Name: הפקת DNA גבוהה מולקולרית משקל של מאטס מיקרוביאלית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-07T12:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: למד שיטה משופרת לחילוץ DNA גבוה מולקולרית משקל ממחצלות מיקרוביאליות היפר-מלחיות. הפרוטוקול מפריד תאים מיקרוביאליים ממטריצת המחצלת לפני החילוץ, ומספק DNA איכותי לניתוחים גנומיים מתקדמים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי תוכנית קרן המדע הלאומית Genomics הסביבה (גרנט לא EF-0723707).

1. תא מיקרוביאלית Extraction: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize מחצלות חיידקים עם העלי שחיקה סטרילי על ידי ערבוב יסודי. כל מקום בערך 30 גרם (משקל רטוב) של חומר הומוגני מחצלת לתוך מיכל סטרילי של וורינג בלנדר, להוסיף כ 100 מ"ל של 1 M NaCl (או ריכוז ספציפיים מדגם בשימוש), ואת תערובת שלוש פעמים במהירות בינונית במשך דקות עם 1 קירור לסירוגין מקפיא ° C -20 דקות 1. מעבירים את התערובת לתוך בקבוק 250 מ"ל צנטריפוגות ולמלא את הריק הנותר עם נפח 1 M NaCl. הכן פתרון NaCl במים DI autoclaved ולסנן לעקר אותה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנוסף לסלק את התאים חיידקים מהמטריצה ​​על ידי רועדת (150 סל"ד) באמצעות vortexer (וורטקס-Genie R 2) בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במהירות נמוכה (500x ז) במשך 15 דקות ב 4 ° C. בעדינות להעביר את supernatant לתוך בקבוק עם הפרעה מינימלית במשקעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש משקעים pelleted, חזור מיזוג צעדים 1.2 ו 1.3 ארבע פעמים נוספות עם תוספת של NaCl טריים כל משקעים גלולה בסוף צעד 1.3. Supernatant מתוך מיצוי כל NaCl מועבר לתוך בקבוק טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את supernatants מתוך 5 עקירות התא צנטריפוגות ב aliquots של 200 מ"ל במהירות גבוהה (25,000 XG) במשך 15 דקות ב 4 ° C. בטל supernatant, resuspend כל תא גלולה ב 10 מ"ל של נתרן hexametaphosphate 2%, לשלב כדורי ולעשות את הווליום עד 200 מ"ל עם hexametaphosphate נתרן 2%. שטפו תאים על ידי רועדת (150 סל"ד) בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. בסוף שלב זה אתה צריך רק צינור של תאים כדי להמשיך לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במהירות גבוהה (25,000 XG) במשך 15 דקות ב 4 ° C. בטל supernatant, resuspend תא גלולה ב 200 מ"ל של TE (50 mM EDTA), ולשטוף תאים על ידי רועדת (150 סל"ד) בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במהירות גבוהה (25,000 XG) במשך 15 דקות ב 4 ° C, לבטל את supernatant, resuspend ב 15 מ"ל TE (10 mM EDTA), ולאחסן 200 μL aliquots ב -80 ° C עד הדרוש DNA עקירות. </li></ol> 2. הפקת DNA וטיהור: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 200 μL 5 M NaCl, 200 SDS μL 10%, ו 100 μL 14.3 M β-mercaptoethanol את aliquot 200 μL התא של חיידקים. מערבבים בעדינות על ידי 4-6 פעמים היפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תערובת בכפוף ל 3 סיבובים של הפשרה, הקפאה באמצעות חנקן נוזלי שוקע בתוך 2 דקות ואחריה להפשרה