מדי. אף על פי פרוטוקול זה נתן לנו תוצאות טובות, אחרים דיווחו כבר תקופות ההמתנה (עד 5 דקות) לפני retracting מחט הזריקה הבאה 8,9. כמו כן, מחטים מד קטן עדיפים, אבל יש לנו ציין כי כמה תאים lysed בקלות רבה מדי, כאשר עברו 33 מחטים מד. כדי למקסם את היעילות, צוות ההשתלות איוש ארבע תחנות שונות (עכבר הכנה, laminectomy, הזרקה, ותפרים) רצוי. יתר על כן, התזמון עבור כל הליך צריך להיות מותאם כדי לצמצם את זמן התאים מחכים על הקרח. לדוגמה, אנו ההשתלה בעכברים שלנו בקבוצות של ארבעה (מספר מנות לטעון כל המזרק), האדם הזרקת התאים מתחיל להעמיס את המזרק לאחר העכבר השלישי היה laminectomized והאדם בהכנת עכברים צריך להרדים את הפעולות הבאות הקבוצה אחרי העכבר השני של הקבוצה הקודמת כבר laminectomized. באופן זה, אנו יכולים השתלת תאים (או בקרת מדיה) תוך 40 עכברים כ 3 שעות, למרות כל עכבר ייקח כ 30-40 דקות. החלפת תא טיפולים לטיפול בהפרעות מערכת העצבים המרכזית חלק כרגע בניסויים קליניים 10. אין תחליף במודלים vivo של NSC השתלת פרוטוקול שלנו engraftment של NSCs לתוך מיתרי השדרה של עכברים עם demyelination המושרה ויראלי מאפשר את השימוש מודל חשוב של טרשת נפוצה ניתן להתאים בקלות מודלים אחרים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב / ציוד </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> Ketaject </td><td> הפניקס Parmaceuticals </td><td> NDC 57319-542-02 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazine הידרוכלוריד </td><td> MP Biomedicals </td><td> 158307 </td><td></td></tr><tr><td> נאיר </td><td> הכנסייה &amp; דווייט ושות </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10  μl המילטון מזרק w / נשלף מחט </td><td> המילטון החברה </td><td> 7635-01 </td><td></td></tr><tr><td> מחטים המילטון, 30G או 33 G, ½ אינץ&#39;, 30 מעלות שפוע </td><td> המילטון החברה </td><td> 7803-077803-05 </td><td> בדקו את הכדאיות של התאים הבאים מעבר דרך מחטים לזהות את מד הטובה ביותר לשימוש </td></tr><tr><td> מיקרו מספריים </td><td> העולם מכשירי דיוק </td><td> 555500S </td><td></td></tr><tr><td> קטנים גרפה מלקחיים </td><td> FST </td><td> 11053-10 </td><td></td></tr><tr><td> Stereotaxic </td><td> KOPF מכשירים </td><td> דגם 1772 יוניברסל מחזיק </td><td></td></tr><tr><td> Stereotaxic </td><td> KOPF מכשירים </td><td> דגם 1773 מחזיק אלקטרודה </td><td></td></tr><tr><td> Stereotaxic </td><td> KOPF מכשירים </td><td> 902 דגם stereotaxic קטן חיה </td><td></td></tr><tr><td> Stereotaxic </td><td> KOPF מכשירים </td><td> דגם 960 אלקטרודה שמאל הספק </td><td></td></tr><tr><td> Sutures </td><td> Ethicon </td><td> 95057-064 </td><td></td></tr><tr><td> Lactated האצבעות </td><td> Hospira </td><td> NDC 0409-7953-03 </td><td></td></tr><tr><td> סטייפלס </td><td> פיין המדע </td><td> 12032-07 </td><td></td></tr><tr><td> Hemostat </td><td> FST </td><td> 13010-12 </td><td></td></tr><tr><td> אזמלים, בגדלים 10,11 </td><td> דיג </td><td> 268878, 268879 </td><td></td></tr><tr><td> Sutures </td><td> Ethicon </td><td> 1676G </td><td> גודל 5-0, 3 / 8 &quot;מעגל, 19mm מחט, חוט 45cm קלוע </td></tr><tr><td> רפלקס 7 קליפ פצע המוליך </td><td> FST </td><td> 12031-07 </td><td></td></tr><tr><td> 7mm פצע קליפים רפלקס </td><td> FST </td><td> 12032-07 </td><td></td></tr><tr><td> אולסן-Hegar בעל מחט </td><td> FST </td><td> 12502-12 </td><td></td></tr></tbody></table>

