אחד תסיסנית אומטידיום Dissection והדמיה
August 19th, 2011
הגורם המגביל בשימוש של המבוגר תסיסנית עין ללמוד ניוון מוחיים, ביולוגיה של התא הוא קשה הדמיה של תהליכים תאיים. אנו מתארים את דיסקציה של האומטידיה בודד כדי ליצור בתום-בתום תא ראשוני תרבות העצבית, אשר יכול להיות נושא לטיפול תרופתי והדמיה מתקדמים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לנתח ולדמות דרוזופילה בודדת או מאטיה כדי לחקור אירועים תוך-תאיים. במודלים של ניוון עצבי. זה מושג על ידי חיבור ראש הזבוב משאר הגוף וחיתוך שלו.
לאחר מכן, המוח ורקמות אחרות מוסרים מתוך הראש. לאחר מכן מסירים את הקוטיקולה וכל רשתית נחתכת לשניים. השלב האחרון של ההליך הוא לגלף את ה-O עם מחט טונגסטן ולהפקיד אותם על מגלשה.
בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות אברונים אוטופאגיים ציטופלזמיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית פלואורסצנטית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת ניתוח ביולוגי של תאים ברזולוציה גבוהה במודלים של דרוזופילה לניוון עצבי, שעד כה יכלו להציע רק תובנות גנטיות בתחום זה, מה שמדגים שההליך יהיה משתנה. סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי בעזרתו של דניאל מקיי, טכנאי היסטולוגיה ומיקרוסקופיה במרכז.
כדי להתחיל, מלאו באר אחת של מגלשת זכוכית של שלוש בארות במי מלח חוצצים פוספט, ואז הרדימו את הזבובים בפחמן דו חמצני. לאחר הרדמת הזבובים, הרימו זבוב בודד באמצעות מלקחיים והשליכו אותו לתוך הצלחת הקטנה של PBS. תחת טווח ניתוח, צבט את החרטום בעזרת מלקחיים ולאחר מכן נתק את הראש מהגוף על ידי חיתוך הצוואר.
בעזרת סט שני של מלקחיים המחזיקים את ראש הזבוב מהחרטום, חתכו את הראש לשניים לאורך קו האמצע הרוסטרלי הרוחבי בעזרת מספריים מיקרו. כדי לחשוף את המוח, השתמש בקצה פיפטה חתוך כדי להרים את הראש ולחבר את הרשתית ולהעביר לבאר אחרת מלאה במדיום שניידר. קלף את רוב ציפורן הראש בעזרת מלקחיים, ולאחר מכן הסר את המוח.
שמור את הרשתית דחוקה בין הלמינה לקרנית. לאחר מכן, העבירו את הרשתית לטיפה של 50 מיקרוליטר של מדיום שניידר טרי. מונח ישירות על מגלשת זכוכית, אחוז בקצה הגבי או הגחוני ביותר של הרשתית בעזרת מלקחיים באמצעות מספריים מיקרו
.חותכים את הרשתית לשניים לאורך קו האמצע הגחוני הגבי כדי לחשוף את ה-AMIA באמצע העין. המשך לתפוס את הרשתית כך שהקרנית פונה כלפי מטה והלמינה פונה כלפי מעלה. בעזרת מחט טונגסטן עדינה, נתק את האויה תחילה מהלמינה ולאחר מכן מהקרנית.
OIA בודד וקבוצות של OIA ייאספו בתחתית הבאר או המגלשה. הסר כל נשימה גדולה יותר שאולי הצטברה לפני שתמשיך. כדי לנתח אוטופגיה יש לדלל את גשש Lito ל-1 עד 1000 בטיפה של תערובת בינונית של שניידר ולהמתין 10 שניות.
הסר את עודפי הנוזלים מהשקופית. הקפידו להשאיר את ה-AMIA מאחור. הוסף טיפה של מגן וקטורי כדי לכסות את האמיה.
מרחו כיסוי, החליקו ואטמו עם לק באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, ניתן לדמיין את שני הפגוזומים המסומנים ב-g fp a TG eight ואת הליזוזומים המסומנים על ידי lyo Tracker בשעמום יחיד שנותח מזבוב המבטא צורה מוטנטית של אטרופין. לוח השדה הבהיר בפינה השמאלית העליונה מציג את המבנה הכמעט שלם של השעמום, והמסגרת מציינת את האזור הסרוק. כאן, אדום מסמן את הליזוזומים וירוק מסמן את האוטופאגוזום.
