Name: אינדוקציה ובדיקה של היפוקסיה בתרבות התא (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: למדו שיטות לאינדוקציה של היפוקסיה בתרביות תאים באמצעות כלוריד קובלט ומדידת ביטוי HIF-1 alpha. הפרוטוקול כולל שימוש באינקובטור היפוקסיה וניתוח Western blot לבדיקת מצב התאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. היפוקסיה המושרה על ידי פתרון 2 CoCl קובלט (II) hexahydrate כלוריד (CoCl 2 • 6 שעות 2 O, מגה = 237.9) הוא inducer הכימי של היפוקסיה, גורם ועין מתנהלת 1.3-8. מוצר זה הוא מסיס במים (100 מ"ג / מ"ל), מניב פתרון ברור, אדום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות 25mm במים dd סטרילי, (להכין מיד לפני השימוש) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש CoCl 2 בריכוז הסופי של 100μM בתרבות המדיה שלך סדיר תא לגרום היפוקסיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את CoCl 2 מדיה המכילה תאים שלך דגירה התרבויות עבור 24hours בתוך חממה קונבנציונאלי (37 ° C; 2 C0 5%). </li></ol> הריכוז הנ"ל עובד עבור שורות תאים בדקנו אבל כל שורת תאים יש לבדוק בריכוזים שונים (להקים עקומת המינון תלוי), כמו גם בזמנים דגירה שונים, במטרה לצמצם רעילות התרופה הקשורות לייעל את assay. 2. היפוקסיה המושרה מודולרי החממה הקאמרית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן לפחות שני בתרביות תאים זהים (תרבות תאומים). תרביות תאים יכול להיות צלוחיות, צלחות או כלים התרבות. כדי לפתוח את החדר, פתח תחילה את שני מהדק פלסטיק לבן הממוקם על צינורות המחוברים תא (צינורות המשמשים הזריקה / טיהור הגז hypoxic) בעדינות לפתוח את מהדק טבעת פלדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר את מהדק. המכסה ומגשים כעת ניתן להסיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התרבות התאים בתא hypoxic. כמו כן במקום צלחת פטרי המכילה מים סטריליים בחדר לספק humidification נאותה התרבויות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את תרבות "התאום" תא normoxia כמו שליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא המגשים שלך מובטחות ולא נעים, ולאחר מכן סגור את תא עם מכסה שלו. נכונה עמדת מהדק טבעת פלדה כדי להבטיח את סגירת hermetical של החדר וסגור אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור היפוקסיה, לצרף את צינורות עד "טנק היפוקסיה" המכיל 1% O 2 תערובת הגזים. אם יש לך מד זרימת מחובר הטנק שלך בחדר שלך יהיה מחובר ישירות אליו (טנקים זרימת הגז מטר קאמרית). אנו משתמשים מד זרימת שולבו הרגולטור שלנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב להסיר את רוב אם לא כל הנוכחים חמצן בתא ובתקשורת שלך, לעשות זאת לשטוף את החדר על ידי פתיחת מיכל הדלק בקצב זרימה של 20 ליטר דקות 70-10 דקות, ואז מהר לכבות את דלק הזרימה לגמרי לסגור את חדר על ידי סגירת שני מלחציים לבן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את תא אל חממה קונבנציונאלי לתקופה הרצויה של זמן. אם אתה משתמש תרבויות גדולות, לאפשר התקשורת בתרבויות דה גז במשך 1-2 שעות ולאחר מכן חזור על לשטוף. הצעדים שלעיל מבוססים על המלצות בנאי "(Billups-רוטנברג, Inc). הקפד מיכל הדלק מאובטחים כראוי בכל עת. </li></ol> הערות: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחסל את O 2 הכלול התקשורת מומלץ גז מחדש את החדר פעם אחת לאחר 1-3hours. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זמן הדגירה יותר 48hours מומלץ גם לחדר מחדש גז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיישני חמצן (אלקטרודות / מד הלחץ), אשר מאפשרים מדידות של O 2 הכלול תאים / תא תספק מדידה מדויקת יותר של תאיים / תא O 2 מכילים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים culturing ב אורכים זמן שונים כדי ליצור זמן עקומת יעזור לקבוע את הביטוי זמן אופטימלי של HIF-1α בתאים הספציפית שלך. </li></ul> 3. הערכה של היפוקסיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HIF-1 α זיהוי על ידי כתם המערבי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח מחדש החדר שלך כמתואר בסעיף 2.2 ומיד המקום תרבויות שלך על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse תאים שטופלו ולא טופלו היפוקסיה עם פתרון SDS 5% הצלחות מכן להעביר את lyzate התא צינורות, sonicate, spindown פסולת התא לאסוף את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידת ריכוז חלבון באמצעות ערכת BCA, להכין מדגם ידי הוספת מאגר טעינת וחימום ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electrophorese חלבונים על ג'ל SDS-polyacrylamide 8% ולהעביר ממברנות Nitrocellulose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את הממברנה ב PBS המכילה 5% שומן חלב שאינו יבש 0.1% Tween 20 בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 או 4 ° C במשך הלילה על שייקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Immunoblot לילה עם נוגדן אנטי-HIF 1α חד שבטיים העיקרית (1 / 600) במאגר באותו 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים PBS המכיל 0.1% Tween 20 בטמפרטורת החדר, 5min כל זמן דגירה עם נוגדן HRP-משנית (1 / 2000) ב-PBS + 0.1% Tween 20 דקות 45. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים PBS המכיל 0.1% Tween 20 בטמפרטורת החדר, 5min / שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פירס ECL ערכת רנטגן הסרט להראות את הלהקה חלבון </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלמנט Responsive היפוקסיה (HRE). HIF-1α מסדיר גנים רבים (כלומר VEGF, EPO) על ידי קשירה רצף שנקרא אלמנט הסדרת היפוקסיה (HRE). HRE שימוש הקשורים לגן סמן iלא ניתן לזהות פעילות HIF 9. כדי להשתמש בשיטה זו, תחילה עליך transfect התאים שלך עם HRE-בלוציפראז הפלסמיד בשיטת transfection מותאם לתאים. לדוגמה השתמשנו Lipofectamine 2000. תאים צריכים להיות transfected לפחות 4 שעות לפני כדי להיות מודגרות ב היפוקסיה ו normoxia. זמן זה מאפשר ה-DNA כדי להזין את התאים כך זה הצעד הראשון אינו מושפע היפוקסיה. האות בלוציפראז מזוהה באמצעות ערכת Assay בלוציפראז. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים HRE-transfected שלך היפוקסיה בתא מודולרי או להשתמש HRE-transfected תאים מודגרות עם CoCl 2, כוללים שליטה normoxia. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת הדגירה הרצויה, להסיר בינוני צמיחה של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את התאים PBS, להסיר את PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 400μl מגיב תמוגה 1X לתוך צלחת תרבות לגרד תאים המצורפת, ולאחר מכן להעביר אותם צינורית המיקרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה פסולת על ידי צנטריפוגה קצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20μl מיקס של התא lysates supernatant עם 100μl של מגיב Assay בלוציפראז ולמדוד את הארה באמצעות luminometer. </li></ol></li></ol> 4. נציג תוצאות: ב K562 תאים (קו אנושי תא לוקמיה) בתרבית 2 ימים חמצן נמוכה, לעומת normoxia, היפוקסיה גורם גידול של החלבון HIF-1α כי זוהה על ידי כתם המערבי (איור 1). שימוש ב-HRE בלוציפראז שונה 293 תאים (קו עובריים כליות) בתרבית היפוקסיה, עלייה משמעותית של פעילות HIF-1α זוהתה בתאי hypoxic (איור 2). <img src="/files/ftp_upload/2899/2899fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> איור 1: הגדלת HIF-1α בתאים hypoxic. K562 התאים היו תרבות normoxia ו היפוקסיה (חוסר חמצן קאמרית) עבור 48 שעות ונותחו על ידי כתם המערבי באמצעות נוגדן ספציפי HIF-1α. נוגדנים ספציפיים עבור אקטין שימש לשלוט הטעינה. <img src="/files/ftp_upload/2899/2899fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> Figure2: HIF-1α פעילות. HRE-בלוציפראז שונה היו 293 תאים בתרבית היפוקסיה ו normoxia עבור 48 שעות ו lysed אז לזהות אות בלוציפראז באמצעות ערכת assay בלוציפראז ו luminometer. תוצאות באים לידי ביטוי כיחידה הארה יחסית (RLU).