כירורגי של השתלת תאים עכבר גזע עצביים לתוך מיתרי השדרה של עכברים נגועים בנגיף הפטיטיס עכבר neurotropic

Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus

עכברים שהודבקו בזן JHM neurotropic של נגיף הפטיטיס העכבר (MHV) לפתח התוצאות פתולוגיים וקליני דומה בחולים עם טרשת demyelinating המחלה נפוצה (MS). הראינו כי השתלת NSCs לתוך מיתרי השדרה של תוצאות עכברים חולים שיפור משמעותי בחידוש יצירת המיאלין והן על התוצאה הקלינית. החלפת תא טיפולים לטיפול במחלות נוירולוגיות כרוניות כיום מציאות במודלים vivo הם חיוניים להבנת יחסי הגומלין בין התאים engrafted ורקמות microenvironment המארח. מצגת זו מספקת שיטה המותאמת השתלת תאים לתוך חוט השדרה של JHMV עכברים נגועים. בקיצור, אנו מספקים נוהל i) הכנת NSCs לפני ההשתלה, ii) טרום ניתוחית לטפל בעכברים, ג) החשיפה של חוט השדרה דרך laminectomy, ד) הזרקה של stereotactic NSCs, ו ד) שלאחר הניתוח טיפול .

השתלה של תאים העכבר גזע עצביים (NSCs) לתוך מיתרי השדרה של עכברים עם demyelination הוקמה מפורט. הכנה של NSCs, laminectomy של החוליה החזי 9 (T9), וכן השתלת NSCs מתוארת יחד עם הטיפול לפני ואחרי הניתוח של העכברים.

כירורגי של השתלת תאים עכבר גזע עצביים לתוך מיתרי השדרה של עכברים נגועים בנגיף הפטיטיס עכבר Neurotropic

