Name: תפוקה גבוהה Overexpression פלסמיד שמרים מסך (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: למדו פרוטוקול אוטומציה לטרנספורמציה בנפח גבוה של שמרים Saccharomyces cerevisiae עם ספריית פלסמידים מסודרת. השיטה מאפשרת זיהוי משני גנטיקה של רעילות חלבונים אנושיים הקשורים במחלות ניווניות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם המרכז Packard עבור ALS מחקר באוניברסיטת ג&#39;ונס הופקינס (ADG), פרס ממציא ניו מנהל NIH 1DP2OD004417-01 (ADG), NIH R01 NS065317 (ADG), אלן ריטה פרס קרן Scholar. ADG הוא חוקר Pew במדעי ביו, נתמך על ידי Pew Charitable Trusts.

1. ההכנות לשינוי שמרים פרוטוקול זה מיועד עשר צלחות 96-טוב אבל יכול להיות scaled למעלה או למטה בהתאם. מצאנו כי פרוטוקול זה לא עובד טוב יותר מעשרים 96-היטב צלחות בכל סבב של טרנספורמציה. הליך השינוי כולו (משלב I.3) ייקח בערך שמונה שעות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 5-10μL של DNA פלסמיד (100 ng / μl) מן הספרייה שמרים ORF FLEXGene לתוך הבאר התחתון של כל עיגול 96-גם צלחת עם המטפל RapidPlate Biorobot נוזלי. המקום חשפו צלחות 96-היטב מכסה המנוע ספסל נקי קטר לילה יבש. מצאנו יעילות טרנספורמציה דומה עם CEN ו פלסמידים 2μ שמרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 200 מ"ל של שמרים peptone דקסטרוז (YPD) מדיה (10g / L תמצית שמרים, 20 גרם / L peptone, 20 גרם / גלוקוז L) עם זן שאילתה בקבוק Erlenmeyer 500ml מבולבל. דגירה לילה בשעה 30 ° C עם רועד (200 סל"ד). במידת הצורך, מדיה סלקטיבי יכול לשמש גם עבור אלו תרבויות המתנע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, לדלל את המתח שאילתה OD 600 = 0.1 ב 2L של YPD. Shake עבור 4-6 שעות בקצב של 30 ° C (200 סל"ד) עד התרבות מגיע OD 600 = 0.8-1.0. לצמיחה אופטימלית, לגדול שתי התרבויות 1 ליטר ב 2.8 צלוחיות נפרדות L מבולבל. במידת הצורך, מדיה סלקטיבי יכול לשמש גם במקום YPD. </li></ol> 2. שמרים שינוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים על ידי צנטריפוגה. מלאו ארבעה צינורות הפנויה חרוטי 225mL עם התרבות שמרים ספין על 3000rpm (~ 1800 XG) במשך 5 דקות בצנטריפוגה השולחן (Eppendorf 5810R). יוצקים את supernatant וחזור עד שכל התאים נקצרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים 200 מ"ל של autoclaved מזוקקים H 2 O. Resuspend תא גלולה ידי ניעור או vortexing. שלב התאים הגליל האחד חרוט 225mL. ספין על 3000rpm במשך 5 דקות. הסר supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 0.1MLiOAc/1XTE (0.1M LiOAc, 10mm טריס, 1mm EDTA, pH 8 במים מזוקקים autoclaved). שטפו תאים 0.1MLiOAc/1XTE 100 מ"ל. ספין על 3000rpm במשך 5 דקות. הסר supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תא גלולה ב 70mL 0.1M LiOAc/1xTE. Shake ו / או מערבולת כדי להבטיח גלולה הוא resuspended לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם רועד ב 30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות (200 סל"ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף β-mercaptoethanol ל 0.1M. דגירה עם רועד ב 30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות (200 סל"ד). הערה: שלב זה ניתן להשמיט אם באמצעות זני שמרים הרגישים mercaptoethanol-β. מצאנו כי צעד זה אינו הכרחי לשינוי מוצלח, אולם הוא עושה לשפר את יעילות הטרנספורמציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיחים 2ml של ה-DNA זרע sonicated סלמון (10mg/mL) למשך 15 דקות ולאחר מכן לצנן על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2ml של ה-DNA סלמון מבושל זרע לתערובת התא. זהירות: המשקע עלול להיווצר על תוספת של ה-DNA סלמון זרע לתערובת התא. שימוש pipetman ו -200 μl טיפ, להסיר בזהירות כל המשקע שנוצר, כי זה עלול להפריע pipetting במורד הזרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50μL Aliquot תערובת של התא היטב בכל צלחת 96-היטב באמצעות Rapidplate BioRobot (ניתן גם להשתמש מרובת ערוצים פיפטה). אל תערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בלי לרעוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 