Name: אחד תסיסנית אומטידיום Dissection והדמיה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 16 s
Description: למדו לבצע ניתוח ודימוי של אומטידיום בודד בדרוזופילה לחקר אירועים תוך-תאיים במודלים של ניוון עצבי. שיטה זו מאפשרת יצירת תרביות תאי עצב ראשוניות לטיפול תרופתי ודימוי מתקדם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים ברנרד Charroux לדיונים. עבודה זו מומנה על ידי בית הספר ביו KCl.

1. Dissection של הרשתית תסיסנית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מילוי אחד טוב של שקופיות 3-ובכן זכוכית עם פוספט שנאגרו מלוחים (PBS 1X), ולאחר מכן להרדים זבובים על ידי ה-CO 2. שני זכרים ונקבות ניתן להשתמש לצורך הניסוי הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הזבובים מורדמים, להרים זבוב אחד באמצעות מלקחיים ו זרוק אותו לתוך צלחת קטנה של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת בהיקף לנתח, לצבוט את חוטם עם מלקחיים, ולאחר מכן לנתק את הראש מהגוף על ידי ניתוק הצוואר באמצעות סט שני של מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזקת הראש לטוס חוטם, בחצי לאורך קו האמצע שמאלה / ימינה ראש לטוס עם microscissors לחשוף את המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש קצה פיפטה לחתוך להרים את הרשתית, ולהעביר שנייה גם של 3-Slide ובכן זכוכית מלאים בינוני שניידר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, לקלף ביותר לציפורן ראש ולאחר מכן להסיר את המוח עם מלקחיים. שמור את הרשתית דחוקה בין lamina לבין הקרנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, להעביר את הרשתית על ירידה (50 μl) של המדיום Schnieder טרי ממוקם ישירות על שקופיות הזכוכית. </li></ol> 2. Dissection של האומטידיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם למטרה הסופית של הניתוח (בין אם באופן מיידי או הדמיה תרבות) ועל אופטיקה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי (ישיר או הפוך), שלב זה יכול להתרחש גם על המיקרוסקופ שקופית או בצלחת 24 באר. למטרה הסופית של הניתוח הזה, האומטידיה יהיה גזור ישירות על גבי שקופיות הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחוז או סוף הגב או הגחון ביותר של הרשתית עם מלקחיים. שימוש microscissors, לחתוך את הרשתית במחצית לאורך קו האמצע הגב / הגחון לחשוף את האומטידיה באמצע העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לתפוס את הרשתית כזה הקרנית פונה למטה lamina הוא פונה כלפי מעלה. באמצעות מחט טונגסטן בסדר, לנתק את האומטידיה מ lamina לבין הקרנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האומטידיה יחיד וקבוצות האומטידיה תאסוף בתחתית הבאר או שקופיות. הסר את כל פסולת גדול שייתכן שנאספו לפני שתמשיך. </li></ol> 3. , טיפול מכתים הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח autophagy, לדלל 1:1000 Lysotracker בירידת שניידר (הראשון לדלל 1:10 ב שניידר ולאחר מכן להוסיף 0.5 μl עד טיפת בשקופית), לערבב ולהמתין 10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את נוזל עודף בשקופית, נזהר לצאת מאחורי האומטידיה. זה נעשה בצורה הטובה ביותר עם טיפ ג'ל עדין טוען. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף ירידה של Vectashield כדי לכסות את האומטידיה, להחיל coverslip וסוגרים עם nailpolish. </li></ol> 4. נציג תוצאות: ביצוע טוב של הפרוטוקול צריך להשאיר מספר האומטידיה יחיד של קבוצות קטנות של האומטידיה שמרו יחד על ידי שברי lamina אבל מופרדים יפה בצד הקרנית. אלה יכולים להיות צילמו כמו בדוגמה זו כדי להמחיש Atg8: GFP ו Lysotracker, מראה autophagosomes, lysosomes ו autophagolysosomes (איור 3). השיטה יכולה לשמש הדמיה לחיות, אולם במקרה זה יש לציין כי autofluorescence של המדיום של שניידר יקשה להבחין בין אותות בעוצמה נמוכה ניאון. סוגיה נוספת היא כי גרגרי פיגמנט שנותרו המחוברים photoreceptors הם פלורסנט מאוד, במיוחד במסלול האדום. תמונה brightfield עשויים להידרש להבדילם האברונים אמיתי. <img src="/files/ftp_upload/2882/2882fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. תרשים זרימה של הליך לנתיחה כדי להשיג האומטידיה בודד או קבוצות קטנות של האומטידיה מן הרשתית לעוף. <img src="/files/ftp_upload/2882/2882fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. וריאציות אפשריות של פרוטוקול פשוט לתאר כאן שכוללות גנטיקה לטוס והזדקנות במעלה הזרם של דיסקציה ו מכתים או culturing במשך עד 24 שעות והתרופות במורד הזרם של הניתוח. <img src="/files/ftp_upload/2882/2882fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3 לסרוק Confocal של autophagosomes ו lysosomes ב אומטידיום יחיד גזור מן aw;-GMR Gal4, כטב"מ-Atro75QN; כטב"מ-GFP:.: Atg8 / + לעוף, להביע polyglutamine Atrophin מוטנטי בגילאי 12 ימים ב 29 ° C. לוח brightfield (מימין למעלה) מציג את מבנה כמעט בשלמותה של אומטידיום ואת המסגרת מצביע על האזור שנסרק. האדום מסמן ליזוזומים, ירוק autophagosomes, Auto-lysosomes, וכתוצאה מכך על ידי איחוי של שני אברונים, מופיעים צהוב. ראשי חץ מציינים שני אירועים היתוך מתמשך בין autophagosomes ו lysosomes.

