Name: הביצית Microinjection עכבר, הבשלה ו Ploidy הערכה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: למד מיקרו-הזרקה לתאי ביצית עכבר והערכת פלואידיות בביציות מטאפזה II. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני הפרדת כרומוזומים בביולוגיה רפרודוקטיבית ובהבנת עקרות פוריות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נערך במעבדה שולץ ריצ&#39;רד מ &#39;s. המחברים רוצה גם להודות מיכאל לאמפסון על המשגה של assay-centromere לספור גישה מיקרוסקופ confocal שלו. תרזה צ&#39;אנג ופרנצ&#39;סקה דאנקן סייע אופטימיזציה של assay centromere-הספירה. פאולה שטיין נתמך על ידי HD022681 (כדי RMS) וקארן שינדלר נתמך על ידי HD055822.

1. הביצית עכבר אוסף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למקסם את מספר הזקיקים antral מבודד כל עכבר, intraperitoneally להזריק נקבות עכברים בוגרים מינית (אנו משתמשים 6 שבועות בן CF-1 עכברים מן הארלן) עם 5 IU של נסיוב סוסה בהריון של גונדוטרופין (PMSG). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את אוסף בינוני (ממ / PVP) (3 מ"ל / עכבר) על ידי הוספת milrinone עד 2.5 מיקרומטר וחם אותו 37 ° C. Milrinone הוא מעכב phosphodiesterase המקיימת מעצר meiotic פעם ביציות יוסרו זקיקים. לחילופין, 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) (0.2 מ"מ) או dibutyryl-monophosphate מחזורי אדנוזין (dbcAMP) (100 מיקרוגרם / מ"ל) יכול לשמש. הכן את המדיום התרבות ידי הוספת גלוטמין (1 מ"מ) milrinone (2.5 מיקרומטר) ל 1 מ"ל של CZB ולאפשר לו לאזן בחממה במשך שעה לפחות. הגדרת microdrops של כל צלחת פטרי עם שכבת שמן מינרלי. המנה CZB מושם לתוך החממה בעוד צלחת ממ / PVP נשאר בחוץ בשקופית חם. אוסף אחרים בינוני תרבות כי הם זמינים מסחרית (M2 ו M16 מן התקשורת מיוחדים או סיגמא) גם בשימוש שגרתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 48 שעות לאחר PMSG תחול, להקריב את העכבר באמצעות CO 2 הרגעה בעקבות נקע בצוואר הרחם, השחלות לנתח ולהכניס אותם לתוך watchglass המכיל מראש חימם ממ / PVP + milrinone (ממ / PVP + M). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מזרק אינסולין 1 מ"ל, לעגן את השחלות כדי בצלחת ולשחרר את זקיקי antral על ידי ניקוב אותם מספר פעמים עם מד-27 (או תפירה) מחטים כי הם מהודקים יחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד להביט דרך מיקרוסקופ לנתיחה, לאסוף קומולוס-הביצית מתחמי באמצעות הפה המופעלים פיפטה מזכוכית. זה עוזר לי מיקרוסקופ עם הרבה ניגודיות. לחלופין, המדיום המכיל את רקמות תאים ניתן pipetted על מכסה של צלחת פטרי מפלסטיק. רק לאסוף גדול, זקיקי antral ולא קטן מראש antral זקיקים או ביציות הערומים. אסף פעם, כדי להעביר את מתחמי microdrop של ממ / PVP + M זה בשקופית חם תחת שמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה קטנה (מעט גדול יותר מאשר קוטר של הביצית), פיפטה במעלה ובמורד מתחמי לנתק את התאים קומולוס. מעבירים את ביציות הערומים עם טפטפת לתוך microdrop גדול של CZB + milrinone (CZB + M) ומקום בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר ביציות להתאושש במשך שעות לפחות 1 בחממה לפני מניפולציה. </li></ol> 2. הביצית microinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את pipettes הזרקת ידי משיכת בורוסיליקט זכוכית צינור נימי ב חולץ מכני. אנו משתמשים Flaming-micropipette חולץ בראון (דגם P-97) עם ההגדרות הבאות: P = 500, חום = 300, משוך = 150, לוול ךיב = 100, זמן = 150. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו את הפלטפורמה microinjection ידי הצבת ירידה של 5 μl ממ / PVP + M קרוב ככל האפשר לירידה 0.5 μl של חומר הזרקה של בחירה (למשל siRNA, קרנה, oligonucleotide morpholino, וכו ') בשקופית 1-גם תא זה יש את תא התקשורת יוסרו. מכסים עם שמן מינרלי מקום על הבמה מיקרוסקופ (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום ההזרקה pipettes מחזיק לתוך מחזיקי ואת המיקום לתוך ירידה של ממ / PVP + M. הפעל את הטנקים חנקן המחוברים picoinjector ואנטי רטט השולחן. פתח את קצה פיפטה את הזריקה בעדינות על ידי הקשה עליו מפני פיפטה מחזיקה בעוד ממלא אותו בינוני. אם הפתח גדול מדי, המדיום יעברו פנימה והחוצה במהירות המחט יהרוג את התא. Pipettes עם קטן מדי של פתיחת לעתים קרובות להדביק בקלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת ביציות (10/05) מן החממה עד טיפת ממ / PVP M + על הרציף. לפני הזרקה, ההתקנה picoinjector. אנו משתמשים בפרמטרים הבאים על picoinjector שלנו (דגם PLI-100 מהרווארד Apparatus): PBal = 2.5-3.5 psi, PInj = 7.8 psi, PClear = 10-12 psi, זמן = -3. התוצאה היא נפח זריקה של PL 5-10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד לחיצה שקוף, להעביר את המזרק עד טיפת חומר מילוי. להחזיר אותו טיפה הבינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה מחזיקה ללכוד הביצית וליישר את מחט הזריקה, הביצית ו פיפטה מחזיק לאורך ציר ה-x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת הגדלה גבוהה, לקדם את פיפטה הזרקה באמצעות הביצית להיות זהיר, כדי למנוע את הגרעין. לאחר הממברנה הפלסמטית היא פירסינג, לחץ להזריק. לאחר ההזרקה, למשוך את המחט. שחרור הביצית וחזור. לאחר כל ביציות מוזרקים, להחזיר אותם בחממה. תחזיק ב CZB + M בסכום הרצוי של זמן; הפעם תלוי במטרה הניסוי (כלומר siRNA ו מציאה