<ol><li>Swinson, D. E., O'Byrne, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+hypoxia+and+epidermal+growth+factor+receptor+in+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Interactions between hypoxia and epidermal growth factor receptor in non-small-cell lung cancer.</a> Clin Lung Cancer. 7, 250-256 (2006).</li>
<li>van Laarhoven, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+in+relation+to+vasculature+and+proliferation+in+liver+metastases+in+patients+with+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Oncol+Biol+Phys%22%5BJournal%5D)">Hypoxia in relation to vasculature and proliferation in liver metastases in patients with colorectal cancer.</a> Int J Radiat Oncol Biol Phys. 64, 473-482 (2006).</li>
<li>Hockel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumoral+pO2+predicts+survival+in+advanced+cancer+of+the+uterine+cervix%5BTitle%5D)+AND+%22Radiother+Oncol%22%5BJournal%5D)">Intratumoral pO2 predicts survival in advanced cancer of the uterine cervix.</a> Radiother Oncol. 26, 45-50 (1993).</li>
<li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIF-1+and+human+disease%3A+one+highly+involved+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">HIF-1 and human disease: one highly involved factor.</a> Genes Dev. 14, 1983-1991 (2000).</li>
<li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factor+1%3A+master+regulator+of+O2+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factor 1: master regulator of O2 homeostasis.</a> Curr Opin Genet Dev. 8, 588-594 (1998).</li>
<li>Tatum, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia%3A+importance+in+tumor+biology%2C+noninvasive+measurement+by+imaging%2C+and+value+of+its+measurement+in+the+management+of+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Hypoxia: importance in tumor biology, noninvasive measurement by imaging, and value of its measurement in the management of cancer therapy.</a> Int J Radiat Biol. 82, 699-757 (2006).</li>
<li>Brahimi-Horn, M. C., Pouyssegur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIF+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">HIF at a glance.</a> J Cell Sci. 122, 1055-1057 (2009).</li>
<li>Piret, J. P., Mottet, D., Raes, M., Michiels, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CoCl2%2C+a+chemical+inducer+of+hypoxia-inducible+factor-1%2C+and+hypoxia+reduce+apoptotic+cell+death+in+hepatoma+cell+line+HepG2%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">CoCl2, a chemical inducer of hypoxia-inducible factor-1, and hypoxia reduce apoptotic cell death in hepatoma cell line HepG2.</a> Ann N Y Acad Sci. 973, 443-447 (2002).</li>
<li>Emerling, B. M., Weinberg, F., Liu, J. L., Mak, T. W., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTEN+regulates+p300-dependent+hypoxia-inducible+factor+1+transcriptional+activity+through+Forkhead+transcription+factor+3a+%28FOXO3a%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PTEN regulates p300-dependent hypoxia-inducible factor 1 transcriptional activity through Forkhead transcription factor 3a (FOXO3a).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 2622-2627 (2008).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

