אחד תסיסנית אומטידיום Dissection והדמיה
19 באוגוסט 2011
הגורם המגביל בשימוש של המבוגר תסיסנית עין ללמוד ניוון מוחיים, ביולוגיה של התא הוא קשה הדמיה של תהליכים תאיים. אנו מתארים את דיסקציה של האומטידיה בודד כדי ליצור בתום-בתום תא ראשוני תרבות העצבית, אשר יכול להיות נושא לטיפול תרופתי והדמיה מתקדמים.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבצע נתיחה והדמיה של זבוב דרוזופילה (drosophila) או זבוב מטיה (matia) בודד, כדי ללמוד על אירועים תוך-תאיים במודלים של ניוון עצבי. דבר זה מושג תחילה על ידי הפרדת ראש הזבוב משאר הגוף וחתיכתו לפתיחה.
בשלב הבא מוציאים את המוח ורקמות אחרות מתוך הראש. לאחר מכן מסירים את הקוטיקולה וחוצים כל רשתית לשני חלקים. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא גילוף ה-O באמצעות מחט טנגסטן והנחתם על עלית.
בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות אברוני אוטופגיה ציטופלזמיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית פלואורסצנטית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת אנליזה ביולוגית של תאים ברזולוציה גבוהה במודלים של דרוזופילא (drosophila) לניוון עצבי, אשר עד כה יכלו להעניק תובנות גנטיות בלבד בתחום זה, ובכך היא מדגימה כי הפרוצדורה תהיה משתנה. סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי, בסיועו של דניאל מקיי, טכנאי היסטולוגיה ומיקרוסקופיה במרכז.
כדי להתחיל, מלאו באבקת פוספט בופר סלין (PBS) באר אחת של סלייד זכוכית בעל שלוש בארות, ולאחר מכן הרדימו את הזבובים באמצעות פחמן דו-חמצני. לאחר שהזבובים הורדמו, העבירו זבוב בודד באמצעות פינצטה והניחו אותו בתוך הכלי הקטן עם ה-PBS. תחת מיקרוסקופ דיססקציה, תפסו את החרטום בעזרת פינצטה ולאחר מכן הפרידו את הראש מהגוף על ידי חיתוך הצוואר.
באמצעות סט שני של פינצטות המחזיקות את ראש הזבוב מהחרטום, חתוך את הראש לחצי לאורך קו האמצע הרוסטראלי-לטרלי בעזרת מיקרו-מספריים. כדי לחשוף את המוח, השתמש בקצה של פיפטה חתוכה כדי להרים את הראש, הצמד רשת וסהשב לתוך באר אחרת מלאה במדיום שניידר (Schneider medium). קלף את רוב קוטיקולת הראש בעזרת פינצטות, ולאחר מכן הוצא את המוח.
שמרו על הרשתית כלואה בין הלמינה לקרנית. לאחר מכן, העבירו את הרשתית לטיפה של 50 µL של מצע שניידר (Schneider medium) טרי. כאשר הרשתית מונחת ישירות על תזריזית זכוכית, אחזו בקצה הדורסלי או הוונטרלי ביותר של הרשתית באמצעות פינצטה והשתמשו במספרי מיקרו.
גזרו את הרשתית לשניים לאורך קו האמצע הגבי-בטני (dorsal ventral midline) כדי לחשוף את ה-AMIA במרכז העין. המשיכו להחזיק את הרשתית כך שהקרנית פונה כלפי מטה והלמינה פונה כלפי מעלה. באמצעות מחט טונגסטן דקה, הפרידו תחילה את ה-oia מהלמינה ולאחר מכן מהקרנית.
תאי OIA בודדים וקבוצות של OIA ישקעו לתחתית הבאר או השקופית. יש להסיר כל גוש גדול יותר שייתכן שהצטבר לפני ההמשך. כדי לנתח אוטופגיה, יש לדלל LysoTracker ביחס של 1:1000 בטיפה של מצע Schneider, לערבב ולהמתין 10 שניות.
הסר את עודפי הנוזל מהזכוכית. הקפד להשאיר את ה-AMIA במקומה. הוסף טיפה של vector shield כדי לכסות את ה-amia.
יש להניח כיסוי, זזית (slip) ולאטום בעזרת לק ציפורניים. באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, ניתן להדגים פגוזומים המסומנים ב-GFP-Atg8 וליזוזומים המסומנים ב-LysoTracker בתוך טרכיאה (tedium) בודדת שחולצה מזבוב המבטא צורה מוטנטית של atropin. פאנל השדה המואר (brightfield) בפינה הימנית העליונה מציג את המבנה הכמעט שלם של הטרכיאה, והמסגרת מציינת את השטח שנסרק. כאן, צבע אדום מסמן את הליזוזומים וצבע ירוק מסמן את האוטופגוזום.
האוטוליזוזומים, הנובעים מהיתוך של שני הארגנאלים, מופיעים בצבע צהוב. בעקבות הליכים אלו, ניתן לבצע שיטות נוספות כגון תרבית של חומרים ומתן תרופות כדי לענות על שאלות שונות, כגון זיהוי תרכובים יעילים המשפיעים על סימני האוטופגיה בתאים עצביים בעל רקע גנטי שונה.
שילוב היתרונות של הגנטיקה של הדרוסופילה עם ניתוחים ביולוגיים-תאיים מתקדמים שניתן לבצע בתרבית תאים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר הליך לניתוח והדמיה של אומטידיות (ommatidia) בודדות של Drosophila במטרה לחקור אירועים תוך-תאיים במודלים של ניוון עצבי. שיטה זו מאפשרת יצירת תרביות ראשוניות של תאי עצב שניתן להחשיפן לטיפול תרופתי ולטכניקות הדמיה מתקדמות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- ניורודגנרציה
רקע
- דימוי של תהליכים תוך-תאיים ב-Drosophila בוגרת הוא מאתגר.