הליזוזומים האוטומטיים, הנובעים ממיזוג שני האברונים נראים צהובים. בעקבות הליכים אלה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו תרבית חומר ומתן תרופות כדי לענות על שאלות שונות. כמו התרכובות היעילות על דגלי האוטופגיה בתאי עצב מרקע גנטי שונה.
שילוב היתרונות של גנטיקה של דרוזופילה עם ניתוח ביולוגי מתקדם של תאים אפשרי בתרבית תאים.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מאמר זה מתאר נוהל לנתח ולהדמיה ommatidia יחיד של Drosophila לחקר אירועים תוך-תאיים במודלי ניוון עצבי. השיטה מאפשרת יצירת תרבויות תאים עצביים ראשוניות שניתן לטפל בהן בתרופות ולעבור טכניקות הדמיה מתקדמות.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי העצב
- ביולוגיה תאית
- ניוון עצבי
רקע
- הדמיה של תהליכים תוך-תאיים ב-Drosophila בוגרת היא מאתגרת.
- ניתוח ommatidia יחיד מספק פתרון לחקר מנגנונים תאיים.
- תרבויות עצביות ראשוניות מאפשרות טיפול בתרופות והדמיה מתקדמת.
- גישה זו משפרת את ההבנה של ניוון עצבי.
מטרת המחקר
- לנתח ommatidia של Drosophila לניתוח תאי.
- לאפשר הדמיה של אירועים תוך-תאיים.
- ליצור פלטפורמה למחקרים בטיפול בתרופות.
שיטות בשימוש
- חיבור ראש הזבוב וחיתוך שלו.
- הסרת המוח ורקמות פנימיות אחרות.
- חיתוך הרשתית לשניים לאחר הסרת הגופיף.
- גילוף הommatidia עם מחט טונגסטן והנחתם על שקופית.
תוצאות עיקריות
- ניתוח מוצלח של ommatidia יחיד.
- יצירת תרבויות תאים עצביים ראשוניות אמיתיות.
- יכולת לבצע טיפולים בתרופות על תאים מתורבתים.
- שימוש בטכניקות הדמיה מתקדמות לחקר תהליכים תוך-תאיים.
מסקנות
- השיטה מספקת כלי חשוב לחקר ניוון עצבי.
- ניתוח ommatidia יחיד משפר את יכולות ההדמיה התאית.
- גישה זו יכולה להוביל לתובנות חדשות בנוירוביולוגיה.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Single ommatidium dissection and imaging in Drosophila enables high-resolution analysis of intracellular events relevant to neurodegeneration, overcoming limitations of whole-eye autofluorescence. This technique supports mechanistic de-risking and target validation in early discovery by allowing direct visualization of autophagic processes and drug responses in genetically defined neuronal cells. Its adaptability for live imaging and compound administration positions it as a reusable platform for neurodegeneration research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of autophagy and intracellular trafficking in disease-relevant neuronal cells.
- Supports functional target validation by visualizing subcellular responses to genetic or pharmacological perturbations.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing cell-autonomous effects in mosaic genetic backgrounds.
Screening & Assay Development
- Provides a validated ex vivo system for quantitative imaging of autophagic and lysosomal markers.
- Enables reproducible preparation of single-cell samples for standardized compound testing.
- Supports assay scalability and platform reuse for screening neurodegeneration-modifying agents.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant pathways by modeling autophagic dysfunction in a genetically tractable system.
- Enables continuity from genetic discovery to preclinical compound evaluation in neuronal cells.
- Supports risk-adjusted advancement by providing predictive cellular readouts for neurodegeneration targets.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical research by enabling hypothesis-driven testing of intracellular mechanisms and compound effects in a genetically defined neuronal context.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of autophagy and neurodegeneration pathways in single ommatidia.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible imaging outputs for compound evaluation.
- Analytics: Provides confocal microscopy-based measurements of autophagosomes, lysosomes, and their fusion products.
- Translational Research: Facilitates alignment of cellular phenotypes with disease models and biomarker development.
- Enterprise Reuse: Offers a modular platform adaptable to diverse genetic backgrounds and compound libraries.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic studies of neurodegeneration.
- Operational Value: Standardizes single-cell dissection and imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing direct cellular evidence of target engagement and compound efficacy.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurodegeneration targets and therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila dissection and confocal imaging techniques.
- Needs access to fluorescence microscopy and cell culture infrastructure.
- Demands cross-team standardization for sample preparation and imaging protocols.
- Adaptable to various genetic backgrounds using mosaic analysis techniques.
- Limited to ex vivo analysis; in vivo validation may be required for translational continuity.