התפשטות תאים הכדאיות בתנאים hypoxic להשתנות הרבה בהתאם לסוגי תאים. לכן, כדאי להתאים את מספר הנייד או מספר צלחות תרבויות אתה מתחיל עם לוודא יהיה לך מספיק תאים / חלבונים עבור הניסויים שלך. השיטה קובלט כלוריד יש את היתרון להיות זול ומהיר. מוצר זה מחקה היפוקסיה ידי גרימת HIF-1/3α אך ניתן גם להסדיר גנים אחרים, יש לוודא כי מוצר זה להתאים את הפרוייקט על ידי בדיקת מה תופעות אחרות זה היה יכול להיות על התפקוד ואת הפנוטיפ של תאים מסוימים באופן עצמאי של &quot;לחקות- אפקט hypoxic &quot;. עוד תרופה המשמשת גם לחקות היפוקסיה היא mesylate Deferoxamine (DFO, השתמשו בריכוז 100 מיקרומטר הסופי). השימוש בתרופות אלה מאפשר experimentator כדי לפתוח את צלחת תרבות / תבשיל / בקבוקון פעמים רבות מבלי להשפיע על &quot;מצב hypoxic&quot;. רמת החמצן הכלול תערובת הגז יכול להשתנות בהתאם הניסויים שלך סוגי תאים כערכים היפוקסיה להשתנות בהתאם הרקמות סוגי תאים. ואכן, תאים מסוימים hypoxic ב 5% O 2 צריך אחרים פחות מ 1% O 2 להיות hypoxic. 5% CO 2 הוא הוסיף תערובת הגז כדי לייצב את pH של התרבויות, שאר הגז הוא בדרך כלל חנקן. לתאי hypoxic יש את היתרון של שימוש בסמים לא יכול חלופי התנהגות התא עצמאי של מתח החמצן. עם זאת, לא כל סוגי ניסויים אפשר לעשות כמו חמצן החוזרת בפתיחת כל תא ובכך מפחית היפוקסיה. אתה צריך לשקול גורם זה בניסויים שלך; היפוקסיה / מחדש חמצון הוא מצב ספציפי אשר יכולים להשפיע על כמה סוגי תאים. חלופה היא להשתמש בתחנות עבודה היפוקסיה (מחובר טרום מעורבת בלוני גז או למערכות גז ערבוב) או היפוקסיה אינקובטור גדול (תא עיבוד היפוקסיה עם תא הכפפות) המאפשר ניסויים לשנות את התקשורת ולטפל תאים בסביבה hypoxic רציפה. לתאי hypoxic שונים כבר ממוסחר בעשור האחרון ו צריכים להיבחר על פי המעבדה שלך בשימוש, פרויקטים, מרחב, גודל התקציב. תמיד להבטיח את השימוש במצב טוב של החדר שלך כדי להבטיח את התנאים תרבות נכונה. באופן כללי בעת שימוש קאמרית, רמת היפוקסיה יכול להיות מווסתת על ידי בחירת תערובות גזים שונות (כלומר 1%, 5% -10% חמצן). לגבי זיהוי של HIF-1α, חשוב לדעת כי חלק קו תאים סרטניים לבטא HIF-1α ב normoxia. לכן זה קריטי להשתמש normoxia שליטה לקבוע את רמת הבסיס של HIF אלה שורות תאים. HIF-1α יכול גם להיות נוכח normoxia שאינם תאים ממאירים הבאים גירוי התא או מתח. זה יכול להתרחש גם אם תאים אלה הם מורעבים, ודא בתרביות תאים שלך כמו שצריך להאכיל ומתוחזק.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> Anti-HIF-1α </td><td> Invitrogen </td><td> 458400 </td></tr><tr><td> קובלט (II) כלוריד </td><td> סיגמא </td><td> C8661-25 גרם </td></tr><tr><td> החממה הקאמרית </td><td> Billups-רוטנברג </td><td> MIC-101 </td></tr><tr><td> HRE-בלוציפראז פלסמיד </td><td> Adgene </td><td> פלסמיד 26731 </td></tr></tbody></table>