200 מ"ל של 40% PEG-3350/10% DMSO/0.1M LiOAc (160mL של 50% PEG-3350, DMSO 20mL, LiOAc 20mL 1M). הכן פתרון מיד לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 125μL הפתרון PEG / LioAc / DMSO היטב כל אחד. מערבבים על ידי aspirating מחלק ההשעיה תא שמונה פעמים עם RapidPlate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בלי לרעוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הלם מחממים את התאים על 42 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות בתוך אינקובטור יבש. אל ערימת הצלחות. הערה: מצאנו כי צעד זה הלם חום אינו חיוני לשינוי מוצלח. עבור זני שמרים מסוימים (למשל, מוטציות רגישות טמפרטורה), הלם החום מזיקות. צמצמנו בעבר הזמן הלם החום דקה אחת הצליחו להפוך בהצלחה זן שמרים מחסה מוטציה ypt1 טמפרטורה רגיש בפרוטוקול זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין צלחות על 2500rpm (~ 1100 XG) במשך 5 דקות, באמצעות מתאמים צנטריפוגות כדי להכיל 96-גם הצלחות. הסר הפתרון PEG על ידי צלחות היפוך מעל דלי פסולת. כתם צלחת הפוכה על מגבת נייר כדי להסיר את נוזל שיורי (תאים יישארו בתחתית בארות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את התאים על ידי הוספת 200μL התקשורת מינימלי (למשל SD /-עורה) היטב עם כל RapidPlate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין צלחות ב 2500rpm במשך 5 דקות ולהסיר supernatant ידי דלי היפוך פסולת שוב על מגבות נייר סופג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200μL התקשורת מינימלי (למשל SD /-עורה) היטב עם כל RapidPlate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 30 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים בלי לרעוד. אחרי 2 ימים, מושבות קטנות של תאים צריך להתחיל לגבש בתחתית כל טרנספורמציה בהצלחה היטב. </li></ol> 3. אכון assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 200μL התקשורת raffinose מינימלי מבוסס (כגון השרף /-עורה) לתוך הבאר אחדחדש שטוח 96-התחתונה גם צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב את כל הצלחת השינוי על ידי aspirating מחלק ההשעיה תא שמונה פעמים עם Rapidplate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן צלחות השרף עם 5μL תערובת תא מהצלחת שינוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 30 מעלות צלזיוס למשך יום אחד. מושבות קטנים צריכים להיות נוכחים בחלק התחתון של כל טוב אחרי יום אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוט מושבות על SD /-עורה ואת SGal /-עורה צלחות מכסה המנוע. לעקר 96-הבריח משכפל (Frogger) על ידי בוערים. מערבבים עם מושבות Frogger לפני תצפית על צלחות התקשורת סלקטיבית. לאחר תצפית, לאפשר צלחות לייבוש מכסה המנוע למשך 5-10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים. </li></ol> צלחות צילום עם מצלמה דיגיטלית, ו חזותית להשוות צמיחה של מושבות על SGal /-עורה צלחות למצוא מושבות שבהן רעילות זן שאילתה משופרים (צמיחה איטית / מושבות פחות צפוף) או מודחקים (צמיחה מהיר / במושבות צפופות יותר). 4. נציג התוצאות: <img src="/files/ftp_upload/2836/2836fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. Overexpression פלסמיד שמרים המסך כדי לזהות מדכאי ו משפרי של רעילות TDP-43. TDP-43 הוא חלבון אנושי כי היה מעורב בפתוגנזה של טרשת לרוחב amyotrophic (מחלת לו גריג). אגרגטים cytoplasmic של TDP-43 להצטבר במוח הנוירונים בחוט השדרה של חולי ALS 17. הבעת TDP-43 תוצאות בתאי שמרים צבירה cytotoxicity 18. השתמשנו במערכת זו מודל להגדיר מנגנוני הרעילות TDP-43 19,20. מוצגות דוגמאות של צלחות repesentative מן השמרים שלנו TDP-43 משנה מסך רעילות. לוחות אלה מציגים מושבות עם משולבת גלקטוז ועין מתנהלת-TDP-43 פלסמיד והפך גם עם פלסמידים מהספריה ביטוי FLEXGene ORF. צלחת בצד שמאל מכיל גלוקוז, אשר מדכא ביטוי TDP-43 או פלסמידים FLEXGene. צלחת בצד ימין מכיל גלקטוז, אשר מעוררת את הביטוי של TDP-43 ואת ORFs של פלסמידים FLEXGene. החץ הירוק מצביע על המושבה הפכה עם פלסמיד זה מדכא את הרעילות של TDP-43. החץ האדום מצביע על המושבה הפכה עם פלסמיד זה משפר את הרעילות של TDP-43.