morpholino (עד 24 שעות), overexpression (3-12 שעות)). שים לב incubations יותר מ 24 שעות תתפשר התבגרות meiotic. </li></ol> 3. הביצית הבשלה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה לשטוף את ביציות באמצעות מספר טיפות של CZB (בינוני התבגרות) והעברה microdrop של המדיום התבגרות תחת שמן מקום בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר 16 שעות עבור t הבשלה מלאה o metaphase של המיוזה השנייה. </li></ol> 4. Ploidy ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן CZB + monastrol (100 מיקרומטר) ומקום 750 μl לתוך הבאר של צלחת איבר תרבות כי יש מים בטבעת החיצונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ביצים באמצעות מספר טיפות של CZB + monastrol ולהעביר אותם לתוך צלחת התרבית איברים. מקום בחממה עבור ח 1 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את הביצים על ידי העברת אותם watchglass המכיל paraformaldehyde 2% PBS למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. העברת לתוך watchglass אחר עם חסימת פתרון. מנה זו ניתן לאחסן על 4 מעלות צלזיוס עד מעובד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה פתרון permeabilization (PBS + 0.3% + BSA TritonX-100 0.1% + 0.02% NaN 3) ב watchglass במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. יש לשטוף באמצעות כמויות גדולות של מספר חסימת פתרון (PBS + 0.3% + 0.01 BSA Tween-20 + NaN 0.02% 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שאר ההליך מבוצע על מכסה של צלחת 96-היטב בתא humidified בטמפרטורת החדר המוגן מן האור. טיפות (~ 25 μl) ממוקמים בתוך החריצים מעגלית. העברת ביצים לחסימת פתרון במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי תווית centromeres, ביצים להעביר ירידה של פתרון חסימת המכיל CREST אנטי סרום בשעה 01:40. דגירה של לפחות 1 ח לשטוף באמצעות 3 טיפות של תמיסת חסימה, דוגרים 15 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת ביצים ירידה של פתרון חסימת המכיל Cy5 או Alexa-פלואוריד-594-מצומדות אנטי אנושי IgG (1:200) ו דגירה עבור 1h. חזור על הצעדים לעיל כביסה למעט השלב האחרון, כולל Sytox הירוק (1:5,000) בפתרון חסימת לזהות כרומוזומים. הר ב μl 5 של Vectashield. כדי למנוע ריסוק של הביצים, לשים 4 נקודות קטנה של וזלין בפינות היכן coverslip יהיה. מניחים coverslip על גבי חותמת עם לק. חנות בתוך קופסת שקופיות על 4 מעלות צלזיוס עד עיבוד באמצעות מיקרוסקופיה confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד הדמיה עם מטרה 100x, ללכוד 0.4 מיקרומטר צעדים במישור-Z ואת התמונה של האזור כולו ציר metaphase. הרוזן centromeres באמצעות תוכנת הדמיה כגון תמונה J (NIH). </li></ol> 5. נציג תוצאות: איור 2 הוא השלכה Z-מביצית euploid. בשלב metaphase של MII, ביצים euploid עכבר מכילים 20 זוגות של כרומוזומים, ולכן יש 40 centromeres. מדי פעם הכרומוזומים להיכשל להפיץ למרות הטיפול monastrol. מצב זה מקשה על ספירת centromeres אמין ולכן אנו לא כוללים את הביצים הניתוחים שלנו. מדי פעם, יכול להיות אתגר כדי לקבוע אם CREST-immunoreactive "כתם" היא 1 או 2 centromeres. שימוש בתוכניות כגון J תמונה שימושית כי אפשר לנתח כל Z-סעיף תוך הקפדה לציין את הכיוון של כרומוזומים, מספר סעיפים בו "כתם" היא לאתר את עוצמת הפיקסל "נקודות" יש. בהתאם שבו ציר meiotic ממוקם ביחס לגוף קוטב, אזורים של DNA יכולים לחפוף אלה דגימות לא צריך להיכלל בניתוח. Unmanipulated, בביצים הביוץ vivo מעכברים reproductively צעירים יש שיעור נמוך של aneuploidy (~ 1-2%). עם זאת, מסיבות לא מובנות, microinjection ובשיטות חוץ גופית ההתבגרות יכולים להגדיל את זה כלפי מעלה בשיעור של 10%. לכן, זה קריטי, כי ביציות לשלוט מוזרק כלולים בכל מחקר microinjection. <img src="/files/ftp_upload/2851/2851fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. צלחת Microinjection להגדיר. שקופית קאמרית עם 5 טיפות של μl ממ / PVP + M מעל 0.5μl טיפות של תמיסת ההזרקה. מכסים עם שמן מינרלי. בדוגמה זו יש 3 טיפות 3 פתרונות הזרקה שונים והחלק את יושב על הבמה של מיקרוסקופ. משמאל את המחט microinjection וימינה הוא פיפטה מחזיקה. שים לב שיש השתקפות של מחזיקי מחט. <img src="/files/ftp_upload/2851/2851fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. Ploidy התוצאות. Z-השלכה של ביצה euploid II metaphase. DNA הוא בצבע ירוק kinetochores נצבעים באדום. החיצים מצביעים על 2 זרועות chromatid ברורים המעידים כי kinetochores (# 17 ו # 18) חופפים. ביצים עכבר Euploid מכילים 20 זוגות kinetochore (40 בסך הכל "נקודות"). ביצה aneuploid היה להכיל כל וריאציה על המספר הזה. אם הליך זה נערכו על ביציות metaphase MI, יהיו 40 זוגות kinetochore (80 בסך הכל "נקודות"). <img src="/files/ftp_upload/2851/2851table1.jpg" alt="טבלה 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="טבלה 1"> טבלה 1. מתכון בינוני איסוף microinjection (ממ / PVP + M). כל החומרים העובר תרבות כיתה ו מבית סיגמא אולדריץ. סנן לעקר דרך 0.22μm מסננים PVDF (אנו משתמשים Stericups Milipore) ולאחסן ב 4 ° C. iles/ftp_upload/2851/2851table2.jpg "alt =" טבלה 2 "/&gt; טבלה 2. מתכון בינוני CZB. כל החומרים העובר תרבות כיתה ו מבית סיגמא אולדריץ. סנן לעקר דרך 0.22μm מסננים PVDF (אנו משתמשים Stericups Milipore) ולאחסן ב 4 ° C.