אמבטיה 65 מעלות צלזיוס מים 5 דקות. הרחבת הסופי הפשרה על 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 200 אצטט μL 5 M אשלגן (pH 5.5) ומניחים על קרח למשך 10 דקות. צנטריפוגה ב XG 10,000 עבור 10 דקות ב 4 ° C ולהעביר את supernatant לצינור חדש באמצעות טיפ רחב נשא פיפטה. הוסף 3 μL של RNase A ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים נפח שווה של כלורופורם, ללחוץ בקצרה על ידי היפוך, ו צנטריפוגות ב XG 15,000 עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר בזהירות את השכבה העליונה של supernatant לתוך צינור חדש באמצעות טיפ רחב נשא פיפטה. הימנע pipetting שכבת ממשק לבן הממוקם בין שכבות העליון והתחתון. חזור על הליך כלורופורם-החילוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח שווה של צונן (ב -20 ° C) isopropanol את supernatant ו לדגור על קרח למשך 30 דקות כדי לזרז DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה על מהירות מרבית (20,800 XG) במשך 10 דקות ב 4 ° C עד גלולה DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ולשטוף DNA גלולה עם 1 מ"ל של צונן (ב -20 ° C) 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה על מהירות מרבית (20,800 XG) במשך 10 דקות ב 4 ° C, לבטל את supernatant, חזרו לשטוף אתנול 70%, אוויר יבש DNA גלולה במשך 10 דקות. חזור על לשטוף אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ה-DNA Resuspend ב 25 TE μL (10 mM EDTA), חמים 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, לשלב לתוך צינור אחד אם צינורות מרובים היו בשימוש, ואיפור נפח μL עם TE 500. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 500 μL קר כקרח (או 4 ° C) 20% פוליאתילן גליקול (PEG) (שהוכנו 1.2 M NaCl). מערבבים בעדינות על ידי היפוך, דגירה על קרח במשך 10 דקות, ו צנטריפוגה במהירות המרבית עבור 10 דקות ב 4 ° C עד גלולה DNA. הסר להתעלמות supernatant לשטוף את ה-DNA pelleted עם 1 מ"ל של אתנול 70% צונן, אוויר יבש 10 דקות, ו resuspend ב 30-50 μL TE או מים כיתה מולקולרית. להקל resuspension של ה-DNA על ידי ההתחממות על 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ו-DNA חנות ב -80 ° C. </li></ol> 3. טוהר ה-DNA, ריכוז ונחישות גודל: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת איכות ה-DNA על ידי מדידת 260/280 ו 260/230 יחס באמצעות ספקטרופוטומטר Nanodrop 1000 או כל מכשור מתאים אחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת ריכוז ה-DNA באמצעות קוואנט-IT ערכת dsDNA Assay על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת גודל ה-DNA באמצעות שדה הדופק ג'ל אלקטרופורזה. הכן 1% agarose ג'ל עם TBE 0.5X ולהשתמש הפרמטרים הבאים על Mapper השף XA המערכת; הזמן לעבור הראשונית של 0.35 שניות, זמן לעבור הסופי של 7.67 שניות, ו 120 ° כלול זווית שיפוע של 6.0 V / ס"מ r ליניאריamping גורם. הכתם ג'ל עם 1 x SYBR גרין אני למשך 30 דקות. טען בין 700-1000 מסך ng DNA על ג'ל. ראה איור. עבור 3 בצורה מתומצתת של פרוטוקול מלא. </li></ol> נציג תוצאות: תא מיצוי: Sequential התא של חיידקים תמציות (supernatants) הראו כי עכירות של תמציות פוחתת ככל שמספר להגדיל עקירות. הדבר מצביע על ירידה במספר התאים הבאים מיצוי כל תא רצופים. חשוב לציין כאן כי כל צעד נוסף מיצוי תא מספק הזדמנות הקדמה זיהום, מספר תאים עקירות צריך להיות ממוזער כך שהתא גלולה הסופי הוא נציג של הקהילה חיידקים הכוללת. מקורות אחרים של זיהום נשלטו על ידי אימוץ טכניקות מעבדה מספיק סטרילית. למשל, הפתרונות הוכנו במים DI autoclaved ולסנן מעוקרים. מיכלי עוקרו עם אלכוהול, autoclaved, והתייחסו תחת אור אולטרה סגול UV ו crosslinker. ה-DNA ריכוז ונחישות איכות: פרוטוקול הניב כ -2 מיקרוגרם של HMW DNA (35-50 קילו) (איור 4) לגרם מדגם מחצלת עם יחס של 1.6 260/280, 260/230 ו יחס של 0.7 (טבלה 1). למרות יחס 260/230 שנראה נמוך, אין עיכוב יישום מולקולרית מבוסס במורד כגון הגברה-PCR של 16S rRNA גנים נצפתה במחקר נפרד 7. חשוב לציין כי ה-DNA מן hypersaline מחצלות יש שני מקורות עיקריים של זיהום; EPS ומלחים. לפיכך, ייתכן כי עקבות של חומרים מזהמים אלה עשויים להיות השפעה על יחסי 260/230 למרות מאמצים עצומים כדי לצמצם את השפעתם על יישומים זרם למטה. קביעת גודל ה-DNA: ג'ל אלקטרופורזה דופק שדה מעסיקה זרימת הנוכחי פועמת עם מתגים כיוונית לסירוגין והתוצאה היא משטח ה-DNA כפי שמוצג באיור 3. פרוטוקול ה-DNA שלנו הניב HMW של כ 35-50 kb. בעוד כמה גודל DNA עשוי להיות קטן יותר מ -30 kb, חשוב להיות חלק למרוח מעל 35 kb בהתחשב בעובדה שיבוט fosmid דורש ~ 40 kb מחדיר דנ"א שברי דנ"א גדולים לספק גישה רחבה יותר מסלולים biosynthetic ללא פגע. במחקרים שלנו, למרוח את ה-DNA מעל 35 קילו היה נכרת וטיהר עבור שיבוט גדול להכניס וקטור ויישומים מולקולריים אחרים. <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> 1. איור חיידקים Hypersaline מחצלת דגימה באתר (בריכה גדולה) הממוקם על אליאותרה, Bahamas. <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. חתך של המזרן חיידקים hypersaline השתמשו במחקר זה. מחצלת חיידקים התקבל בברכה hypersaline ממוקם על אליאותרה, Bahamas. <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. ייצוג סכמטי של הליכים מעורבים מיצוי התא של חיידקים, תמוגה התא, חילוץ, טיהור של ה-DNA metagenomic. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2887/2887fig3large.jpg">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.</a> <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. אפיון המשקל המולקולרי של הדנ"א מופק באמצעות ג'ל אלקטרופורזה הדופק בתחום. ליין M הוא סמן HMW, ועל נתיבי 1 ו -2 הם משכפל הדנ"א metagenomic שחולצו מן המחצלת אליאותרה hypersaline באמצעות פרוטוקול לעיל. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שיטת מיצוי </td><td></td><td> ריכוז ng / g </td><td> 260/280 </td><td> 260/230 </td></tr><tr><td> PEG </td><td> הודעות 1 </td><td> 1806.1 </td><td> 1.64 </td><td> 0.76 </td></tr><tr><td></td><td> הודעות 2 </td><td> 2010.8 </td><td> 1.61 </td><td> 0.75 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. מדידה של ריכוז ואיכות ה-DNA המופק מחצלת hypersaline מיקרוביאלי.