עכברים שהודבקו בזן הנוירוטרופי JHM של נגיף הדלקת הכבד של העכבר (MHV) מפתחים תוצאות פתולוגיות וקליניות דומות לאלו של חולים עם...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לקדם רמיאלינציה (remyelination) ושיפור קליני בבעלי חיים עם דמיאלינציה מבוססת, באמצעות השתלה של תאי גזע עצביים אל תוך חוט השדרה של עכברים שהודבקו ב-JHMV. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת בעל החיים. השלב השני של הפרוצדורה הוא ביצוע למינקטומי (laminectomy) בחוליות החזה.לאחר מכן מזריקים 10 תאים לתוך חוט השדרה החשוף. לאחר הזרקה מוצלחת, סוגרים את הפצע. בשלב הסופי, בודקים את נוכחותם של תאי גזע עצביים של עכבר בחוט השדרה.ניתן להדמיות של פהנקيمه (Parenchyma) באמצעות שיטות כגון מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, השתלה של תאי גזע עצביים אל תוך חוט השדרה של JHMB. עכברים מזוהמים יכולים לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום של טיפולי החלפת תאים לטיפול במחלות דמיליניזציה, כגון האופן שבו התאים נודדים, נחלקים ומבדילים את עצמם, וכן כיצד התאים משפיעים על מערכת העצבים המרכזית. ובנוסף, האם ניתן לשנות את התאים או את סביבת חוט השדרה אליהם הם מושתלים כדי להגביר את יתרונותיהם הטיפוליים.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי טיפול בהחלפת תאים במודל ויראלי של דמילינציה, ניתן ליישם אותה גם במודלים אחרים של דמילינציה ופגיעה, כגון encephalomyelitis אוטואימונית ניסיונית, EAE, ופגיעה בחוט השדרה. לפני הכנת התאים להזרקה, הכין את כל התמיסות הדרושות. לאחר מכן, נקה ועקר את כל הציוד.הכינו את אזור הניתוח והגדירו את המיקרו-מניפולטור כדי להכין את התאים להשתלה באמצעות טריפסין, וסספנדו אותם מחדש בבקבוק קוני של 50 מיליליטר. שטפו את התאים המיועדים להשתלה שלוש פעמים ב-HBSS. ספרו את התאים לפני הסבב האחרון.לאחר הסבוב האחרון, סנטריפוגו (spin down) ושפוך את ה-HBSS, והשאר את המבחנה במצב הפוך כדי למנוע מטיפות להגיע למשקע. ייבשו את הדפנות הפנימיות באמצעות מטלית Kim wipe סטרילית שעברה הקרנת UV. אין לאפשר למשקע להתייבש.החזקו את המבחנה במצב אנכי, באיטיות ובזהירות רבה. השביו את התאים בנפח השווה למחצית מהנפח הסופי הרצוי של HBSS. בסופו של דבר, התאים צריכים להיות בריכוז של 100,000 תאים ל-µL.מדדו את הנפח הכולל על ידי העברת התרחיף לקצה פלסטית (pipette tip), ולאחר מכן כוון את החוגה בפיפט עד שכל התרחיף נמצא בתוך הקצה. פעולה זו תאפשר לכם לדעת כמה HBSS נוסף נדרש להגעה לריכוז המבוקש. השלימו את נפח התאים לנפח הרצוי.על ידי הוספת HBSS. ניתן להעביר את התאים למבחנת אפנדורף. החזר אותם לקירור על קרח.בדוק את חיוניות התאים אם עליהם להישאר על קרח למשך יותר משעתיים. כדי להתחיל את ההליך הכירורגי, ודא את רמת ההרדמה המתאימה באמצעות רפלקס צביטה של הבהו. השתמש במכונת גילוח חשמלית כדי לגלח את האזור הגבי של העכבר מהגב התחתון ועד לצוואר.לאחר גילוח האזור, מרחו שכבה דקה של קרם להסרת שיער כדי להסיר שיער שנותר. לאחר דקה עד שתי דקות, נגבו את האזור בעזרת גזה יבשה ולאחר מכן בעזרת גזה הספוגה קלות במי סבון. כעת, האזור המנתח צריך להיות נקי משיער.לבסוף, חטרו את האזור המוכנה באמצעות תמיסת Betadine ומרחו משחה על העיניים. כדי למנוע התייבשות, הניחו את העכבר כשהוא פניו כלפי מטה (גבו כלפי מעלה). בצעו חתך מעל לאתר הלמינקטומיה (laminectomy), המשתרע החל מחוליות החזה.T 8 עד T 11. הגבירו את קימור עמוד השדרה ואתרו את T 10. זוהי החוליה הראשונה עם בליטה שטוחה, והיא נמצאת בדרך כלל שתי חוליות רבסטראלית (לכיוון הראש) מקודקו של קימור עמוד השדרה.