אינדוקציה ובדיקה של היפוקסיה בתרבות התא

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

היפוקסיה מוגדרת הפחתה או חוסר חמצן איברים, רקמות, או תאים. זו ירידה של מתח החמצן יכול להיות בשל אספקת חמצן מופחת (סיבות כוללות כלי דם מספקת הרשת, כלי דם פגומים, ואנמיה) או לצריכה מוגברת של חמצן ביחס לאספקת (הנגרם על ידי קצב התפשטות פתאומית גבוהה התא) . היפוקסיה יכול להיות פיזיולוגי או פתולוגי כגון סרטן מוצק 1-3, וכו &#39;שגרונית, דלקת פרקים טרשת עורקים ... כל רקמות ותאים יש יכולת שונה להסתגל למצב החדש הזה. במהלך היפוקסיה, גורם היפוקסיה ועין מתנהלת אלפא (HIF) הוא התייצב מסדיר גנים שונים כגון המעורבים אנגיוגנזה או הובלה של חמצן 4. ההתייצבות של חלבון זה הוא סימן ההיכר של היפוקסיה, ולכן גילוי HIF משמש באופן שגרתי למסך עבור 5-7 היפוקסיה. במאמר זה, אנו מציעים שתי שיטות פשוטות לגרום היפוקסיה בתרביות תאים יונקים בדיקות פשוטות על מנת להעריך את מצב hypoxic של תאים אלה.