<ol><li>Decho, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+biofilms+in+intertidal+systems%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Cont.+Shelf+Res%22%5BJournal%5D)">Microbial biofilms in intertidal systems: an overview.</a> Cont. Shelf Res. 20, 1257-1273 (2000).</li>
<li>Dupraz, C., Visscher, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+lithification+in+marine+stromatolites+and+hypersaline+mats%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial lithification in marine stromatolites and hypersaline mats.</a> Trends Microbiol. 13, 429-438 (2005).</li>
<li>Steffan, R. J., Goksoyr, J., Boj, A. K., Atlas, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+DNA+from+soils+and+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Recovery of DNA from soils and sediments.</a> Appl. Environ. Microbiol. 54, 2908-2915 (1988).</li>
<li>Lee, Y. K., Kim, H. W., Liu, C. L., Lee, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+DNA+extraction+from+marine+bacteria+that+produce+extracellular+materials%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for DNA extraction from marine bacteria that produce extracellular materials.</a> J. Microbiol. Methods. 52, 245-250 (2003).</li>
<li>Roose-Amsaleg, C. L., Garnier-Sillam, E., Harry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+and+Purification+of+Microbial+DNA+from+Soil+and+Sediment+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Soil+Ecol%22%5BJournal%5D)">Extraction and Purification of Microbial DNA from Soil and Sediment Samples.</a> Appl. Soil Ecol. 18, 47-60 (2001).</li>
<li>de Lipthay, J. R., Enzinger, C., Johnsen, K., Aamand, J., Sørensen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+DNA+extraction+method+on+bacterial+community+composition+measured+by+denaturing+gradient+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Impact of DNA extraction method on bacterial community composition measured by denaturing gradient gel electrophoresis.</a> Soil Biol. Biochem. 36, 1607-1614 (2004).</li>
<li>Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+High+Molecular+Weight+DNA+from+Microbial+Mats%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats.</a> Biotechniques. 49, 631-640 (2010).</li>
<li>Kakirde, S. K., Parsley, L. C., Liles, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+does+matter%3A+Application-driven+approaches+for+soil+metagenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biology+%26+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Size does matter: Application-driven approaches for soil metagenomics.</a> Soil Biology & Biochemistry. 42, 1911-1923 (2010).</li>
<li>Rodon, M. R., August, P. R., Bettermann, A. D., Brady, S. F., Grossman, T. H., Liles, M. R., Loiacono, K. A., Lynch, B. A., MacNeil, I. A., Minor, C., Tiong, C. L., Gilman, M., Osburne, M. S., Clardy, J., Handelsman, J., Goodman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+the+Soil+Metagenomic%3A+A+Strategy+for+Accessing+the+Genetic+and+Functional+Diversity+of+Uncultured+Microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cloning the Soil Metagenomic: A Strategy for Accessing the Genetic and Functional Diversity of Uncultured Microorganisms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 66, 2541-2547 (2000).</li>
<li>Beja, O., Aravind, L., Koonin, E. V., Suzuki, M. T., Hadd, A., Nguyen, L. P., Jovanovich, S. B., Gates, C. M., Feldman, R. A., Spudich, J. L., Spudich, E. N., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Rhodopsin%3A+Evidence+for+a+New+Type+of+Phototrophy+in+the+Sea%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Rhodopsin: Evidence for a New Type of Phototrophy in the Sea.</a> Science. 289, 1902-1906 (2000).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בהתחשב בכך הכולל הסרת תאים מדגימות מחצלת מורכב ומגוון מאוד של חיידקים אינה מעשית, הדאגה העיקרית היא באיזו מידה את התאים חילוץ לייצג את הקהילה הכוללת מחצלת מיקרוביאלי. במחקר קודם, ה-PCR-DGGE ניתוח של גנים 16S rRNA הראו כי חיידקים חמש הסרת תא צעדים להשתמש בפרוטוקול זה תמציות תאים מייצגים את הקהילה מחצלת הכוללת חיידקים 7. המספר האמיתי של החילוץ תא הצעדים הנדרשים כדי לספק גלולה התא הוא נציג של הקהילה חיידקים הכוללת צפויה להשתנות תלוי בסוג המדגם. לפיתוח הפרוטוקול האופטימלי ע...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> β-mercaptoethanol </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> M3148 </td><td></td></tr><tr><td> פוליאתילן גליקול 8000 </td><td> Promega </td><td> V3011 </td><td> 20% 1.2 M NaCl </td></tr><tr><td> אשלגן אצטט </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td></td><td> פישר סיינטיפיק </td></tr><tr><td> קוואנט-IT Assay dsDNA ערכת </td><td> Invitrogen </td><td> Q33130 </td><td></td></tr><tr><td> RNase </td><td> Epicentre </td><td> MRNA092 </td><td></td></tr><tr><td> נתרן כלוריד </td><td> BDH כימיקלים </td><td> BDH8014 </td><td> מתאים קונצרט כלשהו. </td></tr><tr><td> Dodecyl סודיום סולפט </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 03-500-509 </td><td> 10% מים </td></tr><tr><td> נתרן hexametaphosphate </td><td> EMD כימיקלים </td><td> SX0583-3 </td><td> 2% במים </td></tr><tr><td> TBE </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> BP1333-1 </td><td></td></tr><tr><td> השף Mapper XA מערכת </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> 170-3670 </td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop 1000 ספקטרופוטומטר </td><td> Thermo Scientific </td><td> ND-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Vortexer </td><td> מדעי תעשיות בע&quot;מ </td><td></td><td></td></tr><tr><td> סגול Crosslinker </td><td> UVP </td><td></td><td></td></tr><tr><td> וורינג בלנדר </td><td> וארינג מעבדה </td><td> LB10S </td><td></td></tr></tbody></table>