<ol><li>Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nobel+Prize+and+beyond%3A+an+interview+with+Sir+Paul+Nurse.+Interview+by+Susan+R.+Owens%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The Nobel Prize and beyond: an interview with Sir Paul Nurse. Interview by Susan R. Owens.</a> EMBO Rep. 3, 204-206 (2002).</li>
<li>Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nobel+Lecture.+Yeast+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Rep%22%5BJournal%5D)">Nobel Lecture. Yeast and cancer.</a> Biosci Rep. 22, 373-394 (2002).</li>
<li>Stevens, T., Esmon, B., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+stages+in+the+yeast+secretory+pathway+are+required+for+transport+of+carboxypeptidase+Y+to+the+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Early stages in the yeast secretory pathway are required for transport of carboxypeptidase Y to the vacuole.</a> Cell. 30, 439-448 (1982).</li>
<li>Novick, P., Ferro, S., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Order+of+events+in+the+yeast+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Order of events in the yeast secretory pathway.</a> Cell. 25, 461-469 (1981).</li>
<li>Novick, P., Field, C., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+23+complementation+groups+required+for+post-translational+events+in+the+yeast+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of 23 complementation groups required for post-translational events in the yeast secretory pathway.</a> Cell. 21, 205-215 (1980).</li>
<li>Sopko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+pathways+and+phenotypes+by+systematic+gene+overexpression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression.</a> Mol Cell. 21, 319-330 (2006).</li>
<li>Alberti, S., Gitler, A. D., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+suite+of+Gateway%28%28R%29%29+cloning+vectors+for+high-throughput+genetic+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">A suite of Gateway((R)) cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 24, 913-919 (2007).</li>
<li>Gelperin, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+genetic+analysis+of+the+yeast+proteome+with+a+movable+ORF+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection.</a> Genes Dev. 19, 2816-2826 (2005).</li>
<li>Hu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaching+a+complete+repository+of+sequence-verified+protein-encoding+clones+for+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae.</a> Genome Res. 17, 536-543 (2007).</li>
<li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418, 387-391 (2002).</li>
<li>Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+genetic+interactions+and+networks+with+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Exploring genetic interactions and networks with yeast.</a> Nat Rev Genet. 8, 437-449 (2007).</li>
<li>Mnaimneh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+essential+gene+functions+via+titratable+promoter+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploration of essential gene functions via titratable promoter alleles.</a> Cell. 118, 31-44 (2004).</li>
<li>Parsons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+chemical-genetic+and+genetic+interaction+data+links+bioactive+compounds+to+cellular+target+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways.</a> Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).</li>
<li>Schuldiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+the+function+and+organization+of+the+yeast+early+secretory+pathway+through+an+epistatic+miniarray+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li>
<li>Tong, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li>
<li>Tong, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+mapping+of+the+yeast+genetic+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global mapping of the yeast genetic interaction network.</a> Science. 303, 808-813 (2004).</li>
<li>Neumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitinated+TDP-43+in+frontotemporal+lobar+degeneration+and+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis.</a> Science. 314, 130-133 (2006).</li>
<li>Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+TDP-43+proteinopathy+model%3A+Exploring+the+molecular+determinants+of+TDP-43+aggregation+and+cellular+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 6439-6444 (2008).</li>
<li>Elden, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ataxin-2+intermediate-length+polyglutamine+expansions+are+associated+with+increased+risk+for+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS.</a> Nature. 466, 1069-1075 (2010).</li>
<li>Johnson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+is+intrinsically+aggregation-prone%2C+and+amyotrophic+lateral+sclerosis-linked+mutations+accelerate+aggregation+and+increase+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">TDP-43 is intrinsically aggregation-prone, and amyotrophic lateral sclerosis-linked mutations accelerate aggregation and increase toxicity.</a> J Biol Chem. 284, 20329-20339 (2009).</li>
<li>Cooper, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+blocks+ER-Golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson%27s+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313, 324-328 (2006).</li>
<li>Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beer+and+Bread+to+Brains+and+Beyond%3A+Can+Yeast+Cells+Teach+Us+about+Neurodegenerative+Disease%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosignals%22%5BJournal%5D)">Beer and Bread to Brains and Beyond: Can Yeast Cells Teach Us about Neurodegenerative Disease?</a> Neurosignals. 16, 52-62 (2008).</li>
<li>Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+is+part+of+a+diverse+and+highly+conserved+interaction+network+that+includes+PARK9+and+manganese+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity.</a> Nat Genet. 41, 308-315 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