<ol><li>Marsh, J. L., Thompson, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+in+the+study+of+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drosophila in the study of neurodegenerative disease.</a> Neuron. 52, 169-178 (2006).</li>
<li>Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451, 1069-1075 (2008).</li>
<li>Nisoli, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegeneration+by+polyglutamine+Atrophin+is+not+rescued+by+induction+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Neurodegeneration by polyglutamine Atrophin is not rescued by induction of autophagy.</a> Cell Death Differ. 17, 1577-1587 (2010).</li>
<li>Charroux, B., Fanto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fine+line+between+waste+disposal+and+recycling%3A+DRPLA+fly+models+illustrate+the+importance+of+completing+the+autophagy+cycle+for+rescuing+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">The fine line between waste disposal and recycling: DRPLA fly models illustrate the importance of completing the autophagy cycle for rescuing neurodegeneration.</a> Autophagy. 6, 667-669 (2010).</li>
<li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensitive+potassium+channels+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensitive potassium channels in Drosophila photoreceptors.</a> J Neurosci. 11, 3079-3095 (1991).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+for+Drosophila+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends in neurosciences. 24, 251-254 (2001).</li>
<li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117, 1223-1237 (1993).</li>
<li>Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+in+vivo+imaging+of+photoreceptor+apoptosis+and+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila.</a> Dev Biol. 351, 128-1234 (2011).</li>
<li>Napoletano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyglutamine+Atrophin+provokes+neurodegeneration+in+Drosophila+by+repressing+fat%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Polyglutamine Atrophin provokes neurodegeneration in Drosophila by repressing fat.</a> The EMBO journal. 30, 945-958 (2011).</li>
<li>Ravikumar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+mTOR+induces+autophagy+and+reduces+toxicity+of+polyglutamine+expansions+in+fly+and+mouse+models+of+Huntington+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibition of mTOR induces autophagy and reduces toxicity of polyglutamine expansions in fly and mouse models of Huntington disease.</a> Nature. 36, 585-595 (2004).</li>
<li>Zou, S., Meadows, S., Sharp, L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+study+of+aging+and+oxidative+stress+response+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genome-wide study of aging and oxidative stress response in Drosophila melanogaster.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13726-13731 (2000).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

דיסקציה אומטידיום יחיד המוצגת כאן מאפשרת איסוף מידע התא עמוק יותר על תהליכים ביולוגיים כמו ניוון מוחיים, כאשר הדגם בעין תסיסנית. הנוירונים הם photoreceptor נגיש יותר בקלות מאשר נוירונים אחרים והם הציטופלסמה הוא גדול במיוחד, מתאים ובכך ללמוד הדינמיקה שלפוחית, בתאי בדיוק השתמשו במיומנות במודלים רבים לכמת ניוון מוחיים in vivo. ההיבט הקריטי של הניתוח הוא בעיקר את היכולת לבצע זאת על רקמת מבולבל כי לא חייב להיות חשוף לאוויר או להתייבש. האפשרויות להרחבת טכניקה זו הבסיסי...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> Dispenser CO2 ניידת </td><td> Flystuff </td><td> 59-150 </td><td> מילוי גם זמין </td></tr><tr><td> דומונט פינצטה לא 5 </td><td> מדעי אגר </td><td> T5034 </td><td></td></tr><tr><td> 3-ובכן זכוכית נושאת </td><td> EMS </td><td> 71561-01 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרו מספריים </td><td> VWR </td><td> HAMMHSB516-09 </td><td></td></tr><tr><td> שניידר בינוני </td><td> VWR </td><td> 733-1663 </td><td></td></tr><tr><td> LysoTracker האדום DND-99 </td><td> Invitrogen </td><td> L7528 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrost שקופיות </td><td> VWR </td><td> 631-0108 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield עם Dapi </td><td> וקטור Labs </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> Coverslips </td><td> VWR </td><td> 631-1336 </td><td></td></tr></tbody></table>