הפקת dna גבוהה מולקולרית משקל של מאטס מיקרוביאלית

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

ניתוח מוצלח ומדויק ופרשנות של נתונים metagenomic תלוי מיצוי יעיל של באיכות גבוהה, ה-DNA מולקולרי גבוה (HMW) במשקל הקהילה. עם זאת, דגימות מחצלת סביבתיים מהווים לעיתים קרובות בקשיים להשגת ריכוזים גדולים של ה-DNA באיכות גבוהה HMW,. מחצלות Hypersaline חיידקים מכילים כמויות גדולות של חומרים פולימריים תאיים (EPS) 1 ומלחים שעשויים לעכב יישומים במורד הזרם של ה-DNA חילוץ. שיטות ישיר וקשה משמשים לעיתים קרובות מיצוי דנ&quot;א מדגימות עקשן. שיטות אלה משמשים בדרך כלל משום למניה ב מחצלות, מטריצה ​​דבק, נקשר ה-DNA 2,3 במהלך תמוגה ישיר. כתוצאה שיטות מיצוי קשים, ה-DNA הופך מקוטעת לתוך בגדלים קטנים 4,5,6. ה-DNA ובכך הופך הולם שיבוט גדול להכניס וקטור. על מנת לעקוף את המגבלות האלה, אנו מדווחים על מתודולוגיה משופרת להפיק דנ&quot;א HMW באיכות וכמות טובה של מחצלות חיידקים hypersaline. אנחנו עובדים בשיטה עקיפה מעורבים הפרדת תאים מיקרוביאליים מהמטריצה ​​רקע מחצלת באמצעות מיזוג צנטריפוגה ההפרש. שילוב של נהלים מכני וכימי שימש כדי לחלץ ולטהר DNA מתאי חיידקים שחולצו. פרוטוקול שלנו התשואות כ -2 מיקרוגרם של HMW DNA (35-50 kb) לגרם מדגם מחצלת, עם יחס של 260/280 1.6. יתר על כן, הגברה של גנים 16S rRNA 7 עולה כי הפרוטוקול יכול להקטין או למנוע תופעות מעכבות של מזהמים. התוצאות שלנו לספק המתודולוגיה המתאימה החילוץ של ה-DNA HMW מ מחצלות חיידקים ללימודי metagenomic פונקציונלי עשויות לחול על דגימות סביבתיות אחרות שמהן מיצוי DNA הוא מאתגר.

אנו מספקים פרוטוקול משופר לחילוץ משקל מולקולרי גבוה DNA של חיידקים מחצלות hypersaline. תאים מיקרוביאלית מופרדים המטריצה ​​מחצלת לפני מיצוי DNA וטיהור. זה משפר את הריכוז, איכות, גודל של ה-DNA. הפרוטוקול ניתן להשתמש בדגימות עקשן אחרים.

הפקת DNA גבוהה מולקולרית משקל של מאטס מיקרוביאלית

ניתוח ופירוש מוצלחים ומדויקים של נתונים מטגנומיים תלויים בהוצאה יעילה של DNA בעל איכות גבוהה ובמשקל מולקולרי גבוה...

