הביצית Microinjection עכבר, הבשלה ו Ploidy הערכה

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להעריך את פריסת הכרומוזומים בביציות בשלב מטאפאזה II. לאחר מניפולציה ניסיונית, התחילו באיסוף של אווציטים בוגרים מנקבות עכבר בוגרות מינית שעברו priming. לאחר מכן, בצעו מיקרו-הזרקה של החומרים הנבחרים לאוציטים כדי להפר את החלבון הנחקר, והבשילו את האוציטים in vitro עד לשלב מטאפאזה של מיוזה II. לאחר מכן, עוררו פריסת כרומוזומים בביצית באמצעות טיפול ב-mantrole, הגורם להיווצרות של כישור מונופולרי.

בסופו של דבר, תוצאות אלה יכולות לתאר את מצב הפלואידיות של הביצית באמצעות אימונופלואורסצנציה ומיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחומי הביולוגיה הרפרודוקטיבית וההפרדה הכרומוזומלית, כגון הבנת המנגנונים המולקולריים המובילים לאנאפזית. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן טכניקת ההזרקה המיקרוסקופית היא קשה ללמידה מכיוון שמספר שלבים קשים להעברה בכתב. בצעו הזרקה תוך-פריטונית לעכברים נקבות בוגרות מינית של 5 IU של הורמון גונדוטרופין סרומי מסוסים בהריון (PMSG) כדי למקסם את מספר הזקיקים האנטרליים המבודדים מכל עכבר.

כ-48 שעות לאחר הטיפול המקדים ב-PMSG, חממו שלושה מיליליטרים של תווך איסוף לכל עכבר בטמפרטורה של 37 °C והמתינו להתאזנות. מיליליטר אחד של תווך תרבית למשך שעה אחת לפחות. הכינו מיקרו-טיפות מכל אחד מהם בתוך צלחת פטרי וכסו בשמן מינרלי.

כעת הניחו את צלחת מצע התרבית באינקובטור ואת צלחת מצע האיסוף על מחמם שקופיות. הקריבו את העכבר, בצעו דיסקציה לשחלות והניחו אותן בתוך זכוכית שעון המכילה מצע איסוף שחומם מראש.

באמצעות מזרק אינסולין של מיליליטר אחד, קבעו את השחלאות לצלחת ושחררו את הזקיקים האנטראליים על ידי דקירה חוזרת של מספר פעמים באמצעות מחטים בכיליבוב (gauge) 27 המחוברת זו לזו. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, אספו את קומפלקסי תאי הקומולוס באמצעות פיפטת זכוכית המופעלת באמצעות הפה. אספו רק זקיקים אנטראליים גדולים ולא זקיקים פרה-אנטראליים קטנים יותר או ציטות עירומות.

העבירו את הקומפלקסים לטיפה מיקרוסקופית של מדיום איסוף מוכן באמצעות פיפטה קטנה הגדולה מעט מקוטר הביצית. הסירו את תאי הקומולוס מהקומפלקסים. העבירו את הביציות המנודות באמצעות פיפטה גדולה יותר לתוך טיפה מיקרוסקופית של מדיום תרבית.

אפשרו לאוציטות להתאושש למשך שעה אחת לפחות באינקובטור לפני המניפולציה. הכינו פיפטות הזרקה על ידי מתיחה של צינוריות קפילריות מזכוכית בורו-סיליקט באמצעות מכשיר מתיחה מכני. הסירו את תא המצע משקופית בעלת תא בודד.

ליצירת פלטפורמת מיקרו-הזרקה, הנח טיפה של 5 µL של תמיסת איסוף קרוב ככל האפשר לטיפה של 0.5 µL של חומר הזרקה מסוג SIR N-A-C-R-N-A או morph fo oligonucleotide; כסה בשמן מינרלי והנח עלבמת המיקרוסקופ. הכנס את פיפטות ההזרקה וההחזקה למחזיקים ומקם אותן בתוך טיפת תמיסת האיסוף. הפעל את מיכלי החנקן המחוברים למזרק הפיקו (pico injector) ולשולחן אנטי-ויברציה.

פתחו את קצה פיפטת ההזרקה על ידי הקשה עדינה שלה כנגד פיפטת ההחזקה בזמן מילויה במדיום. העבירו חמישה עד 10 אתרים מהאינקובטור אל טיפת מדיום האיסוף שעל הפלטפורמה. כעת הגדירו את הפרמטרים של הפיקו-אינג'קטור לנפח הזרקה של 5 עד 10 picoliters תוך לחיצה על clear.