כאן אנו מציעים שיטות פשוטות לגרום היפוקסיה בתרביות תאים ו בדיקות פשוטות על מנת להעריך את מצב hypoxic של תרבויות.

היפוקסיה מוגדרת כהפחתה או כמחסור בחמצן באיברים, ברקמות או בתאים. ירידה זו בלחץ החמצן יכולה לנבוע מאספקה מופחתת ב...

המטרה הכללית של הליך זה היא להשרות היפוקסיה בתרבית תאים. דבר זה מושג תחילה על ידי גידול תאים בנוכחות של משרה כימי של גורם היפוקסיה השריר inducible factor one hypoxia, או על ידי גידול התאים באינקובטור היפוקסיה או בתא מלא בתערובת גזים מיוחדת. לאחר מכן, ההיפוקסיה מזוהה על ידי אימות רמת הביטוי של HIF one alpha בתמציות חלבון של תאים, או על ידי מדידת פעילותו באמצעות וקטור ENC המקודד לרצפי קישור של hi one alpha.בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות עלייה ברמות הביטוי ובפעילות של HIF one alpha באמצעות western blotting וגילוי לומנס (luminescence). שמי דני U. אני חוקר במעבדה של Patrizia Inda. היום אדגים את הפרוצדורה להשראת היפוקסיה באמצעות קובלט כלוריד.התחילו בהכנת תמיסת מלאי של cobalt chloride בריכוז 25 millimolar במים מזוקקים כפולים סטריליים. הוסיפו את התמיסה לתאים וגדלו אותם בריכוז סופי של 100 µM. דגרו את התאים למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2 כדי להשרות היפוקסיה.באמצעות תא דגירה מודולרי, הכינו לפחות שתי תרביות תאים זהות. עם זאת, מומלץ לבצע שלושה חזרות לכל תנאי. פתחו את תא הדגירה המודולרי על ידי פתיחה ראשונית של שני תסמיכי הפלסטיק הלבנים הממוקמים על הפצצות המחוברות לתא, והסירו את המכסה ואת המגשים.הניחו את תרבית התאים בתא ההיפוקסי, כאשר בתוך התא נמצאת צלחת פטרי המכילה מים סטריליים כדי לספק לחות הולמת לתרביות. הניחו את תרבית התאים השנייה בתנאי Normoxia כביקורת להשראת היפוקסיה. חברו את הצינורית למיכל היפוקסיה המכיל תערובת גזים עם 1% oxygen.אם מחובר מד-זרימה למיכל שלכם, התא יחובר אליו באופן ישיר. אנו משתמשים במד-זרימה המובנה בווסת שלנו כדי להסיר את כל החמצן הנמצא בתא ובמצע. שטפו את התא על ידי פתיחת מיכל הגז בקצב זרימה של 20 liters per minute למשך ארבע עד שבע דקות.לאחר מכן, הפסיקו במהירות את זרימת הגז וסגרו את התא לחלוטין, באמצעות סגירת שני התפסים הלבנים. החזירו את התא לאינקובטור קונבנציונלי למשך פרק הזמן הרצוי.במידה ומשתמשים בתרביות גדולות, המתינו שהמצע והתרביות יגיעו לשיווי משקל של גזים (DGAs) במשך שעה עד שעתיים, ולאחר מכן חזרו על השטיפה כדי להעריך היפוקסיה. באמצעות זיהוי HIF one alpha באמצעות western blot, פתחו מחדש את התא כפי שהודגם קודם לכן והניחו מיד את התרביות על קרח. השתמשו בתמיסת 5% SDS עבור התאים שעברו טיפול בהיפוקסיה ואלו שלא טופלו.לאחר מכן, העבירו את הליזאטים למבחנות ובצעו סוניקציה לחילוץ החלבונים, סנטריגו להסמכת שקיעי התאים ואספו את הסופרנטנט. בשלב הבא, מדדו את ריכוז החלבון באמצעות ערכת BCA. לאחר מכן, הכינו דגימה לג'ל על ידי הוספת בופר טעינה וחימום בטמפרטורה של 95 °C למשך חמש דקות.הפרידו את החלבונים על ג'ל פוליאקרילאמיד 8% SDS והעבירו אותם לממברנת ניטרוסלולוז. חסמו את הממברנה ב-PBS המכיל 5% חלב רזה ללא שומן ו-0.1% tween 20 בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת, או בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך לילה על שייקר. דגרו את הבלוט למשך לילה עם נוגדן ראשוני מונוקלונאלי נגד HIF one alpha באותו באפר בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.ביום למחרת. יש לשטוף את הבלוט שלוש פעמים למשך חמש דקות בכל פעם ב-PBS המכיל 0.1%tween 20 בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להדגיר עם נוגדן משני HRP ב-PBS בתוספת 0.1%tween 20 למשך 45 דקות. יש לשטוף שלוש פעמים למשך חמש דקות בכל פעם ב-PBS המכיל 0.1%tween 20 בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, הדגרירו את הממברנה בתמיסות זיהוי כימילומנסינטיות וחשפו אותה לסרט רנטגן כדי למדוד את פעילות הלוקיפראז. הסירו את מצע הגידול מהתאים בתרבית. שטפו את התאים ב-PBS.לאחר מכן, הוסיפו 400 µL של ריאגנט ליזיס בריכוז 1x אל צלח התרבית. גרדו את התאים הדבקים והעבירו אותם למבחנה (micro tube). השקיעו את השאריות באמצעות צנטריפוגה קצרה.ערבבו 20 µL של על-נוזל (supernatant) מליסאט של תאים עם מאה µL של ריאגנט לבדיקת לוסיפראז, ומדדו את הלומינסנציה באמצעות לומינומטר. תאי K 5 62 תורחמו בתנאי נורמוקסיה או היפוקסיה למשך 48 שעות ונותחו באמצעות western blot תוך שימוש בנוגדן ספציפי ל-H one alpha. נוגדן ספציפי ל-beta actin שימש כביקורת טעינה (loading control).התוצאות מראות עלייה ב-HIF-1 alpha בתאים היפוקסיים. תאי HRE Luciferase modified 2 93 תורגדו בתנאי היפוקסיה או נורמוקסיה למשך 48 שעות, ולאחר מכן נדגמו כדי לזהות אות לוסיפראז באמצעות ערכה לבדיקת לוסיפראז ולומינומטר. עלייה בפעילות של HIF-1 alpha זוהתה גם בתאים היפוקסיים.התוצאות מבוטאות כלומינסנציה יחסית. יחידות. זכרו כי עבודה עם גז מדויק עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות בעת ביצוע הליך זה, כגון קיבוע תקין של מיכל החמצן לקיר או לספסון המעבדה, פתיחה וסגירה נכונה של מיכל החמצן, וכן בקרת לחץ.