המטרה הכללית של נוהל זה היא להפיק DNA בעל משקל מולקולרי גבוה ממחצלאות מיקרוביאליות היפר-מליחות. דבר זה מושג תחילה על ידי הומוגניזציה והפקה של תאים מיקרוביאליים מהמחצלת המיקרוביאלית. לאחר מכן, התאים המיקרוביאליים עוברים ליזיס באמצעות שיטת הקפאה-הפשרה ומתודולוגיה כימית.השלב הבא הוא הסרת שאריות תאים ו-RNA באמצעות תמציות אורגניות ו-RNAs, ולאחריהן מיצוי DNA. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא שיקיעה וטיהור של ה-DNA. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות DNA באיכות של משקל מולקולרי גבוה ובריכוז גבוה.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שיטות מיצוי DNA ישירות ואגרסיביות, הוא השימוש ב-DNA בעל משקל מולקולרי גבוה מדגימה סביבתית מורכבת לצורך מחקרי מטאגנומיקה פונקציונלית. המטא-מיקרוביאלית ששימשה במחקר זה הופקה מבריכה היפר-מליחה הממוקמת באליאותרה, בהאמאס, כדי למצות תאים מיקרוביאליים ממטריצת המאט ברקע, ערבבו תחילה כ-30 גרם של מאט ביסודיות ללא גריסה, באמצעות עלי פסטל סטרילי. המאט נחשב להומוגני לחלוטין כאשר לא ניתן לראות גושים בתערובת.כעת העבירו את חומר המט ההומוגני לבלנדר והוסיפו כ-100 milliliters של sodium chloride. ערבבו במהירות בינונית למשך דקה אחת, ולאחר מכן קיררו למשך דקה אחת בטמפרטורה של 20- degrees Celsius. חזרו על פעולה זו, הערבוב והקירור, פעמיים נוספות. עם סיום הערבוב, העבירו את תמיסת השרי (slurry) לבקבוק צנטריפוגה בנפח של 250 milliliter ומלאו את שאר הנפח החופשי ב-sodium chloride בריכוז one molar.נער בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, ולאחר מכן צנטריפוג את התעלה במהירות נמוכה למשך 15 דקות ב-4 °C. לאחר מכן, העבר בעדינות את הנוזל העליון לבקבוק תוך הפעלה מינימלית של המשקע. הוסף סודיום כלוריד טרי למשקע שנאסף.ערבבו שוב ונערעו במשך 30 דקות. לאחר מכן,בצעו צנטריפוגה כפי שנעשה קודם לכן, והעבירו את העילוי לבקבוק חדש. חזרו על הוספת נתרן כלורי טרי, הערבוב, הצנטריפוגה והסרת העילוי שלוש פעמים נוספות.שלבו את העל-נוזלים מחמש מיצאי התאים וסובבו במהירות גבוהה מנות של 200 milliliters למשך 15 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius. השליכו את העל-נוזל וסספנדו מחדש כל משקע תאים ב-10 milliliters של sodium hexametaphosphate. שלבו את סספנדו התאים מארבעת המבחנות והוסיפו sodium hexametaphosphate להשלמת הנפח ל-200 milliliters.שטפו את התאים על ידי ניעור בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר הניעור, סובבו את התאים בצנטריפוגה במהירות גבוהה למשך 15 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, השליכו את supernatant ותלו את משקע התאים ב-200 milliliters של תמיסה לשטיפת תאים, שוב על ידי ניעור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לבסוף, סובבו שוב בצנטריפוגה במהירות גבוהה למשך 15 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.לאחר השליפה של ה-snat Resus, השעו את משקע התאים ב-15 milliliters של te והכינו מנות (aliquots) של 200 microliter של תאי מיקרובים. ניתן לאחסן תאי מיקרובים בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius עד שיהיו דרושים להפקת DNA. כדי להתחיל את ההליך להפקה וטיהור של DNA מתאי המיקרובים, הוסיפו sodium chloride SDS ו-beamr capto ethanol לכל אחת מהמנות של 200 microliter של תאי מיקרובים.