בעזרת פינצטה אפורה, אחזו בחוזקה בעמוד השדרה. בגובה T9, השתמשו בסקלפל כדי לחרוץ את הרווח שבין שתי הבליטות הקוציות של T10 ו-T11. לאחר מכן, גרדו את שכבת השריר כדי לחשוף את העצם שמתחתה, תוך כדי וידוא שקימור המספריים פונה הרחק מהחוט השדרני.החדירו באיטיות להב אחת של המספריים בין T 10 ל-T 11. החליקו את הלהב בין חוט השדרה לבין הפדיקל (pedicle) של T 10 וגזרו את הפדיקל. חזרו על הפעולה בצד השני. הרימו את הלמינה (lamina) כדי לחשוף את חוט השדרה שמתחתיה וגזרו אותו בזהירות.הקפידו שלא להשאיר מאחור שברים של עצם חופשיים או משוננים. לאחר שכל שברי העצם פונו, נגבו את הדם באמצעות מקלוני צמר גפן סטריליים. ראשית, הכינו את מזרק ההמילטון (Hamilton syringe) על ידי חיבור המחט בעזרת אום המחט.הכנס את הבוכנה ושטוף מספר פעמים במים. לאחר הניקוי, שטוף פעם אחת ב-70% ethanol וב-HBSS. הוצא את הבוכנה ושחרר את אום המחט.משוך את המחט הרחק מהמזרק כדי למנוע לחץ חוזר. בעת טעינת התאים, טען 15 µL של תאים לתוך המזרק על ידי לחיצה חזקה של קצה הפ pipette אל גב המזרק. הכנס את הבוכנה כחמישה מילימטרים ולאחר מכן הדק את אום המחט.לחץ על הבוכנה עד שחלק מתרחיף התאים ייראה יוצא מהמחט. ודא שאין בועות במזרק, והנח את המזרק באופן אופקי כדי למנוע מהתאים ליצור מדרג ריכוזים עקב כבידה. בחזרה אל בעל החיים, השתמש בפינצטות המוסטטיקה (hemostats) כדי לתפוס את שריר ה-S spinous doci.חיבור החוליות T8 ו-T9. הצמיד את התפס הכירורגי (hemostat) לזרוע המיקרו-מניפולטור השמאלית כך שכפות רגליו הקדמיות של העכבר יהיו באוויר וכפות רגליו האחוריות יגעו קלות בפלטפורמה של מגבונים מנייר סטרילי.חברו את המזרק לזרוע המיקרו-מניפולטור הימנית בזווית של 70 מעלות, והגלישו את המזרק למצב הנמוך ביותר האפשרי לפני ההידוק. ייצבו את העכבר על ידי קיבוע זנבו אל מגבות הנייר. הורידו את המחט באיטיות לעבר השן.החדירו את הקצה למשך מילימטר אחד אל תוך ההמיספירה הנגדית דרך קו האמצע הגבי (dorsal midline). קצה המחט צריך להיות בחומר האפור או קרוב אליו, אך לא בתוך התעלה המרכזית. הזרים באיטיות 2.5 µL של תאים בקצב של מיקרוליטר אחד בכל חמש שניות.לאחר הזרקת התאים, המתן 10 שניות והוצא את המחט. סובב את המחט בעשירית סיבוב. הוצא אותה בקצב זה מדי 10 שניות עד שהמחט תצא מהשרוך.הזרקה מהירה מדי של התאים או הוצאה מהירה מדי של המחט עלולות לגרום לדליפה של תרחיף התאים. אם הדבר קורה, יש להוציא את העכבר מהמחקר. לאחר ההוצאה מהשרוך, יש לסגת במהירות עם המחט ולנתק את המזרק מזרוע המיקרו-מניפולטור.שוב, הניחו את העכבר במצב אופקי. שחררו את העכבר והעבירו אותו לשולחן תפירה. חזרו על הליך זה עבור כל עכבר עד שהמזרק יתרוקן.יש להשליך את התאים ולטעון אותם מחדש אם נראה התגבשות, תוך שטיפה וניקוי של המזרק בין הטעינות. לאחר ההזרקה, מועבר בעל החיים למיקום נפרד לצורך תפירה. העבירו את מחט התפירה דרך הפסציה השטחית משני צידי החתך.משוך את התפר כדי להצמיד את הפסציה (fascia) ולכסות את חוט השדרה החשוף באתר הסרת הלמינה (lamina). השתמש במחזיק מחט ובפינצטה כדי לקשור שלושה קשרים וגזור כמה שיותר מהחוט העודף. תפר אחד בדרך כלל מספיק בזמן הרחקת העור מהעכבר.כדי למנוע מהסיכות לתפוס את השריר שמתחתן, סגרו את החתך באמצעות שתיים עד שלוש סיכות. לאחר סגירת הפצע, הגזירותו 0.5 milliliters של תמיסת lactated ringer תת-עורית לאזור הגב התחתון, אך הרחק מהחתך. הניחו את העכבר על צדו בתוך הכלוב, תוך וידוא שאתר הניתוח אינו בא במגע עם מצע הכלוב.יש לעקוב אחר בעלי החיים עד להחלמה מלאה. תמונה זו מציגה תאי גזע עצביים של עכבר המסומנים ב-GFP שהושתלו בהצלחה בחתך קורונלי של חוט השדרה. 21 ימים לאחר ההשתלה.לאחר צפייה בסרטון זה, תגבירו את הבנתכם לגבי אופן השתלת תאי גזע עצביים אל תוך חוט השדרה של עכברים שנדבקו ב-JHMV. לאחר רכישת מיומנות בשיטה, ניתן לבצע אותה ב-40 עכברים בתוך כשלוש שעות.

