הפקת DNA גבוהה מולקולרית משקל של מאטס מיקרוביאלית

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחלץ DNA במשקל מולקולרי גבוה ממחצלות מיקרוביאליות היפר-מלוחות. זה מושג על ידי הומוגניזציה וחילוץ תאים מיקרוביאליים מהמחצלת המיקרוביאלית. לאחר מכן משקרים את התאים המיקרוביאליים באמצעות הפשרה בהקפאה ומתודולוגיה כימית.

השלב הבא הוא הסרת פסולת תאים ו-RNA באמצעות מיצוי אורגני ו-RNA, ואחריו מיצוי DNA. השלב האחרון בהליך הוא משקעים וטיהור DNA. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות DNA בעל איכות וריכוז מולקולרי גבוהים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שיטות מיצוי DNA ישירות וקשות, הוא שהיא משתמשת ב-DNA בעל משקל מולקולרי גבוה מדגימה סביבתית מורכבת למחקרים מטגנומיים פונקציונליים. המפגש המיקרוביאלי ששימש במחקר זה הושג מבריכה היפר-מלוחה הממוקמת באלות'רה, איי בהאמה כדי לחלץ תאים מיקרוביאליים ממטריצת מחצלת הרקע מערבבים תחילה כ-30 גרם מחצלת ביסודיות ללא טחינה, עם עלי טחינה סטרילי. המחצלת הומוגנית ביסודיות כאשר לא ניתן לראות גושים בתערובת.

לאחר מכן, הכניסו את החומר המט ההומוגני לבלנדר והוסיפו כ -100 מיליליטר נתרן כלורי. מערבבים במהירות בינונית במשך דקה, ולאחר מכן מצננים דקה במינוס 20 מעלות. חזור על כך, ערבוב וקירור פעמיים נוספות בסיום המיזוג, העביר את התרחיץ לבקבוק צנטריפוגה של 250 מיליליטר ומלא את הנפח הריק שנותר בנתרן כלורי מולארי אחד.

מנערים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לאחר 30 דקות, צנטריפוגה את השפלה במהירות נמוכה למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן העבירו בעדינות את הסופרנטנט לבקבוק עם מינימום הפרעה למשקעים. הוסף נתרן כלורי טרי למשקעים הגלולים.

ערבבו שוב ונערו במשך 30 דקות. ואז צנטריפוגה כמו קודם, והעבירו את הסופרנטנט לבקבוק חדש. חזור על הוספת נתרן כלורי טרי, מיזוג צנטריפוגה והסרת סופרנטנט שלוש פעמים נוספות.

שלב את הסופרנטנטים מחמשת מיצוי התאים ואת הצנטריפוזיה של 200 מיליליטר במהירות גבוהה למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש כל כדור תא ב-10 מיליליטר של נתרן הקסמטפוספט. שלב את תרחיפי התאים מכל ארבעת הצינורות והוסף נתרן הקסמטפוספט כדי להרכיב את הנפח ל-200 מיליליטר.

שוטפים תאים על ידי ניעור בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר ניעור תאי צנטריפוגה במהירות גבוהה במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את גלולת התא ב -200 מיליליטר של תאי שטיפה, שוב על ידי ניעור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לבסוף, שוב צנטריפוגה במהירות גבוהה למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר השלכת ה-snat Resus, השעו את גלולת התא ב-15 מיליליטר של te הכינו 200 מיקרוליטר של תאים מיקרוביאליים. ניתן לאחסן תאים מיקרוביאליים בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד שיהיה צורך במיצוי DNA. כדי להתחיל בהליך לחילוץ וטיהור DNA מהתאים המיקרוביאליים, הוסף נתרן כלורי SDS ואתנול קפטו בימר לכל אחד מהתאים המיקרוביאליים של 200 מיקרוליטר.