induction-and-testing-of-hypoxia-in-cell-culture

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הדמיה של פליטת אור ועין מתנהלת פעילות היפוקסיה, גורם 1α מוחל לפקח היפוקסיה תוך גולגולתי התפתחות גידולים של סרטן השד מודל גרורות במוח העכבר.

בתחום ההדמיה vivo של פליטת אור Dynamics היפוקסיה גידול של גרורות סרטן השד המוח במודל של עכברים

כאן, אנו מתארים מתודולוגיה לבצע siRNA ממוקד מסך "ubiquitome" לזהות היוביקוויטין רומן ורגולטורים כמו היוביקוויטין של התגובה התאית בתיווך HIF1A להיפוקסיה. זה יכול להיות מותאם לכל מסלול ביולוגי שבו חזקה לקריאה מהפעילות העיתונאית היא זמינה.

הקרנת siRNA לזיהוי יוביקוויטין ורגולטורים מערכת דמויות יוביקוויטין של מסלולים ביולוגיים בתאי יונקים בתרבית

מאמר זה מתאר את המתודולוגיה לניהול תקופות קצרות של היפוקסיה לסירוגין לגורי עכבר או עכברוש לאחר לידה היום 1-8. גישה זו ביעילות מעוררת רמה חזקה רקמה "תחול השפעה" על תאים עצביים בתרבית שנקצרים בתוך 30 דקות של חשיפת היפוקסיה.