surgical-transplantation-mouse-neural-stem-cells-into-spinal-cords

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

השתלת מבשר עצבית היא אסטרטגיה מבטיח הגנה ו / או החלפת אבוד / נוירונים מתפקדת צוואר הרחם מנוע הסרעפת של פגיעה בחוט השדרה (SCI) לבין הנוירון המוטורי הפרעה, amyotrophic laterals טרשת (ALS). אנו מספקים פרוטוקול למסירה התא בחוט השדרה הצווארי קרן הגחון במודלים של מכרסמים ALS ו SCI.

Intraspinal השתלת תאים עבור מיקוד הורן הגחון צוואר הרחם ב טרשת לרוחב amyotrophic וקורד טראומטית פגיעה בעמוד השדרה

מקור: Weber, R. Z., et al. השתלה תוך מוחית ומעקב ביולומינסנציה in vivo של תאי אב עצביים אנושיים במוח העכבר. J. Vis. Exp. (2022)סרטון זה מדגים את ההשתלה הסטריאוטקסית של תאי אב עצביים אנושיים מהונדסים גנטית (NPCs) לתוך מוח העכבר. חוקרים מזריקים NPCs המבטאים לוציפראז וחלבונים פלואורסצנטיים, המאפשרים הדמיה ביולומינסנציה in vivo ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית לאחר המוות כדי לחקור את הישרדות התאים, נדידה ואינטגרציה במחקר נוירולוגי.

השתלת תאי אב עצביים אנושיים במוח העכבר

מקור: Furmanski, O., et al. מודל השפעה מבוקרת בקליפת המוח של פגיעה מוחית בעכבר עם השתלה טיפולית של תאים עצביים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם. J. Vis. Exp. (2019)בסרטון זה, תאים עצביים פלוריפוטנטיים שמקורם בתאי גזע המושרים על ידי בני אדם מוזרקים באופן סטריאוטקסי לגבול החומר האפור-לבן של קליפת המוח העמוקה במודל עכבר של פגיעה מוחית טראומטית. התאים המושתלים משתלבים ברקמה, ומקדמים התאוששות תפקודית ותיקון מעגלים במוח הפגוע.

השתלה סטריאוטקסית של תרחיף תאים עצביים בעכבר עם פגיעה מוחית טראומטית

סרטון זה מדגים את ההעברה התוך-אפית של תאי גזע עצביים טיפוליים טעונים בנגיף אונקוליטי למודל עכבר הנושא גידול במוח. הניהול התוך-אפי הלא פולשני של תאי גזע עוקף את מחסום הדם במוח, ומקל על העברתם לאתר הגידול במוח ליישומים טיפוליים.