כאן אנו מציגים פרוטוקול לבצע המסך תפוקה גבוהה overexpression פלסמיד בשמרים. גישה זו מאפשרת להקרנה מהירה משוחדת עבור מכפילי הגנטי של פנוטיפים רבים סלולריים שונים. שימוש בגישה זו, חוקר יכול המסך חלק ניכר של הגנום שמרים ב עניין של שבועות. גישה זו משוחדת גם מאפשר זיהוי של מכפילי, אשר לא יכול היה לנבא מבוסס על ממצאים קודמים. השתמשנו בגישה זו כדי לזהות מכפילי של רעילות הקשורות אגרגציה של חלבונים אנושיים למחלות ניווניות 19,21-23. עם זאת, בשל כושר ההסתגלות של פרוטוקול זה ללמוד ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> BioRobot RapidPlate </td><td> Qiagen </td><td> 9000490 </td></tr><tr><td> 96 הבריח משכפל (Frogger) </td><td> V &amp; P מדעי </td><td> VP404 </td></tr><tr><td> FLEXGene ORF הספריה </td><td> המכון Proteomics, מבית הספר לרפואה הארוורד </td><td></td></tr><tr><td> Tabletop צנטריפוגות </td><td> Eppendorf </td><td> 5810R </td></tr><tr><td> בקבוק מבולבל 500ml </td><td> Bellco </td><td> 2543-00500 </td></tr><tr><td> 2.8L משולשת מבולבל Fernbach צפחת </td><td> Bellco </td><td> 2551-02800 </td></tr><tr><td> 100μL Rapidplate פיפטה טיפים </td><td> Axygen </td><td> ZT-100-RS </td></tr><tr><td> 200μL Rapidplate פיפטה טיפים </td><td> Axygen </td><td> ZT-200-RS </td></tr></tbody></table>