<ol><li>Hunt, P. A., Hassold, T. J. Science. 296 (5576), 2181-2181 (2002).</li>
<li>Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. Hum Mol Genet. 16 Spec No. 2, R203-R203 (2007).</li>
<li>Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D. Journal of reproduction and fertility. 86 (2), 679-679 (1989).</li>
<li>Schultz, M. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchultz%2C+MR+%22Oogenesis+and+the+control+of+meiotic+maturation%22">Oogenesis and the control of meiotic maturation</a>. , Cambridge University Press. New York. (1986).</li>
<li>Moore, G. P., Lintern-Moore, S. Biol Reprod. 18 (5), 865-865 (1978).</li>
<li>Hodges, C. A., Hunt, P. A. Chromosoma. 111 (3), 165-165 (2002).</li>
<li>Schindler, K., Schultz, R. M. Cell Cycle. 8 (7), 1090-1090 (2009).</li>
<li>Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K. 20 (17), 1522-1522 (2010).</li>
<li>Mayer, T. U., Kapoor, T. M., Haggarty, S. J. Science. 286 (5441), 971-971 (1999).</li>
<li>Stein, P. Cold Spring Harbor protocols. 2009 (1), pdb prot5135-pdb prot5135 (2009).</li>
<li>Stein, P. Cold Spring Harbor protocols. 2009 (1), pdb prot5132-pdb prot5132 (2009).</li>
<li>Reis, A., Chang, H. Y., Levasseur, M. Nat Cell Biol. 8 (5), 539-539 (2006).</li>
<li>Schuh, M., Ellenberg, J. Cell. 130 (4), 484-484 (2007).</li>
<li>Backs, J., Stein, P., Backs, T. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (1), 81-81 (2010).</li>
<li>Schindler, K., Schultz, R. M. Biol Reprod. 80 (4), 795-795 (2009).</li>
<li>Kudo, N. R., Wassmann, K., Anger, M. Cell. 126 (1), 135-135 (2006).</li>
<li>Shoji, S., Yoshida, N., Amanai, M. The EMBO Journal. 25 (4), 834-834 (2006).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Microinjection של ביציות היא שיטה חזקה ללמוד המנגנונים המווסתים התבגרות meiotic 10,11, 12, 13. שיטה זו מספקת דרך חסכונית לבחון השערות לפני ביצוע ההשקעה הגדולה בפיתוח מודלים עכבר מהונדס ממוקד. אוסף הביצית וטכניקות microinjection דורשים זמן רב יותר מאשר הורים נהלים ביולוגיה אופייני התא. מכשולים ספציפיים עם אוסף לעיתים קרובות כוללים שליטה על פיפטה בפה, מושך את פיפטה זכוכית בגודל מתאים לאיסוף הפשטה של ​​תאים סומטיים והגדלת מהירות אוסף כדי לצמצם את הזמן שבו ביציות הן מחוץ לחממה. מומלץ לתרגל פעמים רבות לפני ביצוע הניסויים. העברת ביציות בין microdrops תוך שמירה על אותו מספר של תאים היא דרך מצוינת להיות נוח עם שיטה זו. מוות של תאים נפוצה בזמן למידה microinjection. זה יכול לקרות מכמה סיבות, כולל הזרקת גדול מדי של אמצעי אחסון של חומר (כלומר פתיחת מחט הזרקה גדול מדי), להכות את הגרעין עם מחט הזריקה, פירסינג הצד הנגדי של הביצית או שהחומר המוזרק רעיל הביצית. תרגול עם הזרקה לתוך ביציות חיץ עד שיעור ההישרדות שלך היא לפחות 50% היא המפתח שליטה בטכניקה זו. אם ביציות אינם בשלים סביר להניח כי milrinone לא מדולל מספיק. אנו ממליצים על שטיפת ביציות באמצעות טיפות גדולות רבות CZB milrinone חופשי לפני ההבשלה. Microinjection ploidy בעקבות הניתוח היא אחת מבחני רבים להעריך התבגרות meiotic. ניתוח שגרתי אחר אנו משתמשים במעבדה כוללים מעקב אחר קינטיקה שבאמצעותו התקדמות ביציות דרך המיוזה, immunofluorescence לנתח את היווצרות ציר ויישור כרומוזום והפעלה ביצה או הפריה חוץ גופית על מנת להעריך את ההשלכות התפתחותיות של מניפולציה הביצית 14,15, 16, 17.

