תפוקה גבוהה Overexpression פלסמיד שמרים מסך

המטרה הכוללת של הליך זה היא להפוך תאי שמרים עם ספריית מערך של DNA פלזמה. זה מושג על ידי גידול כמות מתאימה של תאי שמרים. לאחר מכן מטפלים בתאי השמרים בליתיום אצטט כדי להפוך אותם לכשירים לשינוי DNA.

לאחר מכן, הפוך את תאי ה- e המוכשרים על ידי ערבובם עם DNA. השלב האחרון של ההליך הוא בחירה וניתוח טרנספורמציה. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות את ההשפעות של ה-DNA של הפלזמה על פנוטיפים של שמרים באמצעות מבחני איתור שמרים ו/או מיקרוסקופיה.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני פרוטוקולים קיימים, כגון טרנספורמציות שמרים סטנדרטיות, הוא בכך שהיא מאפשרת הפיכה של מספר רב של פלסמידים שונים לתאי שמרים בצורה אוטומטית. פרוטוקול טרנספורמציה של שמרים בתפוקה גבוהה זה מיועד ל-10 96 לוחות בארות, אך ניתן להגדיל או להקטין אותו בהתאם. עבור ניסויים בקנה מידה גדול יותר, המפתח להצלחה הוא לשמור על כל הצלחות והריאגנטים מאורגנים.

לאחר שהניסוי יצא לדרך כדי למנוע בלבול, ייעשה שימוש במטפל בנוזל צלחת מהיר של ביובוט בפרוטוקול זה כדי להתחיל ב-aliquot, חמישה עד 10 מיקרוליטר של DNA פלזמה מספריית פלסמיד שמרים מערך לכל באר של הסיבוב. 96 צלחות באר תחתונות. הניחו את 96 צלחות הבאר החשופות בתוך קולט אדים ספסל נקי למשך הלילה לייבוש.

לאחר מכן, יש לחסן 200 מיליליטר של פפטיד שמרים, דקסטרוז או מדיה YPD עם זן שאילתה בבקבוק לין מאייר מבולבל בנפח 500 מיליליטר למשך הלילה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם טלטול בבוקר שלמחרת. יש לדלל את זן השאילתה ל-OD 600 של 0.1 בשני ליטרים של מדיית YPD לצמיחה אופטימלית. גדל עד תרבויות ליטר אחד בצלוחיות נפרדות של 2.8 ליטר מבולבלות.

יש לנער את הצלוחיות במשך ארבע עד שש שעות בחום של 30 מעלות צלזיוס עד שהתרביות מגיעות ל-OD 600 של 0.8 עד 1.0. כאשר תרבית השמרים הגיעה ל-OD 600 של 0.8 עד 1.0, קצרו את התאים על ידי צנטריפוגה. מלאו ארבעה צינורות חרוטיים חד פעמיים של 225 מיליליטר בתרבית, וסובבו 3000 סל"ד למשך חמש דקות בצנטריפוגה על השולחן.

יש לשפוך את חומר ה-S מכל צינור. הוסף שוב תרבית לאותם צינורות וצנטריפוגה, וחזור על הפעולה לפי הצורך עד לקצירת כל התאים. שטפו כל כדור תא ב -50 מיליליטר מים מזוקקים חיטוי והוצאות Resus על ידי מערבולת.

שלב תאים בצינור חרוטי אחד של מאתיים עשרים וחמישה מיליליטר וסובב במהירות של 3000 סל"ד למשך חמש דקות. לאחר הסרת הסופרנטנט S, שטפו את התאים במאה מיליליטר תמיסת ליתיום אצטט. סובב שוב ב -3000 סל"ד למשך חמש דקות.

הסר את ה- SNA השהה מחדש את כדור התא ב -70 מיליליטר של תמיסת ליתיום אצטט. מערבולת במהירות גבוהה למשך כ-30 שניות עד שהכדור מושעה לחלוטין. דגירה עם טלטול בחום של 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

לאחר מכן, הוסף אתנול בטא מי קפטו לדגירה טוחנת 0.1 עם ניעור בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות נוספות. לאחר הדגירה של 30 דקות, הוסיפו לתערובת התאים שני מיליליטר DNA של זרע סלמון מבושל וצונן . יוצקים את תערובת התאים לצלחת באר אחת הניתנת לחיטוי, ולאחר מכן מסירים את כל המשקעים שנוצרים מכיוון שהדבר עלול להפריע לפיפטינג במורד הזרם.

