Name: Microiontophoresis ו המיקרומניפולציה עבור דימות פלואורסצנטי Intravital של microcirculation (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: למד מיקרו-יונטופורזיס לשחרור אצטילכולין באתרים ספציפיים במיקרו-מחזור הדם. טכניקה זו מאפשרת מחקר אותות תאיים בווסת זרימת הדם וביולוגיה וסקולרית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

מחקר במעבדה של המחברים הוא נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות מענקים R37-HL041026, R01-R01 HL086483 ו-HL056786 (SSS) ועל ידי F32-HL097463 ו-T32 AR048523 (PB) משירות ארצות הברית לבריאות הציבור.

1. Animal Care ושימוש בעקבות סקירה ואישור של טיפוח בעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש, עכברים זכרים לפחות 12 שבועות משמשים. העכבר הוא הרדים עם נתרן pentobarbital (60 מ"ג / ק"ג) באמצעות הזרקה (IP) intraperitoneal. במהלך ניתוחים ופרוטוקולים ניסיוני, הרדמה מתוחזק על ידי תוספי מזון (10-20% של הזרקת הראשוני, ip) לפי הצורך (כל 30-60 דקות, שמסומן על ידי תגובת נסיגה הבוהן או קמצוץ הזנב). לאחר השלמת הליך הניסוי העכבר הוא מנת יתר עם pentobarbital (IP) מורדמים על ידי נקע בצוואר הרחם. 2. Micropipettes ו Microiontophoresis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Micropipettes Microiontophoresis (קוטר קצה פנימי, ~ 1 מיקרומטר) מוכנים מן צינורות זכוכית בורוסיליקט נימי בעזרת פיפטה חולץ אופקי. שלנו יש ~ 5 להתחדד מ"מ עבור נוקשות; נרות יותר גמישים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Micropipettes הם backfilled עם 1M ACH (Figure1A-C) מומס 18.2 MΩ מים. בשביל למלא את משבצות, צינור microcapillary מחובר לסנן 0.2 מיקרומטר מצמידים את מזרק המכיל את אגוניסט של עניין (איור 1). אלה יכולים להיות מפוברק בקלות (להלן) או נרכשו מיצרנים מסחריים. צינור microcapillary מוכנס לתוך האחורי של הפתרון micropipette ו ACH מועבר לתוך לומן תוך הוצאת צינור microcapillary כמו micropipette ממלא. החזקת micropipette עם קצהו כלפי מטה, בועות אוויר יוסרו על ידי מצליף בעדינות micropipette. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Micropipette מובטחת בפומית רכוב micromanipulator (איור 2). לבעל יש חוט כסף חיבור פתרון אח בתוך micropipette להצמיד חיצוני, אשר בתורו מחובר להדק החיובי של מתכנת microiontophoresis. חוט כסף second מאובטח בקצה הכנת הרקמה מחובר למסוף השלילית כדי להשלים את המעגל כמו קצה micropipette הוא התקדם לתוך הפתרון מלח פיזיולוגיים על ההכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנוכחי תמך מוחל על מנת למנוע התרחבות (או בתגובה ניאון) כאשר קצה micropipette ממוקמת צמוד לקיר arteriolar. שימור הנוכחית תשתנה בהתאם לגודל של קצה micropipette (קוטר פנימי = 1 מיקרומטר) וריכוז אגוניסט אך ניתנת לשחזור מאוד פרמטרים מוגדרים (אנו משתמשים ~ 200 NA עבור 1M אח, טיפ 1 מיקרומטר). הנוכחי שמירה חדל ביחד עם משלוח של פליטה הנוכחי באמצעות ההדק אלקטרוניים (איור משלים 1) מסונכרן עם תחילת הרכישה של התמונה. </li></ol> 3. המיקרומניפולציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלטפורמה אישית לשלב מיקרוסקופ XY היה מפוברק מתוך