העבירו את מחט ההזרקה אל טיפת החומר ומלאו אותה. החזירו אותה אל טיפת המצע. השתמשו בפיפט ההחזקה כדי ללכוד ביצית ויישרו את מחט ההזרקה, הביצית ופיפט ההחזקה לאורך ציר ה-x.

תחת הגדלה גבוהה יותר, העבירו את פיפטת ההזרקה דרך האוציט, תוך הקפדה להימנע מהגרעין. לאחר חדירה של קרום הפלזמה, לחצו על inject; לאחר ההזרקה, הוציאו את המחט, שחררו את האוציט וחזרו על הפעולה. ברגע שכל האוציטים הוזרקו, החזירו אותם לאינקובטור לגידול במצע תרבית למשך הזמן הרצוי, אשר בדרך כלל נע בין 12 ל-24 שעות.

לאחר מכן, שטפו את התאים דרך מספר טיפות של CZB והעבירו אותם לטיפה מיקרוסקופית של CZB תחת שמן, והדגירו למשך 16 שעות להשלמת ההבשלה למטפאזה של המיוזה השנייה. העבירו 750 µL של CZB המכיל 100 µM Mastri לבאר של צלחת תרבית איברים שבטבעת החיצונית שלה יש מים. כעת שטפו את הביציות דרך מספר טיפות של CZB בתוספת mastri, ולאחר מכן העבירו אותן לצלחת תרבית האיברים והדגירו למשך שעה.

קבעו את הביצים בתוך פטריאת שעון המכילה 2% paraform aldehyde ב-PBS למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, העבירו את הביצים לתמיסת חסימה ושמרו בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד להפיכת הביצים לחדירות למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו בכמה נפחים גדולים של תמיסת חסימה.

בצע את המשך הפרוצדורה על מכסה של פלטת 96 בארות, המוגנת מאור בתוך תא לח. בטמפרטורת החדר, העבר את הביציות לטיפות של 25 µL של תמיסת חסימה למשך 15 דקות. לאחר מכן, כדי לסמן את הצנטרומרים, העבר את הביציות לטיפת תמיסת חסימה המכילה Crest Antiserum בדילול של 1:40, והדגש למשך שעה אחת לפחות.

לאחר מכן, שטפו באמצעות שלוש טיפות של תמיססת חסימה, תוך דגירה למשך 15 דקות בכל טיפה. העבירו את הביצים לטיפה של תמיססת חסימה המכילה נוגדן מצומד ל-fluoro four ודגרו למשך שעה אחת. שטפו פעמיים בתמיססת חסימה כדי לזהות את הכרומוזומים.

דגרו בדילול של 1:5,000 של cytx green ופתרון חסימה (blocking solution), והעבירו את הדגימות לכיסית עם 5 µL של vector shield. הניחו ארבע נקודות קטנות של וזלין במיקומי הפינות המיועדות של זכוכית הכיסוי כדי למנוע מעיכה של הביצים. הניחו את זכוכית הכיסוי ואטמו עם לק ציפורניים; אחסנו בקופסת שקופיות בטמפרטורה של 4 °C עד לעיבוד באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. בעת הדמיה עם עדשה של 100x, צלמו בצעדים של 0.4 µm במישור Z והדמירו את כל אזור המטפאזה. ספרו את הסנטרומרים באמצעות תוכנת הדמיה כגון Image J מה-NIH. ביצים של עכברים אופלואידיים מכילות 20 זוגות של קינטוכורים, המעניקים 40 נקודות בסך הכל בהטלה זו של מישור Z של ביצה בשלב מטפאזה II אופלואידית. ה-DNA צבוע בירוק והקינטוכורים צבועים באדום.

החיצים מצביעים על שתי זרועות כרומטידיות נפרדות המעידות על חפיפה בקנטיקור מספר 17 ובמספר 18, לאחר הליך המיקרו-הזרקה. ניתן לבצע שיטות נוספות כגון Western blotting, real-time PCR, הערכות של תצורת כישור המיטוטי ויישור כרומוזומים, והפריה חוץ-גופית (in vitro fertilization) כדי לענות על שאלות נוספות, כגון כיצד הפרעה לחלבון הנחקר משפיעה על הבשלת המבנה המיוטי ועל הפוטנציאל ההתפתחותי. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לmanipulate אתרים שונים ולהעריך PLO של מטאפאזה 2.