טבלה של חומרים כימיים מסוימים: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> Milrinone </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> M4659 </td><td> Resuspend ב DMSO ב 2.5mm </td></tr><tr><td> שמן מינרלי </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> M5310 </td><td> השתמש רק עובר במבחן, סטרילי, מסונן </td></tr><tr><td> CREST autoserum </td><td> Immunovision </td><td> HCT-0100 </td><td></td></tr><tr><td> Sytox גרין </td><td> Invitrogen </td><td> 57020 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי אנושי אלקסה 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A-11014 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> וקטור מעבדות </td><td> H-100 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> Polysciences </td><td> 577773 </td><td></td></tr><tr><td> אלבומין בסרום שור מ </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> A3294 </td><td></td></tr><tr><td> PMSG </td><td> Calbiochem </td><td> 367222 </td><td></td></tr><tr><td> Monastrol </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> M8515 </td><td> Resuspend ב DMSO ב 100mm </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 274348 </td><td></td></tr><tr><td> TritonX-100 </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> X-100 </td><td></td></tr></tbody></table> טבלה של ציוד ספציפי: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם ציוד </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> פומית </td><td> Biodiseno </td><td> MP-001-Y </td><td></td></tr><tr><td> Watchglass </td><td> מיקרוסקופית אלקטרונים למדעים </td><td> 70543-30 </td><td></td></tr><tr><td> מזרק </td><td> BD </td><td> 309623 </td><td> 1ml, 27G 1 / 2 </td></tr><tr><td> 60 מ&quot;מ צלחת פטרי </td><td> בז </td><td> 351007 </td><td></td></tr><tr><td> זכוכית פסטר pipets </td><td> פישר מדעי </td><td> 13-678-200 </td><td></td></tr><tr><td> צד חם יותר </td><td> פישר מדעי </td><td></td><td> כל מודל סטנדרטי </td></tr><tr><td> Dissection מיקרוסקופ </td><td></td><td></td><td> כל מודל סטנדרטי </td></tr><tr><td> לשכת שקופיות </td><td> Nunc </td><td> 177372 </td><td></td></tr><tr><td> נימי Tubing </td><td> דראמונד </td><td> 1-000-0500 </td><td> microcaps </td></tr><tr><td> פיפטה פולר </td><td> Flaming-בראון micropipette חולץ </td><td></td><td> דגם P-97 </td></tr><tr><td> הפוך מיקרוסקופ </td><td> ניקון </td><td></td><td> כל מודל סטנדרטי </td></tr><tr><td> Micromanipulators </td><td> Eppendorf </td><td></td><td> כל מודל סטנדרטי </td></tr><tr><td> Picoinjector </td><td> הרווארד Apparatus </td><td> דגם PLI-100 </td><td> כל מודל סטנדרטי </td></tr><tr><td> CO 2 טנקים </td><td></td><td></td><td> עבור חממה </td></tr><tr><td> N2 טנק </td><td></td><td></td><td> עבור שולחן מזרק </td></tr><tr><td> נגד רעידות השולחן </td><td> טכני ייצור </td><td></td><td> כל מודל סטנדרטי </td></tr><tr><td> מדגרה </td><td></td><td></td><td> כל מודל סטנדרטי </td></tr><tr><td> אחזקות pipettes </td><td> Eppendorf </td><td> 930001015 </td><td> Vacutip </td></tr><tr><td> Confocal מיקרוסקופ </td><td> לייקה </td><td></td><td> כל מודל סטנדרטי </td></tr><tr><td> Dissection כלים </td><td> המדע כלים פיין </td><td></td><td> כל מודל סטנדרטי </td></tr><tr><td> Humidified קאמרית </td><td></td><td></td><td> אנו משתמשים טאפרוור </td></tr><tr><td> ליד צלחת 96 טוב </td><td> Nunc </td><td> 263339 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ שקופיות </td><td> פישר מדעי </td><td> 12-544-3 </td><td></td></tr><tr><td> Coverslips </td><td> תומאס מדעי </td><td> 6663-F10 </td><td> עובי ישתנו עבור מיקרוסקופים מסוים </td></tr><tr><td> מרכז תרבות איבר גם צלחת </td><td> פישר מדעי </td><td> 353037 </td><td> 60 X 15mm </td></tr></tbody></table>