נירוסטה פרומגנטי. ממדים פלטפורמה (1 / 8 "X 12" X 13 ") לאפשר מרחב מספיק כדי micromanipulators עמדה סביב הכנת הניסוי כפי Micromanipulators הרצוי (איור 2 א). מאובטחת לבסיסי מגנטי (תרשים 2B) לאפשר מיצוב כפי שמחייבת הכנה. אלה ממוקם ישירות סביב ההכנות micropipettes מיצוב באתרים בעלי עניין (איור 2C) על פלטפורמה מפוברק. </li></ol> 4. נציג תוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם קצה micropipette ממוקם בסמוך עורקיק, יש תגובה פלואורסצנטי ACH (שמירה הנוכחי מאשר מותאם כדי למנוע דליפה ACH). מתחת לסף גירוי היתה שום השפעה. עם זאת, כמו גירוי בעוצמה מוגברת, פלואורסצנטי תא האנדותל סידן מוגברת על פני מרחקים בהדרגה יותר לאורך עורקיק, כמו גם את עוצמת הקרינה באתר של גירוי (איור 3). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2900/2900fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. שיטה למלא את משבצות pipettes Microiontophoresis. א) צינור microcapillary (חץ ירוק) הוא מאובטח ב הולם דחיסה (חץ כחול) המצורפים 0.2 מיקרומטר מסנן (חץ סגול), אשר מחוברת אז מזרק מלא 1M אח. B) צינור microcapillary מוזן לתוך פיפטה microiontophoresis עד סוף פתרון לאחור הוא העקורים כדי למלא את לומן של micropipette. C) לאחר פיפטה מלא, החזק את קצה מטה בעדינות קפיצי להתחדד לעיל כדי להסיר בועות (חץ שחור). <img src="/files/ftp_upload/2900/2900fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. פלטפורמה אישית עבור מיקום Micromanipulator. ..) פלטפורמה פרומגנטי נירוסטה הושם על בסיס MVX10 אישית מיקרוסקופ המכיל הבמה XY translational B) בסיסים מגנטי חוזר מודבקת בתחתית 3-ציר micromanipulators קומפקטי C) Micromanipulators ממוקם סביב הכנת הניסוי (ראה פרוטוקול קשורים: מזהה יופיטר # 2874) ללמוד לאתרים ספציפיים של עניין.גודל ir צדדיות קומפקטי לאפשר micropipettes מרובים כדי לשמש בעת ובעונה אחת. <img src="/files/ftp_upload/2900/2900fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. Fluorescence סידן Arterioles. הקרינה של סידן לתאי אנדותל המצפים את הקיר arteriolar מוגברת בעוצמה גירוי. הראשון 3 פאנלים הראו תמונות של תגובות פלואורסצנטי) 250 NA, B) 500 NA ו-C) 1000 פליטה NA הנוכחי (כל 500 מילישניות משך הדופק). המרחק שעליו פלואורסצנטי תא האנדותל סידן מוגברת מסומן על ידי סוגריים ב AC (~ 130, 270 ו - 400 מיקרומטר, בהתאמה). קו התייחסות על פני עורקיק בחלונית מציין היכן כל התגובות פלואורסצנטי (F / FO) כדי ACH נרשמו באתר של גירוי. ד) הקלטות של זמן לעומת F / FO להגדלת גירויים אח. כמו פליטה הנוכחי גדל, גדל F / FO ב משרעת ומשך. שים לב, 100 גירוי NA היה מתחת לסף ולא היה לו שום השפעה. <img src="/files/ftp_upload/2900/2900sup1.jpg" alt="איור משלים 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="משלים איור 1"> משלים באיור 1. תרשים מעגל עבור ההדק אלקטרוניים. במעגל זה interfaced עם יציאה מקבילית ממחשב אישי. כאשר מופעל הוא מספק קבוע TTL הדופק של 5V. השבב 7805 הוא מתח 5V הרגולטור המחובר לספק DC 9-12V צריכת חשמל (סוללה של מתח מתאים זה בסדר). פלט של 7805 מספקת חשמל למתג בילטראליים Quad ו הפלט של המעגל. קלט פני הנגד 1K הוא מהמחשב.