תפוקה גבוהה overexpression פלסמיד שמרים מסך

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

נבגי שמרים, cerevisiae Saccharomyces, היא מערכת מודל עוצמה להגדרת המנגנונים הבסיסיים של תהליכים תאיים רבים חשובים, כולל אלה עם שייכות ישירה מחלות אנושיות. בגלל הזמן הקצר של הדור שלה היטב מאופיין הגנום, יתרון הניסוי העיקריים של מערכת מודל שמרים היא היכולת לבצע מסכי גנטית כדי לזהות גנים המסלולים המעורבים בתהליך נתון. במשך שלושים השנים האחרונות מסכי גנטי כזה כבר בשימוש על מנת להבהיר את מחזור התא, מסלול הפרשה, והיבטים רבים יותר שמור ביותר של ביולוגיה של התא אוקריוטים 1-5. בשנים האחרונות, ספריות genomewide מספר זני שמרים פלסמידים נוצרו 6-10. אוספים אלה מאפשרים כעת לחקירה שיטתית של תפקוד הגן באמצעות רווח, והפסד של פונקציה גישות 11-16. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט לשימוש פרוטוקול תפוקה גבוהה טרנספורמציה שמרים עם רובוט טיפול הנוזל לבצע מסך overexpression פלסמיד, באמצעות ספריה ערוכים של 5500 פלסמידים שמרים. אנחנו משתמשים במסכים אלה כדי לזהות מכפילי הגנטי של רעילות הקשורות הצטברות של צבירה נוטה חלבונים אנושיים מחלות ניווניות. השיטות שהוצגו כאן הם להתאמה בקלות ללימוד פנוטיפים סלולריים אחרים בעלי עניין.

כאן אנו מתארים מסך overexpression פלסמיד ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;, באמצעות פלסמיד ספריה ערוכים ו תפוקה גבוהה טרנספורמציה פרוטוקול שמרים עם רובוט טיפול נוזלי.