אחד תסיסנית אומטידיום dissection והדמיה

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

זבוב הפירות דרוזופילה melanogaster תרם תרומות יקר המוח במחקר כבר בשימוש נרחב כמודל מחלות ניווניות בגלל הגנטיקה שלה עוצמה 1. העין לטוס בפרט כבר האיבר של בחירה עבור מחקר ניוון מוחיים, להיות חלק נגיש ביותר החיים dispensable של מערכת העצבים תסיסנית. עם זאת, אזהרה גדולה של העיניים שלם הוא הקושי, בגלל autofluorescence האינטנסיבי של הפיגמנט, באירועים הדמיה תאיים, כגון autophagy הדינמיקה 2, אשר עליונה הבנה של ניוון מוחיים. השתמשנו לאחרונה לנתיחה והתרבות של האומטידיה אחד 3 כי כבר חיוני להבנת תפקוד autophagic במודל זבוב של ניוון Dentatorubro-Pallidoluysian (DRPLA) 3, 4. כעת אנו מדווחים תיאור מקיף של טכניקה זו (איור 1), המותאמים ממחקרים אלקטרו 5, אשר צפוי להרחיב באופן משמעותי את האפשרות של מודלים לטוס ניוון מוחיים. שיטה זו יכולה להתאים לדימוי חי אירועים subcellular כדי לפקח והתרופות אפקטיבי על התאים קולטי האור (איור 2). אם בשילוב עם טכניקות פסיפס 6-8, התגובות של תאים שונים גנטית יכול להיות assayed במקביל (איור 2).

הגורם המגביל בשימוש של המבוגר<em&gt; תסיסנית</em&gt; עין ללמוד ניוון מוחיים, ביולוגיה של התא הוא קשה הדמיה של תהליכים תאיים. אנו מתארים את דיסקציה של האומטידיה בודד כדי ליצור בתום-בתום תא ראשוני תרבות העצבית, אשר יכול להיות נושא לטיפול תרופתי והדמיה מתקדמים.

אחד תסיסנית אומטידיום Dissection והדמיה

זבוב הפירות *Drosophila melanogaster* תרם תרומות לא יסולאו במחקרים בתחום מדעי העצבים, ושימש באופן נרחב כמודל למחלות נוירודגנרטיביות...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבצע נתיחה והדמיה של זבוב דרוזופילה (drosophila) או זבוב מטיה (matia) בודד, כדי ללמוד על אירועים תוך-תאיים במודלים של ניוון עצבי. דבר זה מושג תחילה על ידי הפרדת ראש הזבוב משאר הגוף וחתיכתו לפתיחה.בשלב הבא מוציאים את המוח ורקמות אחרות מתוך הראש. לאחר מכן מסירים את הקוטיקולה וחוצים כל רשתית לשני חלקים. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא גילוף ה-O באמצעות מחט טנגסטן והנחתם על עלית.בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות אברוני אוטופגיה ציטופלזמיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית פלואורסצנטית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת אנליזה ביולוגית של תאים ברזולוציה גבוהה במודלים של דרוזופילא (drosophila) לניוון עצבי, אשר עד כה יכלו להעניק תובנות גנטיות בלבד בתחום זה, ובכך היא מדגימה כי הפרוצדורה תהיה משתנה. סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי, בסיועו של דניאל מקיי, טכנאי היסטולוגיה ומיקרוסקופיה במרכז.כדי להתחיל, מלאו באבקת פוספט בופר סלין (PBS) באר אחת של סלייד זכוכית בעל שלוש בארות, ולאחר מכן הרדימו את הזבובים באמצעות פחמן דו-חמצני. לאחר שהזבובים הורדמו, העבירו זבוב בודד באמצעות פינצטה והניחו אותו בתוך הכלי הקטן עם ה-PBS. תחת מיקרוסקופ דיססקציה, תפסו את החרטום בעזרת פינצטה ולאחר מכן הפרידו את הראש מהגוף על ידי חיתוך הצוואר.באמצעות סט שני של פינצטות המחזיקות את ראש ה

single-drosophila-ommatidium-dissection-and-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בשנת חרקים, oenocytes לייצר תרכובות פחמימנים cuticular. תרכובות אלו להגן מפני התייבשות ולאפשר תקשורת כימית. כאן אנו להפגין טכניקה לנתיחה להשתמש כדי לבודד את oenocytes מן...