<ol><li>Majno, G., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+inflammation.+1.+The+effect+of+histamine+and+serotonin+on+vascular+permeability%3A+an+electron+microscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophys.+Biochem.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Studies on inflammation. 1. The effect of histamine and serotonin on vascular permeability: an electron microscopic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 571-605 (1961).</li>
<li>Majno, G., Palade, G. E., Schoefl, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+inflammation.+II.+The+site+of+action+of+histamine+and+serotonin+along+the+vascular+tree%3A+a+topographic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophys.+Biochem.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Studies on inflammation. II. The site of action of histamine and serotonin along the vascular tree: a topographic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 607-626 (1961).</li>
<li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Observation+of+Skeletal+Muscle+Blood+Vessels+%28Rat+Cremaster%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Direct Observation of Skeletal Muscle Blood Vessels (Rat Cremaster).</a> J. Physiol. 172, 123-137 (1964).</li>
<li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).</li>
<li>Bohlen, H. G., Gore, R. W., Hutchins, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+microvascular+pressures+in+normal+and+spontaneously+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of microvascular pressures in normal and spontaneously hypertensive rats.</a> Microvasc. Res. 13, 125-130 (1977).</li>
<li>Klitzman, B., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+hematocrit+and+red+cell+flow+in+resting+and+contracting+striated+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Microvascular hematocrit and red cell flow in resting and contracting striated muscle.</a> Am. J. Physiol. 237, 481-490 (1979).</li>
<li>Hungerford, J. E., Sessa, W. C., &amp, S. egal, S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasomotor+control+in+arterioles+of+the+mouse+cremaster+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Vasomotor control in arterioles of the mouse cremaster muscle.</a> FASEB J. 14, 197-207 (2000).</li>
<li>Figueroa, X. F., Paul, D. L., Simon, A. M., Goodenough, D. A., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+role+of+connexin40+in+the+propagation+of+electrically+activated+vasodilation+in+mouse+cremasteric+arterioles+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Central role of connexin40 in the propagation of electrically activated vasodilation in mouse cremasteric arterioles in vivo.</a> Circ. Res. 92, 793-800 (2003).</li>
<li>Wolfle, S. E., Schmidt, V. J., Hoepfl, B., Gebert, A., Alcolea, S., Gros, D., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin45+cannot+replace+the+function+of+connexin40+in+conducting+endothelium-dependent+dilations+along+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Connexin45 cannot replace the function of connexin40 in conducting endothelium-dependent dilations along arterioles.</a> Circ. Res. 101, 292-1299 (2007).</li>
<li>Milkau, M., Kohler, R., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+importance+of+the+endothelial+K%2B+channel+SK3+and+connexin40+in+arteriolar+dilations+during+skeletal+muscle+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Crucial importance of the endothelial K+ channel SK3 and connexin40 in arteriolar dilations during skeletal muscle contraction.</a> FASEB J. 24, 3572-3579 (2010).</li>
<li>Bagher, P., Duan, D., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+impaired+neurovascular+transmission+in+a+murine+model+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Evidence for impaired neurovascular transmission in a murine model of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> J. Appl. Physiol. 110, 601-610 (2011).</li>
<li>Tallini, Y. N., Brekke, J. F., Shui, B., Doran, R., Hwang, S. M., Nakai, J., Salama, G., Segal, S. S., Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagated+endothelial+Ca2%2B+waves+and+arteriolar+dilation+in+vivo%3A+measurements+in+Cx40BAC-GCaMP2+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Propagated endothelial Ca2+ waves and arteriolar dilation in vivo: measurements in Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice.</a> Circ. Res. 101, 1300-1309 (2007).</li>
<li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+denervation+on+skeletal+muscle+blood+vessels+%28rat+cremaster%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">The effects of denervation on skeletal muscle blood vessels (rat cremaster).</a> J. Anat. 100, 305-316 (1966).</li>
<li>Proctor, K. G., Busija, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+among+arteriolar%2C+regional%2C+and+whole+organ+blood+flow+in+cremaster+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle.</a> Am. J. Physiol. 249, H34-H41 (1985).</li>
<li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+blood+flow+in+the+microcirculation%3A+Role+of+conducted+vasodilation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of blood flow in the microcirculation: Role of conducted vasodilation.</a> Acta Physiol. , (2011).</li>
<li>Hill, M. A., Simpson, B. E., Meininger, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+cremaster+muscle+hemodynamics+due+to+disruption+of+the+deferential+feed+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Altered cremaster muscle hemodynamics due to disruption of the deferential feed vessels.</a> Microvasc. Res. 39, 349-363 (1990).</li>
</ol>

נהלים ופרוטוקולים מעורבים כל בעלי החיים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש מאוניברסיטת מיזורי והופיעה בקנה אחד עם מדריך National Institutes of Health לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. הפקה של מאמר זה מומן על ידי אוניברסיטת סטנפורד Photonics.