תפוקה גבוהה Overexpression פלסמיד שמרים מסך

השמר המנבט, *Saccharomyces cerevisiae*, הוא מערכת מודל רבת-עוצמה להגדרת מנגנונים בסיסיים של תהליכים תאיים חשובים רבים, ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לבצע טרנספורמציה לתאי שמרים באמצעות ספריית מערך של DNA של פלזמה. דבר זה מושג תחילה על ידי גידול של כמות מתאימה של תאי שמרים. לאחר מכן, תאי השמרים מטופלים בליתיום אצטט כדי להפוך אותם לקומפטנטיים לטרנספורמציית DNA.בשלב הבא, בצע טרנספורמציה לתאי ה-e כשירים על ידי ערבובם עם DNA. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא בחירה וניתוח של הטרנספורמנטים. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות את השפעות ה-plasma DNA על פנוטיפים של שמרים באמצעות בדיקות spotting של שמרים ו/או מיקרוסקופיה.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני פרוטוקולים קיימים, כגון טרנספורמציות סטנדרטיות של שמרים, הוא שהיא מאפשרת טרנספורמציה של מספר רב של פלסמידים שונים לתאי שמרים באופן אוטומטי. פרוטוקול טרנספורמציה של שמרים בתפוקה גבוהה זה תוכנן עבור 10 פלטות של 96 בארות, אך ניתן להגדילו או להקטינו בהתאם. עבור ניסויים בקנה מידה גדול יותר, המפתח להצלחה הוא שמירה על ארגון של כל הפלטות והריאגנטים.כדי למנוע בלבול לאחר תחילת הניסוי, בפרוטוקול זה יעשה שימוש במערכת טיפול בנוזלים מהירה בלוחות מסוג A biobot. לתחילת העבודה, יש להעביר מנות (aliquot) של 5 עד 10 µL של DNA מפלסמה מספריית פלסמידים של שמרים למספר מערכים לתוך כל באער בלוחות 96 באערים בעלי תחתית עגולה. יש להניח את לוחות ה-96 באערים ללא כיסוי בתוך מנדף נקי למשך הלילה לייבוש.לאחר מכן, זרעו זן תחת בחינה לתוך 200 milliliters של מצע שמרים פפטיד דקסטרוז או YPD בתוך בקבוק Lin Meyer עם מחיצות בנפח 500 milliliters; דגרו למשך לילה בטמפרטורה של 30 degrees Celsius עם ניעור. למחרת בבוקר, דללו את הזן תחת בחינה עד ל-OD 600 של 0.1 בשני ליטרים של מצע YPD לצמיחה אופטימלית. גדלו תרביות של עד ליטר אחד בבקבוקים נפרדים עם מחיצות בנפח 2.8 liters.נער את הבקבוקים במשך ארבע עד שש שעות בטמפרטורה של 30 °C עד שהתרביות מגיעות ל-OD 600 של 0.8 עד 1.0. כאשר תרבית השמרים הגיעה ל-OD 600 של 0.8 עד 1.0, קצור את התאים באמצעות צנטריפוגציה. מלא ארבעה מבחנות קוניות חד-פעמיות בנפח 225 milliliter בתרבית, וסובב ב-3000 RPM למשך חמש דקות בצנטריפוגה שולחנית.שפכו את העילאי (supernatant) מכל מבחנה. הוסיפו תרבית נוספת לאותן מבחנות וסובבו שוב בצנטריפוגה, חזרו על הפעולה במידת הצורך עד להסבה של כל התאים. שטפו כל משקע תאים ב-50 milliliters של מים מזוקקים שעברו אוטוקלאב וערבבו מחדש באמצעות וורטקס (vortexing).שילו את התאים בתוך מבחנה קונית אחת של 225 milliliters וסובבו במהירות של 3000 RPM למשך חמש דקות. לאחר הסרת ה-S supernatant, שטפו את התאים ב-100 milliliters של תמיסת lithium acetate. סובבו שוב במהירות של 3000 RPM למשך חמש דקות.הסר את ה-SNA ותלה מחדש את משקע התאים ב-70 milliliters של תמיסת lithium acetate. ערבב במכשיר vortex במהירות גבוהה למשך כ-30 שניות עד שהמשקע נתלה מחדש באופן מלא. דגור עם ניעור ב-30 degrees Celsius למשך 30 דקות.בשלב הבא, הוסיפו beta me capto ethanol לריכוז של 0.1 molar והדגרירו עם ניעור בטמפרטורה של 30 °C למשך 30 דקות נוספות. לאחר הדגירה של 30 דקות, הוסיפו שתי מיליליטר של DNA מזרה של סלמון, שהורתח וקורר, לתערובת התאים. שפכו את תערובת התאים לפלטה בעלת באר אחת הניתנת לאוטוקלבה, ולאחר מכן הסירו כל משקע שנוצר, כיוון שזה עלול להפריע לשלבי הפיפטינג בהמשך.