- דיסקציה של אומאטידיות בודדות מספקת פתרון לחקר מנגנונים תאיים.
- תרביות עצביות ראשוניות מאפשרות טיפול תרופתי ודימוי מתקדם.
- גישה זו משפרת את ההבנה של ניוון עצבי.
מטרת המחקר
- לביצוע דיסקציה של אומטידיה של Drosophila לצורך אנליזה תאית.
- להקל על הדמיה של אירועים תוך-תאיים.
- ליצירת פלטפורמה למחקרי טיפול תרופתי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- חברו את ראש הזבוב וחתכו אותו כדי לפתוח אותו.
- הסִירו את המוח ורקמות פנימיות אחרות.
- חתכו את הרשתית לשניים לאחר הסרת הקוטיקולה.
- חלצו את האומטידיה באמצעות מחט טונגסטן והניחו אותן על זכוכית מיקרוסקופ.
תוצאות עיקריות
- ביצוע מוצלח של דיסקציה של אומטידיה בודדות.
- הקמה של תרביות תאים עצביים ראשוניות אותנטיות.
- יכולת ביצוע טיפולים תרופתיים בתאים מתורבתים.
- יישום טכניקות דימוי מתקדמות לחקר תהליכים תוך-תאיים.
מסקנות
- השיטה מספקת כלי בעל ערך לחקר של ניוון עצבי.
- דיסקציה של אומטידיות בודדות משפרת את יכולות הדימיון התאי.
- גישה זו עשויה להוביל לתובנות חדשות בביולוגיה של מערכת העצבים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דיסקציה והדמיה של ommatidium בודד ב-Drosophila מאפשרות ניתוח ברזולוציה גבוהה של אירועים תוך-תאיים הרלוונטיים לניו روندגנרציה (ניוון עצבי), ובכך הן מתגברות על מגבלות האוטופלורסצנציה של העין כולה. טכניקה זו תומכת בהסרה של סיכונים מכניסטיים ובתיקוף מטרות בשלבי הגילוי המוקדמים, על ידי מתן אפשרות לוויזואליזציה ישירה של תהליכי אוטופגיה ותגובות לתרופות בתאים עצביים המוגדרים גנטית. יכולת ההתאמה שלה להדמיה חיה ולהגשת תרכובות ממצבת אותה כפלטפורמה רב-פעמית עבור תהליכי מחקר בניו روندגנרציה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה ישירה של אוטופגיה ותעבורה תוך-תאית בתאי עצב הרלוונטיים למחלה.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרה באמצעות ויזואליזציה של תגובות סוב-סלולריות להפרעות גנטיות או פרמקולוגיות.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי הבחנה בין השפעות אוטונומיות של תאים ברקעים גנטיים פסיפסים (mosaic).
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מערכת ex vivo מתוקשפת לדימות כמותי של סממנים אוטופגיים וליזוזומליים.
- מאפשר הכנה שחזורית של דגימות תאים בודדים לבדיקה סטנדרטית של תרכובות.
- תומך ביכולת הרחבה של הבדיקה (scalability) ובשימוש חוזר בפלטפורמה לסריקת חומרים המשנים ניוון עצבי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם נתיבים רלוונטיים למחלה על ידי מידול של תפקוד לקוי של האוטופגיה במערכת ניתנת לטיפול גנטי.
- מאפשר רציפות משלב הגילוי הגנטי ועד להערכה פרה-קלינית של תרכובות בתאי עצב.
- תומך בהתקדמות מותאמת סיכונים על ידי אספקת מדדים תאיים ניבויים עבור מטרות של ניוון עצבי.
שילוב תהליכים וזרימת עבודה
שיטה זו מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים למחקר הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לבדיקה מבוססת-השערות של מנגנונים תוך-תאיים והשפעות של תרכובות בהקשר עצבי מוגדר גנטית.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי מסלולי אוטופגיה וניוון עצבי באומטידיה בודדות.
- סריקה: מספק פלטי דימות כמותיים וניתנים לשחזור להערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספק מדידות מבוססות מיקרוסקופיה קונפוקלית של אוטופגוזומים, ליזוזומים ותוצרי ההיתוך שלהם.
- מחקר תרגומי: מסייע בהתאמת פנוטיפים תאיים למודלים של מחלות ולפיתוח סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה מודולרית הניתנת להתאמה לרקעים גנטיים שונים ולספריות תרכובות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות ובמחקרים מכניסטיים של ניוון עצבי.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של תהליכי דיסקציה והדמיה של תא בודד לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: משפר קבלת החלטות מסוג go/no-go על ידי אספקת ראיות תאיות ישירות למעורבות המטרה וליעילות התרכובת.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעודוף מותאם סיכונים של מטרות ניוון עצבי ומועמדים טיפוליים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות של דיסקציה של Drosophila ודימוי קונפוקאלי.
- נחוש גישה לתשתית של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ותרביות תאים.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית עבור פרוטוקולים של הכנת דגימות ודימוי.
- ניתן להתאמה לרקעים גנטיים שונים באמצעות טכניקות של ניתוח פסיפס (mosaic analysis).
- מוגבל לניתוח ex vivo; ייתכן שיידרש תיקוף in vivo לצורך רצף תרגומי.