פרוטוקול המתואר כאן מדגים שיטות להכנת ויישום micropipettes עבור microiontophoresis. מסירה של אצטילכולין משמש כדי להמחיש איתות סידן התרחבות הבסיסית האנדותל תלויי ב arterioles של העכבר בהרדמה. התוצאות שלנו להמחיש כי המרחק שעליו אח מגבירה תא האנדותל סידן מגביר את הקרינה עם עוצמת פליטה הנוכחית מ micropipette microiontophoresis (איור 3). חוסר להגדיל הקרינה בתנאים מנוחה מציין זליגת זניח של אח של micropipette. חוסר תגובה לגירוי בעוצמה NA 100 (איור 3, אגדה) ממחישה כי עוצמת סף גירוי נדרש סידן תא האנדותל כדי להגדיל. טכניקות אלו ניתן להתאים בקלות סוכני vasoactive אחרים ההכנות רקמות. שיקולים מעשיים: בעבודה עם microiontophoresis ללמוד תגובתיות arteriolar, כמה דברים צריך להיות מוכר. אמנם הוכיחה קשה לקבוע את ריכוז בפועל של אגוניסט נמסר, בתגובה לגירוי עקומות ולייצר בתוך ובין ההכנות. אלה ניתן לבצע על ידי לחיצה משך דופק קבוע (למשל, 500 ms) לבין משתנים פליטה הנוכחי (למשל, 250, 500 ו - 1000 NA; איור 3). לחלופין, פליטה הנוכחי ניתן לקיים קבוע (למשל, 500 NA) והדופק משך מגוונים (למשל, 250, 500 ו 1000 ms). לקבלת התייחסות לפעולות של ריכוז אגוניסט מוגדר, הכנת ניתן superfused עם הפתרון המתאים 5. בגלל הכוח המניע פליטה המומס תנועה מטען חשמלי, הסוכן יועברו לשאת מטען נטו להיות שעזבו micropipette. על מנת להבטיח כי הסוכן של עניין היא נושאת מטען ראשוני, הוא מומס בריכוז גבוה (למשל, 1 M עבור ACH) כדי למזער אלקטרו אוסמוזה. כאשר זה דורש מניפולציה של ה-pH של התמיסה מילוי micropipette, פקדי הרכב נדרשים לוודא תופעות ספציפי. בקרות מתאימות צריך גם להתבצע למעבר הנוכחי בלבד (למשל, באמצעות micropipettes מלא מלוחים איזוטוני). המרחק יעיל דיפוזיה של הסוכן שלה מהאתר של שחרור יש לוודא והוא נקבע על ידי רוב בקלות אמפירית היעלמותו של תגובה פיזיולוגית (למשל, התרחבות או עלייה סידן תאיים על פליטה של ​​ACH) כמו micropipette ממוקמת מוגדרים מרחקים מאתר היעד. בפועל, המרחק דיפוזיה יעילה מושפעת במידה רבה על ידי האופן שבו קצה micropipette ממוקם בתוך הרקמה, למשל, אם קצה לחוץ לתוך הרקמה ואת קצהו הוא occluded, מאשר פליטה נפגעת. רקמת חיבור מופרז הוא בעייתי במיוחד, יש להסיר מפני השטח רקמות במהלך הכנת כירורגית. שימו לב צריך גם לתת אפשרות של depleting קצה סוכן המיועד. זה ממוזער באמצעות פולסים קצרים יחסית (למשל, ≤ 1 ים). עם זרמים ממושך (למשל, מספר שניות), אגוניסט עשוי להיות מגורש מקצה במהירות רבה יותר מאשר הוא יכול להיות מוחלף על ידי דיפוזיה מפתרון מילוי בתפזורת ב micropipette. בגלל נפח זניח מוחלפת עם microiontophoresis, אם הוא מנסה לשנות את הסביבה יוניים המקומית (למשל, כדי לספק K depolarizing גירוי +), זה לא יכול להתבצע ביעילות עם microiontophoresis אבל מושגת בקלות עם פליטה לחץ של נוזלים בצובר לאחר הרצוי הרכב. לגירוי מקומי של עורקיק, טיפים micropipette עם קוטר פנימי של 2-3 מיקרומטר לעבוד היטב עם הלחץ פליטה 4-5 psi (28-35 kPa) ואת הדופק משך (למשל, 1 שנייה) שבשליטת עם שסתום סולנואיד 10. איפה אספקה ​​מתמשכת של סוכן מן micropipette על microvessel נדרש, פליטה הלחץ הוא העדיף להשתמש micropipettes בקוטר המתאים קצה פנימית (למשל, ~ 10 מיקרומטר) 11,12. טור ההידרוסטטי של גובה ידוע עם שסתום שסתום מספק זול, מוגדרים היטב on / off ראש לחץ מתמיד. שיעורי זרימה נקבעים על ידי בקוטר הפנימי של קצה פיפטה והלחץ נהיגה. כמו תמיד, פקדי הרכב חיוניים כדי למנוע פעולות ספציפי של פליטה הלחץ.

<table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> חומר המשמש </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> בורוסיליקט צינורות זכוכית נימי </td><td> וורנר מכשירים </td><td> GC120F-10 </td><td></td></tr><tr><td> אופקי פיפטה פולר </td><td> סאטר מכשירים </td><td> דגם P-97 </td><td></td></tr><tr><td> אצטילכולין כלוריד </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> A6625 </td><td></td></tr><tr><td> מתאם Luer הרכזת </td><td> Martech </td><td> AC1343 </td><td> כדי לאבטח את צינורות microcapillary </td></tr><tr><td> ניילון 0.2 מיקרומטר טיטאן מסנן </td><td> יום ראשון סרי </td><td> 42204-NN </td><td> שימור נפח נמוך כדי להקטין את איבוד </td></tr><tr><td> 5 מ&quot;ל במזרק </td><td> בקטון דיקינסון-ושות </td><td> 309603 </td><td></td></tr><tr><td> פיפטה מחזיק </td><td> וורנר מכשירים </td><td> E45W-M12VH </td><td></td></tr><tr><td> כסף Wire </td><td> וורנר מכשירים </td><td> AG10W </td><td> 0.25mm בקוטר </td></tr><tr><td> 3 ציר micromanipulator </td><td> Siskiyou עיצוב מכשירים </td><td> DT3-100, MXB, MXC, מג&quot;ב / 8 </td><td> רכיבים עבור מניפולטור כפי שמוצג </td></tr><tr><td> microiontophoresis הנוכחית מתכנת </td><td> העולם מכשירי דיוק </td><td> דגם 260 </td><td></td></tr><tr><td> המכשיר הדק </td><td> מנהג </td><td> מנהג </td><td> מעגל הניתנים Suppl. איור 1 </td></tr><tr><td> חלד פלדה </td><td> מקמאסטר-קאר </td><td> 1 / 8 &quot;X 12&quot; X 12 &quot; </td><td> על פי התכנון </td></tr><tr><td> מוגברת מצלמה דיגיטלית </td><td> סטנפורד Photonics Inc </td><td> XR/Mega-10 </td><td> משולב עם פייפר בקרת תוכנה </td></tr></tbody></table>

microiontophoresis ו המיקרומניפולציה עבור דימות פלואורסצנטי intravital של microcirculation

Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis כרוך במעבר של זרם דרך טיפ micropipette לספק המומס באתר ייעודי בתוך הכנה ניסיונית. Microiontophoresis יכול לדמות הילוכים הסינפטי 1 על ידי אספקת נוירוטרנסמיטורים נוירופפטידים על נוירונים reproducibly 2. נפח זניח (נוזל) עקירה נמנעת הפרעה מכנית הכנה הניסוי. התאמת בטכניקות אלה כדי microcirculation 3 אפשרה מנגנוני התרחבות ו vasoconstriction להיחקר ברמה המיקרוסקופית in vivo 4,5. יתרון המפתח של משלוח מקומי כזה המאפשר תגובות וזומוטורים להיחקר באתרים מוגדרים בתוך רשת כלי הדם מבלי לעורר שינויים מערכתיים או רפלקסיבי בלחץ הדם זרימת הדם לרקמות, ובכך חושפים מאפיינים מהותיים של microvessels. הגבלה של microiontophoresis היא כי הריכוז המדויק של סוכן נמסר לאתר של עניין קשה לברר 6. עם זאת, השקתו מקצה micropipette הוא יחסי עוצמת ומשך פליטה הנוכחית 2,7, כגון לשחזור כי הגירוי תגובה קשרים ניתן לקבוע בקלות תחת תנאים ניסויים מוגדר (המתואר להלן). גורמים נוספים המשפיעים על משלוח microiontophoretic כוללים ריכוז המומס ואת יינון שלה בתמיסה. הקוטר הפנימי של קצה micropipette יש ~ 1 מיקרומטר או פחות כדי למזער את &quot;דליפה&quot; diffusional, אשר ניתן לסתור עם זרם שמירה. לכן זרם החוצה (חיובי) משמש כדי להוציא קטיון ואת זרם שלילי בשימוש לשמור אותו בתוך micropipette. המצאה של micropipettes הוא הקל עם מושכי אלקטרוניים מתוחכמים 8. Micropipettes המגיעים צינורות זכוכית נימי המכיל נימה כי &quot;פתילות&quot; פתרון אל קצה micropipette כאשר מלא מקצה האחורי (&quot;backfilled&quot;). הדבר נעשה על ידי החדרת צינור microcapillary מחובר מזרק המכיל את הפתרון לעניין פתרון ולהוציא לתוך לומן של micropipette. Micromanipulators לאפשר המיקום הרצוי של micropipettes תוך הכנת הניסוי. Micromanipulators רכוב על בסיס מטלטלין ניתן למקם סביב הכנת בהתאם לטופוגרפיה של רשתות כלי הדם (שפותחה בהמשך). הפרוטוקול הנוכחי מדגים microiontophoresis של אצטילכולין (ACH + Cl -) על עורקיק הכנה השריר עכבר cremaster (ראה פרוטוקול קשורים: מזהה יופיטר # 2874) כדי לייצר האנדותל תלויי התרחבות. משלוח Stimulus מסונכרן עם רכישת תמונה דיגיטלית באמצעות ההדק אלקטרוניים. השימוש Cx40 BAC-GCaMP2 העכברים הטרנסגניים 9 תגובות מאפשר הדמיה של סידן תוך תאי הבסיס התרחבות בתאי האנדותל arteriolar ב microcirculation האורחים.

Microiontophoresis כרוכה בתנועה של יונים מן micropipette בתגובה הבדל בפוטנציאל חשמלי בין בתוך ומחוץ micropipette. מולקולות פעילות ביולוגית מועברות ובכך ביחס זרם חשמלי. אנו מדגימים microiontophoresis אצטילכולין בשיתוף עם המיקרומניפולציה ללמוד האנדותל תלויי התרחבות ב microcirculation.