באמצעות ה-biobot rapid plate, העבירו מנה של 50 µL מתערובת התאים לכל באר בארבעת לוחות ה-96 באערים שהוכנו מראש ומכילים plasma DNA; אין לערבב. דגרו את הלוחות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות ללא ניעור, בזמן שהתאים מדגרים.הכינו 200 מיליליטר של תמיסת PEG DMSO lithium acetate. ערבבו 160 מיליליטר של 50% PEG 33, 50, 20 מיליליטר של DMSO ו-20 מיליליטר של lithium acetate בריכוז one molar. חשוב להכין תמיסה זו רגע לפני השימוש.הוסיפו 125 µL של תמיסת PEG lithium acetate DMSO לכל דגימה. ערבבו היטב על ידי שאיבה והזרקה של תרחיף התאים שמונה פעמים. הדגרימו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות ללא ניעור.בשלב הבא, בצעו הלם תרמי לתאים בטמפרטורה של 42 degrees Celsius למשך 15 דקות באינקובטור יבש; אין לערום את הפלטות לאחר ההלם התרמי. סובבו את הפלטות באמצעות מתאמי צנטריפוגה המתאימים לפלטות של 96 בארות. לאחר הצנטריפוגציה, הסירו את תמיסת ה-PEG על ידי היפוך הפלטות מעל דלי פסולת. לאחר מכן, ייבשו את הפלטות ההפוכות בעזרת נייר סופג.כדי להסיר נוזלים ששאריותיהם נותרו, התאים יישארו בתחתית הבארות. שטפו את התאים על ידי הוספת 200 µL של מצע גידול מינימלי לכל בארה. סובבו את הפלטות שוב במערכת הצנטריפוגה.הסיר את הנוזל העליון על ידי הפיכת המערכת מעל דלי פסולת וספיגה באמצעות נייר סופג. הוסף 200 µL של מצע מינימלי לכל באר באמצעות מפזר פלטות מהיר, והדגר בטמפרטורה של 30 °C למשך יומיים ללא ניעור. לאחר יומיים, קולוניות קטנות של תאים אמורות להתחיל להיווצר בתחתית כל באר שבה בוצע הטרנספורקציה בהצלחה.כדי להכין את הבדיקה לזריעת נבגים (Spatting assay), יש להעביר תחילה 200 µL של מצע מינימלי מבוסס OSE לכל באער של פלטת 96 באערים שטוחה ותחתונית חדשה. לאחר מכן, יש לערבב כל באער בפלטת הטרנספורמציה על ידי שאיבה ושחרור של תרחיף התאים שמונה פעמים באמצעות פיפטה רב-ערוצית מהירה.החדירו לכל באער בלוחית הראפינוז חמישה מיקרולטרים של תערובת תאים מלוחית הטרנספורמציה, והדגרירו בטמפרטורה של 30 °C למשך יום אחד. למחרת, אמורות להופיע מושבות קטנות בתחתית כל באער.בצעו את בדיגת הנקודות (spotting assay) בתוך המCב, ועקרו את ה-96-pin replicator או את ה-frogger על ידי שריפה בלהבה. ערבבו את המושבות באמצעות ה-frogger ולאחר מכן העבירו נקודות מהמושבות אל מצעים סלקטיביים. לאחר ההעברה, השאירו את המצעים להתייבש בתוך המבב למשך 5 עד 10 דקות.דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 30 °C למשך יומיים עד שלושה ימים. מוצגים כאן תוצאות מייצגות של סריקת ביטוי-יתר של פלסמיד בשמרים לזיהוי מדכאים (suppressors) ומעצבים (enhancers) של רעילות TDP 43. TDP 43 הוא חלבון אנושי המעורב בפתוגנזה של סקלרוסיס צדיים שרירי (amyotrophic lateral sclerosis) או מחלת לו גריג; ביטוי של TDP 43 בתאי שמרים מוביל לאגרגציה ולציטוטוקסיות.צלחות אלו מציגות מושבות עם פלסמיד T DP 43 משולב הניתן להשראה על ידי גלקטוז, אשר עברו גם טרנספורמציה עם פלסמידים מספריית ביטוי ה-ORF של גן ה-flex. המושבות כאן מופיעות בצבע אדום מכיוון שהזן כולל מוטציה הגורמת להצטברות של פיגמנט אדום. הצלחת משמאל מכילה גלוקוז, המדכא את הביטוי של T DP 43 או של פלסמידי גן ה-flex.המונח בצלחת מימין מכיל גלקטוז, המשרה את הביטוי של TDP 43 ושל ה-O Fs בפלסמידי הגן flex. חץ ראשון ירוק מצביע על מושבה שעברה טרנספורמציה עם פלסמיד המדכא את הרעילות של TDP 43, כפי שניתן לראות מצמיחה מהירה יותר ומושבות דחוסות יותר. חץ ראשון אדום מצביע על מושבה שעברה טרנספורמציה עם פלסמיד המגביר את הרעילות של TDP 43, כפי שניתן לראות מצמיחה איטית יותר ומושבות פחות דחוסות.לאחר צפייה בסרטון זה, תקישו להבנה טובה של האופן שבו ניתן לבצע טרנספורמציה לספרייה של plasma DNAs מתאים.