הביצית microinjection עכבר, הבשלה ו ploidy הערכה

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

טעויות הפרדה כרומוזום להוביל תאים aneuploid. בתאים סומטיים, aneuploidy קשורה לסרטן אך הגמטות, aneuploidy מוביל, הפלות פוריות או הפרעות התפתחותיות כמו תסמונת דאון. הגמטות הפלואידים טופס באמצעות מינים ספציפיים תוכניות התפתחותיות, כי הם מצמידים את המיוזה. החלוקה meiotic הראשון (MI) היא ייחודית כי המיוזה chromatids אחותה להישאר מחובר בזמן כרומוזומים הומולוגיים הם נפרדים. מסיבות לא מובנות לגמרי, חלוקה זו reductional נוטה שגיאות הוא הנפוץ יותר את מקור aneuploidy מאשר טעויות מיוזה II (MII) או יותר טעויות 1,2 המיוזה זכר. אצל יונקים, ביציות מעצר בבית prophase אמ&quot;ן עם שלפוחית ​​גדולה נבטי שלם (GV; הגרעין) ורק קורות חיים המיוזה כאשר הם מקבלים רמזים הביוץ. לאחר המיוזה קורות חיים, ביציות MI שלם לעבור חלוקת התא סימטרית, לעצור שוב metaphase של MII. ביצים לא להשלים MII עד שהם מופרית על ידי הזרע. ביציות גם יכול לעבור התבגרות meiotic באמצעות הוקמה בשנת תנאים במבחנה תרבות 3. בגלל דור של מוטנטים עכבר מהונדס גנטי ו במיקוד יקר יכול לקחת פרקי זמן ארוכים, מניפולציה של גמטות נשים במבחנה היא אסטרטגיה חסכוני יותר חוסך זמן. כאן אנו מתארים שיטות לבודד prophase, נעצר ביציות מעכברים עבור microinjection. כל חומר הבחירה עשויה להיות מוחדר הביצית, אלא בגלל meiotically-המוסמכת ביציות שותקות transcriptionally Crna 4,5, ולא דנ&quot;א, חייב להיות מוזרק ללימודי ביטוי חוץ רחמי. כדי להעריך ploidy, אנו מתארים התנאים שלנו ב ההבשלה חוץ גופית של ביציות לביצים MII. מבחינה היסטורית, כרומוזום הפצת טכניקות המשמשות ספירת כרומוזום מספר 6. שיטה זו מאתגרת מבחינה טכנית מוגבלת רק לזיהוי hyperploidies. כאן אנו מתארים שיטה כדי לקבוע תת ו hyperploidies באמצעות ביצים שלמות 7-8. שיטה זו משתמשת monastrol, מעכב kinesin-5, אשר קורסת ציר דו קוטבית לתוך ציר monopolar 9 כרומוזומים ובכך להפריד כזה kinetochores אדם יכול בקלות להיות מזוהה וספר באמצעות נסיוב אנטי CREST אוטואימוניות. בגלל שיטה זו מבוצעת ביצים שלמות, הכרומוזומים לא הולכים לאיבוד בשל טעות של המפעיל.