חלקו למשבובות בשמונה מבחנות בסך הכל. ערבבו בעדינות על ידי היפוך ארבע עד שש פעמים, טבלו את התערובת בחנקן נוזלי למשך שתי דקות, ולאחר מכן הפשירו בטמפרטורה של 65 °C למשך חמש דקות; חזרו על הטבילה בחנקן נוזלי וההפשרה ב-65 °C פעמיים נוספות.הארכת הפשרה סופית ל-10 דקות. לאחר סבב שלישי של הקפאה והפשרה, הוסיפו 200 µL של potassium acetate לכל מבחנה והניחו על קרח למשך 10 דקות. לאחר מכן, סבבו בצנטריפוגה ב-10,000 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C.בשלב הבא, השתמשו בטיפ פחית בעל פיה רחבה להעברת העליון למבחנה חדשה. הוסיפו 3 µL של RNase A והדגירו בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת. לאחר דגירה של שעה, הוסיפו נפח שווה של כלורופורם.נערו קצרה על ידי היפוך וסובבו בצנטריפוגה ב-15,000 Gs למשך 10 דקות. בטמפרטורת החדר, העבירו את השכבה העליונה של העל-משקע למבחנה חדשה. חזרו על הליך המיצוי בעזרת כלורופורם.שוב, העבירו את השכבה העליונה של הנוזל העילאי למבחנה חדשה. הוסיפו לנשקיד נפח שווה של איזו-פרופנול קר והדגרירו על קרח למשך 30 דקות. כדי להשקיע את ה-DNA, סובבו בצנטריפוגה במהירות מרבית, השליכו את הנוזל העילאי ושטפו כל משקע DNA במיליליטר אחד של 70% ethanol קר.חזרו על שטיפת ה-70% ethanol באמצעות צנטריפוגה במהירות מקסימלית למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. השליכו את הנוזל העליון (supernatant). חזרו על שטיפת ה-70% ethanol ויבשו את משקע ה-DNA באוויר למשך 10 דקות.השביה מחדש כל משקע DNA בכ-25 µL של te. חמם בטמפרטורה של 65 °C למשך חמש דקות, ולאחר מכן העבר את כולם למבחנה אחת והשלם את הנפח ל-500 µL באמצעות te. הוסף polyethylene glycol, ערבב בעדינות על ידי הפיכה והדקר על קרח למשך 10 דקות.בצעו סנטריפוגה כדי לשקיע את ה-DNA. לאחר מכן, שטפו את ה-DNA ב-70% ethanol קר, הסירו והשליכו את הנוזל העליון (supernatant). ייבשו באוויר במשך 10 דקות, השביו 30 עד 50 µL של TE או מים בדרגת Pure/Molecular וחממו בטמפרטורה של 65 °C למשך חמש דקות.יש לשמור את ה-DNA בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. טבלה זו מציגה את תוצאות מדידת הריכוז והאיכות של DNA שהופק מהמעטפת המיקרוביאלית ההיפר-מליחית. הפרוטוקול הניב כ-2 µg של DNA לגרם של דגימת מעטפת, עם יחס A₂₆₀/A₂₈₀ של 1.6 ויחס A₂₆₀/A₂₃₀ של 0.7.למרות שיחסת ה-A 260 ל-230 נראתה נמוכה, במחקר נפרד לא נצפתה עיכוב באפליקציות מולקולריות המשך, כגון הגברה ב-PCR של גני ה-16 s ribosomal RNA; כאשר גודל ה-DNA נקבע באמצעות אלקטרופורזה בג'ל בשדה פולסי, התוצאות הצביעו על DNA בעל משקל מולקולרי גבוה או H-M-W-D-N-A של כ-35 עד 50 kilobases. כאן, נתיב M הוא סמן HMW ונתיבים 1 ו-2 הם חזרות של DNA מטגןומי שהופק מהמעטה ההיפר-סליני של ה-eleuthra. ניתן לגזור ולטהר את מריחת ה-DNA שמעל 35 kilobases לצורך שיבוט בווקטורים עם רצפים גדולים (large insert vector cloning) או אפליקציות מולקולריות מתאימות אחרות.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון שיבוט P-C-R-D-G-G-E או ריצוף DNA כדי לענות על שאלות נוספות, כגון מהו המגוון התפקודי של הקהילה המיקרוביאלית הנחקרת.