high-throughput-yeast-plasmid-overexpression-screen

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פיתחנו מקיף, משוחדת הגנום כולו מסכי להבין גנים סמים גנים הסביבה אינטראקציות. שיטות סינון אלה אוספים מוטציה מוצגים.

מסכי הגנום תחרותי של ספריות שמרים המבורקדים

אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבנייה וסינון של ספריות מוטנטיות עבור מסעות אבולוציה מכוונים ב-Saccharomyces cerevisiae.

בימוי שיטת אבולוציה<em&gt; שמר האפייה</em&gt;: יצירת ספריית Mutant והקרנה

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה תפוקה גבוהה על המסך באופן פונקציונלי עבור חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס.

הקרנה תפוקה גבוהה של חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס

עיבוד אצווה של שמרים 2-היברידית מסכים מאפשר השוואה ישירה של הפרופילים האינטראקציה של מספר חלבונים הפיתיון עם סט מורכב של חלבונים פיוז'ן טרף. כאן, אנו מתארים שיטות מעודן, ריאגנטים החדש וכיצד ליישם ושימושם עבור מסכי כזה.

מסך 2-היברידית שמרים אצווה כדי להשוות בין אינטראקציות חלבון

מאמר זה מציג שיטה מבוססת על הזיווג כדי להקל על הקרנת ביטוי ניצני שמרים באמצעות ספריה פלסמיד ערוכים.

ביטוי ההזדווגות מבוססי ספריית הקרנה שמרים

פתוגנים חיידקיים מפרישות חלבונים לתוך המחשב המארח המטרה תהליכים ביולוגיים קריטיים. זיהוי מסלולים המארחים ממוקד על ידי חלבונים החיידק אפקטור הוא המפתח לטיפול פתוגנזה מולקולרית. כאן, שיטה באמצעות מדכא שמרים שונה ומסך רעילות כדי להבהיר מסלולים מארחים ממוקד על ידי חלבונים בקטריות אפקטור רעיל מתואר.

זיהוי של מסלולים מארחים ממוקד על ידי חלבונים בקטריות אפקטור באמצעות רעילות שמרים מסכי מדכא

צוואר בקבוק במחזור ' עיצוב-לבנות בדיקה ' של הנדסת חיידקים היא המהירות שבה אנחנו יכולים לבצע מסכי פונקציונלי של זנים. אנו מתארים שיטת תפוקה גבוהה לסינון המתח המוחל על מאות אלפי תאים שמרים לכל ניסוי העושה שיטה ברצף RNA מבוסס droplet.

תפוקה גבוהה שמרים להתאמץ פנוטיפים עם רצפי רנ א מבוססי Droplet

מטרת פרוטוקול זה היא לספק מדריך מפורט, צעד אחר צעד להרכבת מבנים מרובי גנים באמצעות מערכת שיבוט מודולרית המבוססת על שיבוט שער הזהב. הוא גם נותן המלצות על צעדים קריטיים כדי להבטיח הרכבה אופטימלית המבוססת על החוויות שלנו.

הרכבה מהירה של מבנים מרובי גנים באמצעות שיבוט שער הזהב מודולרי

פרוטוקול זה מתאר את השלבים החיוניים לביצוע קמפיינים לבחירת פני השטח של שמרים להעשרת וריאנטים חלבוניים הנקשרים לאנטיגן מעניין.

הנדסת חלבונים על ידי תצוגת פני שטח שמרים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש במצעים המוצגים על פני השטח של שמרים לבדיקות שינוי אנזימטיות. הפלטפורמה הודגמה באמצעות ניתוח פעילות הדפוספורילציה של טירוזין פוספטאז SHP-2 כנגד אחד המצעים שלו כבדיקת שינוי אנזימטי מייצגת.

שינוי אנזימטי והערכת ציטומטריית זרימה של חלבונים המוצגים על פני השטח של שמרים

למדו פרוטוקול אוטומציה לטרנספורמציה בנפח גבוה של שמרים Saccharomyces cerevisiae עם ספריית פלסמידים מסודרת. השיטה מאפשרת זיהוי משני גנטיקה של רעילות חלבונים אנושיים הקשורים במחלות ניווניות.

תפוקה גבוהה Overexpression פלסמיד שמרים מסך

גלה סרטונים נוספים