Dissection של Oenocytes מן למבוגרים תסיסנית melanogaster</em

שיטת ההדמיה הזקופה המתוארת בפרוטוקול זה מאפשרת הדמיה מפורטת של הקטבים של ביצית דרוזופילה מלנוגסטר מתפתחת.  מבט מקצה לקצה זה מספק פרספקטיבה חדשה על הסידורים והמורפולוגיה של סוגי תאים מרובים באפיתל הזקיקים.

הדמיה זקופה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; לשכות ביצה

השחלה דרוזופילה הוא מערכת דגם מעולה ללימוד פיתוח גומחת תאי גזע. על פי שיטות ניקוד השחלות זחל ומבוגרים פורסמו, השחלה הגולמי והניתוחים דורשות טכניקות שונות זה לא פורסמו בפירוט. כאן אנחנו חלוקה לרמות פרוטוקול לנתח, מכתים של הרכבה השחלות הגולמי.

חיתוך, צביעה של השחלות הגולמי דרוזופילה

פרוטוקול זה מיועד הדמיה וניתוח של הדינמיקה של כיוון התאים ואת צמיחת רקמות בתוך הבטן הדרוזולה epithelia כמו זבוב הפרי עובר מטמורפוזה. המתודולוגיה המתוארת כאן ניתנת להחלה על חקר שלבים, רקמות ומבנים תת-סלולאריים שונים בדרוזופילה או באורגניזמים אחרים במודל.

הדמיה וניתוח של כיוון רקמות ודינמיקה בפיתוח הדרוזולה אפיתליה במהלך שלבי pupal

הציגו כאן הן שיטות מפורטות לחיתוך וליפיד droplet כתמים של oenocytes ב הזחלים Drosophila ילה באמצעות BODIPY 493/503, שומנים בצבעי פלורסנט ספציפי לשומנים.

לחיתוך וליפיד Droplet כתמים של Oenocytes בתוך דרוזופילה הזחלים

פרוטוקול מוצג המאפשר הדמיה של Drosophila melanogaster שלם בכל שלב של פיתוח באמצעות טומוגרפיה מיקרו מחשב.

הדמיה חיה שלמה של Drosophila melanogaster באמצעות טומוגרפיה מיקרו-מחשבתית

כאן, אנו מספקים פרוטוקול דיסקציה הנדרש כדי לצלם בשידור חי את הגונד הזכר העוברי המנוח של דרוזופילה . פרוטוקול זה יאפשר תצפית על תהליכים תאיים דינמיים בתנאים רגילים או לאחר מניפולציה מהונדסת או פרמקולוגית.

דיסקציה והדמיה חיה של דרוזופילה גונד העוברית המאוחרת

בדרוסופילה, גרעין הביצית עובר הגירה תלוית מיקרוטובולה במהלך oogenesis. כאן, אנו מתארים פרוטוקול שפותח כדי לעקוב אחר הנדידה על ידי ביצוע הדמיה חיה על תאי ביצה ex-vivo. ההליך שלנו שומר על תאי ביצים בחיים במשך 12 שעות כדי לרכוש סרטים תלת-ממדיים רב-תכליתיים לשגות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב.

הגירה גרעינית באוקיטה של דרוסופילה

כאן, אנו מציגים זרימת עבודה מהירה, בעלות נמוכה, עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של עיני דרוזופילה בוגרות כדי לכמת דפוסי דפוס ופגמי גדילה. אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו להכנת דגימות על ידי הרכבה נקודתית, רכישת תמונה ברזולוציה גבוהה וניתוח תמונה.

תהליך עבודה מהיר ופשוט לכימות מבני דרוזופילה חיצוניים למבוגרים

דרוזופילה היא מודל רב עוצמה להבנת מנגנונים בסיסיים של מיוגנזה. פרוטוקול זה לדיסקציה והכנה של חצאי בית החזה מאפשר ניתוח מיקרוסקופיה של שרירי תעופה עקיפים הן משלב הגולם והן משלב הבוגר. פרוטוקול זה מאפשר הדמיה קונפוקלית של מורפולוגיה תאית, לוקליזציה של חלבונים, מבנה שרירים והיבטים רבים אחרים של מיוגנזה.

דיסקציה של שרירי טיסה עקיפים של Drosophila melanogaster לגישות מיקרוסקופיות

למדו לבצע ניתוח ודימוי של אומטידיום בודד בדרוזופילה לחקר אירועים תוך-תאיים במודלים של ניוון עצבי. שיטה זו מאפשרת יצירת תרביות תאי עצב ראשוניות לטיפול תרופתי ודימוי מתקדם.

אחד תסיסנית אומטידיום Dissection והדמיה

גלה סרטונים נוספים