extraction-of-high-molecular-weight-dna-from-microbial-mats

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים שיטה להפקת גבוה הדנ"א הגנומי משקל מולקולרי מביומסה planktonic התרכז 0.22 מסננים מיקרומטר Sterivex, ואחריו צפיפות צזיום כלוריד צנטריפוגה שיפוע לטיהור.

הפקת DNA של 0.22 מיקרומטר מסננים Sterivex ו כלוריד צסיום צפיפות צנטריפוגה Gradient

מתודולוגיה לבודד משקל מולקולרי גבוה גבוה DNA הגנומי איכות מהקהילה חיידקים בקרקע מתואר.

הפקת DNA גבוהה מולקולרית משקל הגנום מקרקעות ו משקעים

וידאו זה מדגים את פרוטוקול להפקת דנ"א החומר פורמלין קבוע, פרפין, מוטבע. זהו הליך רב היום שבו חלקים רקמה deparaffinized עם קסילן, rehydrated עם אתנול שטופלו proteinase K לטהר לבודד DNA לצורך ניתוח גנטי ספציפי או הגנום כולו שלאחר מכן.

הפקת DNA מחומר פרפין Embedded עבור ניתוח גנטי epigenetic

שימוש בדרכי נשימת סיסטיק פיברוזיס כדוגמא, את כתב היד מציגה עבודה מקיפה הכוללת שילוב של גישות metagenomic וmetatranscriptomic לאפיין את החיידקים וקהילות נגיפיות בדגימות הקשורים לבעלי חיים.

טיהור הלא טהור: Metagenomes הרצף וMetatranscriptomes מדוגמאות הקשורים בבעלי חיים מורכבות

מתוארת כאן שיטה למיצוי, טיהור ובקרת איכות של DNA גנומי מהפתוגן הפטרייתי הביוטרופי המחייב, טחב אבקתי, לשימוש בריצוף גנום לקריאה ארוכה.

טיהור של ה- DNA הגנומי משקל מולקולרי גבוה מ אבקתי טחב על רצף ארוך לקריאה

אנו מציגים את תהליך הבידוד, ההתרבות והאפיון של חיידקים מפרקים פחמימנים מבתי גידול מימיים. הפרוטוקול מתאר בידוד חיידקים, זיהוי בשיטת 16S rRNA, ובדיקת פוטנציאל פירוק הפחמימנים שלהם. מאמר זה יסייע לחוקרים לאפיין מגוון ביולוגי מיקרוביאלי בדגימות סביבתיות, ובמיוחד לסנן מיקרובים בעלי פוטנציאל לריפוי ביולוגי.

בידוד, ריבוי וזיהוי של מיני חיידקים בעלי תכונות מטבוליזם פחמימני מבתי גידול מימיים

מאמר זה מתאר פרוטוקול למיצוי DNA דיאטומי באמצעות ערכת מיצוי DNA משותפת שונה.

מיצוי DNA דיאטום מדגימות מים ורקמות

כאן, אנו מציגים טכניקה פשוטה להערכת עמידות אנטי-מיקרוביאלית סביבתית (AMR) על-ידי שיפור שיעור הדנ"א החוץ תאי בעל משקל מולקולרי נמוך. טיפול קודם עם 20%-30% PEG ו-1.2 M NaCl מאפשר זיהוי של גנים AMR גנומיים ואופקיים. הפרוטוקול משאיל את עצמו לתהליך ללא ערכה עם אופטימיזציה נוספת.

מיצוי משופר של DNA במשקל מולקולרי נמוך משפכים להערכה מקיפה של עמידות מיקרוביאלית 

פרוטוקול זה מתאר את שיטת ה-CTAB לחילוץ DNA איכותי ממיקובקטריה, תוך התמודדות עם האתגרים שמציבים דפנות התאים הקשות והעשירות בחומצה המיקולית. התהליך כולל עיכול אנזימטי, פירוק תאים באמצעות CTAB, וטיהור DNA באמצעות הפקה אורגנית והשקעת אתנול. שיטה זו מייצרת DNA המתאים למחקרים מולקולריים ואמינה למחקר מיקובקטריאלי.

הפקת חומצה דאוקסיריבונוקלית בגנום מלא ממיני מיקובקטריום באמצעות טכניקת Cetyltrimethylammonium Bromide

ביולוגיה של הקהילות מיקרוביאלית - ראיון

למד שיטה משופרת לחילוץ DNA גבוה מולקולרית משקל ממחצלות מיקרוביאליות היפר-מלחיות. הפרוטוקול מפריד תאים מיקרוביאליים ממטריצת המחצלת לפני החילוץ, ומספק DNA איכותי לניתוחים גנומיים מתקדמים.

הפקת DNA גבוהה מולקולרית משקל של מאטס מיקרוביאלית

גלה סרטונים נוספים