באמצעות צלחת הביובוט המהירה יש 50 מיקרוליטר של תערובת תאים לכל באר מבין הארבע שהוכנו בעבר. 96 צלחות באר המכילות DNA פלזמה אינן מתערבבות. דגרו את הצלחות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות מבלי לנער בזמן הדגירה של התאים.

הכן 200 מיליליטר של תמיסת ליתיום אצטט PEG DMSO. שלב 160 מיליליטר של 50% PEG 33, 50 20 מיליליטר DMSO ו-20 מיליליטר של ליתיום אצטט טוחנת אחת. חשוב שתמיסה זו תכין ממש לפני השימוש.

הוסף 125 מיקרוליטר של תמיסת PEG ליתיום אצטט DMSO לכל אחד. מערבבים היטב על ידי שאיבה וחלוקה של מתלה התאים שמונה פעמים. דוגרים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות מבלי לנער.

לאחר מכן, הלם חום את התאים בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בחממה יבשה, אל תערום את הצלחות לאחר הלם החום, סובב את הצלחות באמצעות מתאמי צנטריפוגה כדי להכיל את 96 לוחות הבאר. לאחר צנטריפוגה, הסר את תמיסת ה-PEG על ידי היפוך הצלחות מעל דלי פסולת. ואז כתם את הצלחות ההפוכות על מגבות נייר.

כדי להסיר נוזל שנותר, התאים יישארו בתחתית הבארות. שטפו את התאים על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של מדיה מינימלית לכל אחד. ובכן סובב שוב את הצלחות.

הסירו את הסופרנטנט על ידי היפוך מעל דלי אשפה וספיגה על מגבות נייר. הוסף 200 מיקרוליטר של מדיה מינימלית לכל באר עם צלחת מהירה דגירה ב-30 מעלות צלזיוס למשך יומיים מבלי לרעוד. לאחר יומיים, מושבות קטנות של תאים אמורות להתחיל להיווצר בתחתית כל טרנספורמציה מוצלחת.

ובכן כדי להתכונן לבדיקת ה-Spatting, תחילה הוצא 200 מיקרוליטר של מדיה מינימלית מבוססת OSE לכל באר של דירה חדשה. צלחת באר 96 תחתונה. הבא. מערבבים כל באר של לוחית הטרנספורמציה על ידי שאיבה וחלוקה של מתלה התא שמונה פעמים עם צלחת מהירה.

חסנו כל באר של צלחת הרפינוז בחמישה מיקרוליטרים של תערובת תאים מצלחת הטרנספורמציה, דגרו בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך יום אחד. למחרת. מושבות קטנות צריכות להיות בתחתית כל אחת מהן.

בצע היטב את בדיקת האיתור במכסה המנוע, עקר בורג 96, משכפל או פרוגר על ידי התלקחות. מערבבים את המושבות עם פרוגר ואז מבחינים במושבות על לוחות מדיה סלקטיביים. לאחר האיתור, הניחו לצלחות להתייבש במכסה המנוע למשך חמש עד 10 דקות.

דגרו את הצלחות בחום של 30 מעלות צלזיוס למשך יומיים-שלושה. מוצג להלן תוצאות מייצגות של פלסמיד שמרים על מסך ביטוי לזיהוי מדכאים ומשפרים של TDP 43.רעילות. TDP 43 הוא חלבון אנושי המעורב בפתוגנזה של טרשת צידית מיוטרופית או מחלת לו גריג המבטא TDP 43 בתאי שמרים גורם לצבירה וציטוטוקסיות.

לוחות אלה מציגים מושבות עם פלסמיד משולב המעורר גלקטוז, T DP 43 שעברו טרנספורמציה גם עם פלסמידים מספריית הביטוי של הגן הגמיש ORF. המושבות כאן נראות בצבע אדום מכיוון שלזן יש במקרה מוטציה שגורמת להצטברות של פיגמנט אדום. הצלחת משמאל מכילה גלוקוז, המדכא את הביטוי של T DP 43 או פלסמידים של הגן הגמיש.

הצלחת מימין מכילה גלקטוז, הגורם לביטוי של TDP 43 ו-O Fs בפלסמידים של הגן הגמיש. ראש החץ הירוק מצביע על מושבה שעברה טרנספורמציה עם פלסמיד המדכא את הרעילות של TDP 43 כפי שמצוין על ידי צמיחה מהירה יותר ומושבות צפופות יותר. ראש החץ האדום מצביע על מושבה שעברה טרנספורמציה עם פלסמיד המשפר את הרעילות של TDP 43 כפי שמצוין על ידי צמיחה איטית יותר ומושבות פחות צפופות.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להפוך ספריית הימנעות של תאי DNA בפלזמה.