ביציות נוטים aneuploidy בשל טעויות הפרדה כרומוזום במהלך ההבשלה meiotic. ביצים Aneuploid יכול לגרום לבעיות פוריות הפלות או הפרעות התפתחותיות כמו תסמונת דאון. כאן אנו מתארים שיטות להציג חומרים הבחירה לתוך ביציות ושיטות מחקר התבגרות meiotic ולהעריך ploidy.

הביצית Microinjection עכבר, הבשלה ו Ploidy הערכה

טעויות בהפרדת כרומוזומים מובילות לתאים אנאופלואידיים. בתאים סומטיים, אנאופלואידיות קשורה לסרטן, אך בגמטות, אנאופלואידיות מובילה ל...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להעריך את פריסת הכרומוזומים בביציות בשלב מטאפאזה II. לאחר מניפולציה ניסיונית, התחילו באיסוף של אווציטים בוגרים מנקבות עכבר בוגרות מינית שעברו priming. לאחר מכן, בצעו מיקרו-הזרקה של החומרים הנבחרים לאוציטים כדי להפר את החלבון הנחקר, והבשילו את האוציטים in vitro עד לשלב מטאפאזה של מיוזה II. לאחר מכן, עוררו פריסת כרומוזומים בביצית באמצעות טיפול ב-mantrole, הגורם להיווצרות של כישור מונופולרי.בסופו של דבר, תוצאות אלה יכולות לתאר את מצב הפלואידיות של הביצית באמצעות אימונופלואורסצנציה ומיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחומי הביולוגיה הרפרודוקטיבית וההפרדה הכרומוזומלית, כגון הבנת המנגנונים המולקולריים המובילים לאנאפזית. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן טכניקת ההזרקה המיקרוסקופית היא קשה ללמידה מכיוון שמספר שלבים קשים להעברה בכתב. בצעו הזרקה תוך-פריטונית לעכברים נקבות בוגרות מינית של 5 IU של הורמון גונדוטרופין סרומי מסוסים בהריון (PMSG) כדי למקסם את מספר הזקיקים האנטרליים המבודדים מכל עכבר.כ-48 שעות לאחר הטיפול המקדים ב-PMSG, חממו שלושה מיליליטרים של תווך איסוף לכל עכבר בטמפרטורה של 37 °C והמתינו להתאזנות. מיליליטר אחד של תווך תרבית למשך שעה אחת לפחות. הכינו מיקרו-טיפות מכל אחד מהם בתוך צלחת פטרי וכסו בשמן מינרלי.כעת הניחו את צלחת מצע התרבית באינקובטור ואת צלחת מצע האיסוף על מחמם שקופיות. הקריבו את העכבר, בצעו דיסקציה לשחלות והניחו אותן בתוך זכוכית שעון המכילה מצע איסוף שחומם מראש.באמצעות מזרק אינסולין של מיליליטר אחד, קבעו את השחלאות לצלחת ושחררו את הזקיקים האנטראליים על ידי דקירה חוזרת של מספר פעמים באמצעות מחטים בכיליבוב (gauge) 27 המחוברת זו לזו. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, אספו את קומפלקסי תאי הקומולוס באמצעות פיפטת זכוכית המופעלת באמצעות הפה. אספו רק זקיקים אנטראליים גדולים ולא זקיקים פרה-אנטראליים קטנים יותר או ציטות עירומות.העבירו את הקומפלקסים לטיפה מיקרוסקופית של מדיום איסוף מוכן באמצעות פיפטה קטנה הגדולה מעט מקוטר הביצית. הסירו את תאי הקומולוס מהקומפלקסים. העבירו את הביציות המנודות באמצעות פיפטה גדולה יותר לתוך טיפה מיקרוסקופית של מדיום תרבית.אפשרו לאוציטות להתאושש למשך שעה אחת לפחות באינקובטור לפני המניפולציה. הכינו פיפטות הזרקה על ידי מתיחה של צינוריות קפילריות מזכוכית בורו-סיליקט באמצעות מכשיר מתיחה מכני. הסירו את תא המצע משקופית בעלת תא בודד.ליצירת פלטפורמת מיקרו-הזרקה, הנח טיפה של 5 µL של תמיסת איסוף קרוב ככל האפשר לטיפה של 0.5 µL של חומר הזרקה מסוג SIR N-A-C-R-N-A או morph fo oligonucleotide; כסה בשמן מינרלי והנח עלבמת המיקרוסקופ. הכנס את פיפטות ההזרקה וההחזקה למחזיקים ומקם אותן בתוך טיפת תמיסת האיסוף. הפעל את מיכלי החנקן המחוברים למזרק הפיקו (pico injector) ולשולחן אנטי-ויברציה.פתחו את קצה פיפטת ההזרקה על ידי הקשה עדינה שלה כנגד פיפטת ההחזקה בזמן מילויה במדיום. העבירו חמישה עד 10 אתרים מהאינקובטור אל טיפת מדיום האיסוף שעל הפלטפורמה. כעת הגדירו את הפרמטרים של הפיקו-אינג'קטור לנפח הזרקה של 5 עד 10 picoliters תוך לחיצה על clear.