משלוח<em&gt; In vivo</em&gt; חריפה לסירוגין היפוקסיה בילוד מכרסמים לתא תרבויות עצבית אב נגזרות אזור ראש Subventricular

כתב יד זה מציג מודל ייחודי במבחנה של תאי ציטוטרופובלסט אנושיים מטוהרים חיסונית שגודלו תחת היפוקסיה/חמצון מחדש. מודל זה מתאים לחקר ההשפעות המגנות של טיפולים מבטיחים, כגון מלטונין, על סיבוכי הריון הקשורים למתח חמצוני מוגבר ושינוי בתפקוד השליה.

ראשוניים האדם Trophoblast דגם תרבית תאים כדי לחקור את ההשפעות המגנות של מלטונין נגד היפוקסיה / נגרמת reoxygenation שיבוש

כתב יד זה מתאר פיתוח של מודל בבעלי חיים המאפשר בדיקה ישירה של השפעות היפוקסיה של הגידול על גרורות ופענוח מנגנוני פעולתה. למרות שהניסויים המתוארים כאן מתמקדים בסרקומה של יואינג, ניתן ליישם גישה דומה על סוגי גידולים אחרים.

In vivo מודל השפעת בדיקה של היפוקסיה על גרורות של גידולים

אנו מציגים מערכת קאמרית היפוקרטית חדש לשימוש עם אורגניזמים ימיים כגון צפרדע ועופות דג הזברה. המערכת שלנו היא פשוטה, חזקים, חסכונית ומאפשר אינדוקציה וקיימות של היפוקסיה in vivo ועד 48 שעות. אנו מציגים 2 שיטות לשחזור כדי לפקח על היעילות של היפוקסיה.

אינדוקציה של היפוקסיה צפרדע חיה דג הזברה עוברי

כאן נתאר פרוטוקול co-immunoprecipitation ללמוד אינטראקציות חלבון בין חלבונים גרעיניים אנדוגני בתנאים ובשפתיים. שיטה זו מתאימה הפגנה של אינטראקציות בין גורמי שעתוק גנים ברמת השעתוק הרגולטורים שותף ב היפוקסיה.

Co-immunoprecipitation Assay באמצעות חלבונים גרעיניים אנדוגני מתאי תרבותי בתנאים ובשפתיים

מרחק מרחבי הוא פרמטר מרכזי בהערכת פגיעה היפוקסיה/ראוקסיגניה במודל של תרבות משותפת של שכבות תאי אנדותל וקרדיומיוציטים נפרדות, מה שמרמז, לראשונה, כי אופטימיזציה של הסביבה המרחבית של תרבות משותפת נחוצה כדי לספק מודל הפריה חוץ גופית חיובי לבדיקת התפקיד של תאי אנדותל בהגנה על קרדיומיוציטים.

פיתוח מודל של תרבות משותפת של תאים כדי לחקות איסכמיה לב/רפרטפוזיה במבחנה במבחנה

אנו מציגים מכשיר חדשני למדידת קצבי צריכת חמצן (OCR) בתרביות אפיתל פיגמנט ברשתית (RPE). המכשיר יכול למדוד OCR במשך שבועות בכל פעם על RPE גדל על לוחות תרבית תאים סטנדרטיים עם מדיה סטנדרטית בעוד הלוחות נמצאים באינקובטור תרבית תאים סטנדרטי.

ניטור ארוך טווח של שיעורי צריכת החמצן בתרביות אפיתל פיגמנט רשתית מובחנות ומקוטבות מאוד

כאן, אנו מתארים פרוטוקול חוץ גופני למידול נזקי היפוקסיה/חמצון מחדש בתאי אפיתל פרוקסימליים פרוקסימליים מטבוליים מאוד. מודל זה נועד לגרום לנזק שנגרם מלחץ מטבולי, שניתן למדוד באמצעות ביטוי סמני נזק לצינורות הפרוקסימליים והערכת תפקוד הנשימה המיטוכונדריאלי.

מידול פגיעות היפוקסיה/חמצון מחדש בתאי אפיתל צינוריים פרוקסימליים

למדו שיטות לאינדוקציה של היפוקסיה בתרביות תאים באמצעות כלוריד קובלט ומדידת ביטוי HIF-1 alpha. הפרוטוקול כולל שימוש באינקובטור היפוקסיה וניתוח Western blot לבדיקת מצב התאים.

אינדוקציה ובדיקה של היפוקסיה בתרבות התא

גלה סרטונים נוספים