מצטט שמונה צינורות בסך הכל. מערבבים בעדינות על ידי היפוך ארבע עד שש פעמים, טובלים את התערובת בחנקן נוזלי למשך שתי דקות, ולאחר מכן הפשרה בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, חוזרים על הטבילה בחנקן נוזלי ומפשירים בחום של 65 מעלות צלזיוס. עוד פעמיים.

הארכת ההפשרה הסופית ל -10 דקות. לאחר הסבב השלישי של הפשרת ההקפאה, מוסיפים 200 מיקרוליטר אשלגן אצטט לכל צינור ומניחים על קרח למשך 10 דקות. ואז צנטריפוגה ב-10,000 GS למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, השתמש בקצה פיפטה רחב כדי להעביר את הסופרנטנט לצינור חדש. מוסיפים שלושה מיקרוליטרים של RNA A ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר הדגירה של שעה, הוסף נפח שווה של כלורופורם.

לנער לזמן קצר על ידי היפוך וצנטריפוגה ב -15, 000 גרם למשך 10 דקות. בטמפרטורת החדר, העבירו את השכבה העליונה של הסופרנטנט לצינור חדש. חזור על הליך מיצוי הכלורופורם.

שוב, העבירו את השכבה העליונה של הסופרנטנט לצינור חדש. הוסף נפח שווה של איזופרופנול צונן לסופרנטנט ודגירה על קרח למשך 30 דקות. כדי לזרז את צנטריפוגת ה-DNA במהירות המקסימלית, כדי לגלול את ה-DNA, השליכו את הסופרנטנט ושטפו כל כדור DNA עם מיליליטר אחד של אתנול צונן.70%.

חזור על צנטריפוגת שטיפת אתנול 70% במהירות מקסימלית למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט. חזור על שטיפת אתנול 70% וייבש את כדור ה-DNA באוויר למשך 10 דקות.

השעו מחדש כל כדור DNA בכ-25 מיקרוליטר של te. מחממים בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, ואז משלבים לצינור אחד ומרכיבים את הנפח ל -500 מיקרוליטר עם te. מוסיפים פוליאתילן גליקול מעורבב בעדינות על ידי היפוך ודוגרים על קרח למשך 10 דקות.

צנטריפוגה לכדור ה-DNA. לאחר מכן הסר והשליך את הסופרנטנט לאחר שטיפת ה-DNA עם צונן. 70% אתנול יבש באוויר למשך 10 דקות, השהה מחדש ו-30 עד 50 מיקרוליטר של TE או מים בדרגה מולקולרית והתחמם ב-65 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

אחסן את ה- DNA במינוס 80 מעלות צלזיוס. טבלה זו מציגה את תוצאות מדידת הריכוז והאיכות של ה-DNA המופק ממחצלת ההיפר-מלח המיקרוביאלית. הפרוטוקול הניב כשני מיקרוגרם של DNA לגרם של דגימת מחצלת עם יחס של A 2 60 ל-2 80 של 1.6 ויחס A 2 60 ל-2 30 של 0.7.

למרות שהיחס A שניים 60 לשניים 30 נראה נמוך, לא נצפתה עיכוב של יישומים מבוססי מולקולרית במורד הזרם כגון הגברת PCR של גני ה-RNA הריבוזומלי 16 s במחקר נפרד כאשר גודל ה-DNA נקבע באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל שדה דופק, התוצאות מצביעות על משקל מולקולרי גבוה או H-M-W-D-N-A של כ-35 עד 50 קילו-בסיסים. כאן, נתיב M הוא סמן HMW ונתיבים 1 ו-2 הם שכפולים של DNA מטאגנומי המופק ממחצלת ההיפר-מלח eleuthra. ניתן לכרות ולטהר את מריחת ה-DNA מעל 35 קילו-בסיסים לצורך שיבוט וקטור הכנסה גדול או יישומים מולקולריים מתאימים אחרים.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון שיבוט P-C-R-D-G-G-E או ריצוף DNA על מנת לענות על שאלות נוספות כמו מהו המגוון התפקודי של הקהילה המיקרוביאלית הנחקרת.