העבירו את מחט ההזרקה אל טיפת החומר ומלאו אותה. החזירו אותה אל טיפת המצע. השתמשו בפיפט ההחזקה כדי ללכוד ביצית ויישרו את מחט ההזרקה, הביצית ופיפט ההחזקה לאורך ציר ה-x.תחת הגדלה גבוהה יותר, העבירו את פיפטת ההזרקה דרך האוציט, תוך הקפדה להימנע מהגרעין. לאחר חדירה של קרום הפלזמה, לחצו על inject; לאחר ההזרקה, הוציאו את המחט, שחררו את האוציט וחזרו על הפעולה. ברגע שכל האוציטים הוזרקו, החזירו אותם לאינקובטור לגידול במצע תרבית למשך הזמן הרצוי, אשר בדרך כלל נע בין 12 ל-24 שעות.לאחר מכן, שטפו את התאים דרך מספר טיפות של CZB והעבירו אותם לטיפה מיקרוסקופית של CZB תחת שמן, והדגירו למשך 16 שעות להשלמת ההבשלה למטפאזה של המיוזה השנייה. העבירו 750 µL של CZB המכיל 100 µM Mastri לבאר של צלחת תרבית איברים שבטבעת החיצונית שלה יש מים. כעת שטפו את הביציות דרך מספר טיפות של CZB בתוספת mastri, ולאחר מכן העבירו אותן לצלחת תרבית האיברים והדגירו למשך שעה.קבעו את הביצים בתוך פטריאת שעון המכילה 2% paraform aldehyde ב-PBS למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, העבירו את הביצים לתמיסת חסימה ושמרו בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד להפיכת הביצים לחדירות למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו בכמה נפחים גדולים של תמיסת חסימה.בצע את המשך הפרוצדורה על מכסה של פלטת 96 בארות, המוגנת מאור בתוך תא לח. בטמפרטורת החדר, העבר את הביציות לטיפות של 25 µL של תמיסת חסימה למשך 15 דקות. לאחר מכן, כדי לסמן את הצנטרומרים, העבר את הביציות לטיפת תמיסת חסימה המכילה Crest Antiserum בדילול של 1:40, והדגש למשך שעה אחת לפחות.לאחר מכן, שטפו באמצעות שלוש טיפות של תמיססת חסימה, תוך דגירה למשך 15 דקות בכל טיפה. העבירו את הביצים לטיפה של תמיססת חסימה המכילה נוגדן מצומד ל-fluoro four ודגרו למשך שעה אחת. שטפו פעמיים בתמיססת חסימה כדי לזהות את הכרומוזומים.דגרו בדילול של 1:5,000 של cytx green ופתרון חסימה (blocking solution), והעבירו את הדגימות לכיסית עם 5 µL של vector shield. הניחו ארבע נקודות קטנות של וזלין במיקומי הפינות המיועדות של זכוכית הכיסוי כדי למנוע מעיכה של הביצים. הניחו את זכוכית הכיסוי ואטמו עם לק ציפורניים; אחסנו בקופסת שקופיות בטמפרטורה של 4 °C עד לעיבוד באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. בעת הדמיה עם עדשה של 100x, צלמו בצעדים של 0.4 µm במישור Z והדמירו את כל אזור המטפאזה. ספרו את הסנטרומרים באמצעות תוכנת הדמיה כגון Image J מה-NIH. ביצים של עכברים אופלואידיים מכילות 20 זוגות של קינטוכורים, המעניקים 40 נקודות בסך הכל בהטלה זו של מישור Z של ביצה בשלב מטפאזה II אופלואידית. ה-DNA צבוע בירוק והקינטוכורים צבועים באדום.החיצים מצביעים על שתי זרועות כרומטידיות נפרדות המעידות על חפיפה בקנטיקור מספר 17 ובמספר 18, לאחר הליך המיקרו-הזרקה. ניתן לבצע שיטות נוספות כגון Western blotting, real-time PCR, הערכות של תצורת כישור המיטוטי ויישור כרומוזומים, והפריה חוץ-גופית (in vitro fertilization) כדי לענות על שאלות נוספות, כגון כיצד הפרעה לחלבון הנחקר משפיעה על הבשלת המבנה המיוטי ועל הפוטנציאל ההתפתחותי. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לmanipulate אתרים שונים ולהעריך PLO של מטאפאזה 2.

mouse-oocyte-microinjection-maturation-and-ploidy-assessment

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לדלדול mRNA ספציפי בתיווך siRNA אחרי ניתוח immunofluorescence להעריך הרכבה ציר meiotic וארגון בביציות עכבר. פרוטוקול זה מתאים לדלדול במבחנה של תמלילים והערכה תפקודית של ציר שונה ו / או גורמים הקשורים MTOC בביציות.