העברה תוך אפית של תאי גזע עצביים טיפוליים (NSCs) במודל מורין: הליך למסירה ממוקדת גידול של NSCs טעונים בנגיף אונקוליטי למודל עכבר נושא גידול במוח

מקור: Parajuli, B., et.al. השתלת מיקרוגליה שמקורה בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים במוחם של עכברים בעלי יכולת חיסונית באמצעות נתיב טרנס-אף לא פולשני. J. Vis. Exp. (2022).סרטון זה מדגים את ההשתלה הטרנס-אף של תאי מיקרוגליה אנושיים (iPSMG) שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים למוח עכבר. היאלורונידאז מוחל על הנחיריים של עכבר מדולדל מיקרוגליה כדי לשפר את החדירות. תרחיף iPSMG ניתן דרך האף, והעכבר רשאי להתאושש. מדיה עשירה בגורמי גדילה ניתנת באופן קבוע כדי לתמוך בהישרדות iPSMG ברקמת המוח.

השתלה דרך האף של תאי מיקרוגליאה אנושיים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים למוח העכבר

פגיעה בחוט השדרה היא מצב טראומטי שגורם לתחלואה קשה ותמותה גבוהה. בעבודה זו אנו מתארים בפירוט מודל חבלה של פגיעה בחוט השדרה בעכברים ואחרי השתלה של תאי גזע עצביים.

השתלת תאי גזע עצבית בדגם ניסיוני של Contusive פגיעה בחוט השדרה

כאן, אנו מציגים מודל כבד עכבר אנושי חדש שנוצר בעכברי נוקאאוט של תאים מתווכים של קולטן רעלן Alb (TRECK)/SCID לאחר השתלת תאי גזע כבד אנושיים לא בשלים וניתנים להרחבה.

דור של כבד עכבר אנושי באמצעות תאי גזע אנושי כבדיה

תאי גזע הם מבטיחים לספקים טיפוליים לטיפול בגידולים במוח בשל הטרופיזם של הגידול הפנימי שלהם. לא פולשני אינטראנסלי תא גזע המסירה עוקף את מחסום דם מוח ומראה פוטנציאל חזק לתרגום קליני. מאמר זה מסכם את העקרונות הבסיסיים של אספקת תאי גזע אינראנסאלי במודל עכבר של גליומה.

אספקה ​​אינטראנסלית של תאים בתאי גזע כדי גליובלסטומה במודל עכבר

תארנו פרוטוקול לביצוע חלקי hepatectomy (PHx), השתלת תא באמצעות הטחול ב במנוד ראש. SCID (הנהון. CB17-Prkdcscid/J) עכברים. ב פרוטוקול זה, חתך לחשוף ולאחר נכרות האונה השמאלית של הכבד, ואחריו עוד חתך השתלת intrasplenic של תאים.

השתלת intrasplenic של Hepatocytes לאחר Hepatectomy חלקית ב במנוד ראש. SCID עכברים

הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר השתלה של מיקרוגליה אנושית (iPSMG) שמקורה בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים במוח דרך מסלול טרנסנסאלי בעכברים מדוכאי חיסון. השיטה להכנת והשתלת טרנסנסאל של תאים וניהול תערובת ציטוקינים לשמירה על iPSMG מוצגת.

השתלה של מיקרוגליה שמקורה בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם במוח עכברים מדוכאי חיסון דרך נתיב טרנסנסאלי לא פולשני

הפרוטוקול הנוכחי מתאר פיתוח של מודל עכברי הניתן לשחזור של גליומה של חוט השדרה על ידי הזרקת תאי גידול לחלל הבין חולייתי, ומציע גישה יעילה יותר ופחות פולשנית למחקר ופיתוח טיפולי.

השתלה כירורגית של תאי גידול בחוט השדרה של עכברים

למד השתלת תאי גזע עצביים לחוט השדרה בעכברים נגועים בנגיף JHMV לקידום רמיאלינציה ושיפור קליני. שיטה זו מאפשרת מחקר תרפיות תאים להחלפה במחלות דמיאלינציה כמו טרשת נפוצה.

כירורגי של השתלת תאים עכבר גזע עצביים לתוך מיתרי השדרה של עכברים נגועים בנגיף הפטיטיס עכבר Neurotropic

גלה סרטונים נוספים