Meiotic ציר ההערכה בעכבר ביציות על ידי השתקה בתיווך siRNA

כאן, אנו מציגים עבור הערכה בלתי פולשני של מיומנות התפתחותית oocyte שבוצעה במהלך שלהם במבחנה ההבשלה של שלפוחית germinal לשלב השני מפה של פרוטוקול. שיטה זו משלבת הדמיה בצילום מואץ עם חלקיקים תמונה velocimetry (PIV) וניתוחים רשת עצבית.

מזהה מבוססי-רשת עצבית של Oocytes וחוה עכבר נכה כשיר או לא מוכשר

Oogenesis ביונקים ידוע להיות מועדת לטעויות, במיוחד עקב כרומוזום missegregation. כתב יד זה מתאר שיטות הכנה כרומטין להפיץ prophase העכבר, מפה של אני, oocytes ביים השני. טכניקות יסוד אלה מאפשרים לימוד חלבוני כרומטין מכורך כרומוזום מורפולוגיה ברחבי oogenesis יונקים.

כרומטין להפיץ את ההכנות לניתוח של העכבר Oocyte התקדמות מן Prophase כדי מפה של השני

גרסאות גנטי המשויכים מחלות אנושיות מתחילים להיות חשפו, זה הופך יותר ויותר חשוב לפתח מערכות אשר במהירות והערכת החשיבות הביולוגית של משתנים אלה שזוהו. פרוטוקול זה מתאר שיטות להערכת תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה הנשי אני משתמש בעכבר oocytes.

באמצעות העכבר Oocytes כדי להעריך תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה אני

אנו מספקים מיתאר של הפרוטוקול הקליני להערכת לא פולשנית של בגרות ביצה אנושית באמצעות מיקרוסקופ אור מקוטב.

הערכה לפירעון ביצת אנוש ויישומו הקליני

מוצג פרוטוקול אופטימלי המאפשר דלדול של מרכזי ארגון מיקרוטובולים ציטופלסמיים בביציות עכבר במהלך מטאפאזה I באמצעות לייזר פמטו-שניות כמעט אינפרה-אדום.

אבלציה בלייזר רב-פוטונים של מרכזי ארגון מיקרוטובולים ציטופלסמיים בביציות עכבר

שגיאה בהפרדת כרומוזומים היא תכונה נפוצה בביציות. לכן, חקר מחסום הרכבת הציר נותן רמזים חשובים על המנגנונים הדרושים לייצור ביצים בריאות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שלוש בדיקות משלימות להערכת שלמות מחסום הרכבת ציר בביציות עכבר.

הערכת שלמות מחסום הרכבת הציר בביציות עכבר

פרוטוקול זה מספק מסגרת ניסויית לתיעוד ההשפעה הפיזית של השלד הציטו-שלד על הצורה הגרעינית ועל האברונים חסרי הקרום הפנימי במערכת הביציות של העכבר. ניתן להתאים את המסגרת לשימוש בסוגי תאים ובהקשרים אחרים.

לכידת תסיסה מבוססת שלד של גרעין ביצית העכבר על פני קני מידה מרחביים

שגיאות מיוטיות בסינפסות ורקומבינציה נפוצות בביציות של יונקים. ניתוח קפדני של חלבונים המעורבים בתהליכים אלה חיוני להבנה כיצד ומדוע ביציות משתבשות לעתים קרובות. הטכניקות המוצגות כאן מאפשרות ניטור מקיף של רקומבינציה וסינפסות כדי להעריך את איכות הביציות בעכברים.

הכנת התפשטות כרומוזומים מיוטיים מביציות עכבר להערכת סינפסה ורקומבינציה

פרוטוקול זה מתאר הליכים לבשלות חוץ-גופית של ביציות עכברים, הפריה חוץ-גופית , ותרבות עוברים לשלב הבלסטוציסט.

ביציות עכברים בבגרות במבחנה, הפריה ותרבות עוברים לפני ההשתלה

למד מיקרו-הזרקה לתאי ביצית עכבר והערכת פלואידיות בביציות מטאפזה II. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני הפרדת כרומוזומים בביולוגיה רפרודוקטיבית ובהבנת עקרות פוריות.

הביצית Microinjection עכבר, הבשלה ו Ploidy הערכה

גלה סרטונים נוספים