Microiontophoresis ו המיקרומניפולציה עבור דימות פלואורסצנטי Intravital של microcirculation

מיקרו-יונטופורזה (Microiontophoresis) כרוכה בהעברת זרם דרך קצה של מיקרופיפט כדי להעביר מומס לאתר מוגדר בתוך תכשיר ניסיוני. ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להחדיר חומר טעון, כגון הנוירוטרנסמיטור בעל המטען החיובי, acetylcholine, לאתר ספציפי בתוך הדגם הניסויי. דבר זה מושג על ידי הכנת מיקרו-פיפטות מצינורות נימי זכוכית באמצעות מכשיר משיכה (puller) אופקי למיקרו-פיפטות, מילוי חוזר של המיקרו-פיפטות ב-acetylcholine וקיבוע המיקרו-פיפטה במיקרו-מניפולטור. לאחר מכן, קצה המיקרו-פיפטה ממוקם בסמיכות לאתר העניין.בעוד שזרם שימור שלילי מוגדר כדי למנוע דליפה של כולין עדין, כולין עדין נדחף מהמיקרו-פיפט על ידי הפעלת זרם חיובי בעוצמה ובמשך זמן מוגדרים, תוך כדי הקלטת תגובות של פלואורסצנציה וקוטר במיקרו-סירקולציה; אותות אלו מודדים פלואורסצנציית סידן העומדת בבסיס התרחבות כלי דם תלויה באנדותל של העורקים השולטים בזרימת הדם ברקמה. אני ד"ר סטיב סיגל. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לספק תובנות לגבי אירועי השליח התאי העומדים בבסיס הבקרת זרימת הדם והעורקים.ניתן ליישם זאת גם בנורופיזיולוגיה כדי לחקור תמסורת סינפטית והפעלה של תעלות יונים. אני ד"ר Pune Badger. בדרך כלל, אנשים שחדשים בטכניקה זו עשויים להתקשות, מכיוון שנדרש תרגול כדי ללמוד כיצד להכין מיקרו-פיפטות יעילות לביצוע מיקרו-מניפולציה, וכיצד לכוונן את זרמי העיכוב וההזרקה כדי לשלוט בהגשת התרופה מהמיקרו-פיפטה.התחילו בשימוש במכשיר למשיכת פיפטות (pipette puller) כדי להכין מיקרו-פיפטות לאיונטופוריה מהסợi זכוכית בורוסיליקאט עם חוט זכוכית פנימי. מומלץ להשתמש בקונוס באורך של חמישה מילימטרים כדי להבטיח קשיחות, בעוד שקונוסים ארוכים יותר הם גמישים יותר. לאחר מכן, חברו מחט למילוי אחורי המחוברת למסנן של 0.2 µm למזרק המכיל acetylcholine chloride בריכוז של 1 M המומס במים בעלי התנגדות של 18.2 MΩ.כעת הכניסו את מחט המילוי האחורית לקצה האחורי של המיקרופיפט והזיזו אותה עד לקצה. מזגו את ה-acetylcholine אל תוך המיקרופיפט תוך כדי נסיגה של מחט המילוי, עד שהמיקרופיפט יתמלא. כדי להוציא בועות אוויר, החזיקו את המיקרופיפט כאשר הקצה שלו פונה כלפי מטה ונכו בו בעדינות.בשלב הבא, הדק את המיקרו-פיפט במחזיק מיקרו-פיפט. לאחר מכן, הדק את מחזיק המיקרו-פיפט במיקרו-מניפולטור בעל שלושה צירים, כגון דגם קומפקטי המותקן על בסיס מגנטי. חבר את החוטים החיוביים והשליליים למתכנת המיקרו-יונטופורזה. באמצעות חוטים עם תליב תניח (alligator clip) בקצה, הדק חוט כסף לשולי הדגימה כדי שישמש כאלקטרודת ייחוס.באמצעות תפס התניח, חברו את החוט השלילי המגיע ממתכנת המיקרו-יונטופורזה לאלקטרודת הייחוס. לאחר מכן, חברו את החוט החיובי ממתכנת המיקרו-יונטופורזה לחיבור החיצוני של מחזיק המיקרו-פיפטה. באמצעות תפס הפיזור השני, המעגל נסגר כאשר קצה המיקרו-פיפטה חודר אל תוך תמיסת הסלין הפיזיולוגית.מעל למערך הניסוי, המיקרוסקופ מצויד בפלטפורמה מותאמת להגדלת שטח הפנים של במה ה-XY. הפלטפורמה מיוצרת מפלדת אל חלד פרימגנטית והיא מספקת מספיק מקום למיקום המיקרו-מניפולטור מסביב למערך הניסוי לפי הצורך. מקמו את מערך הניסוי על הפלטפורמה.בדוגמה זו, רקמת שריר הוכנה באמצעות פרוטוקול הכנת השרירים של cream master מתוך סרטון קשור. כעת מקמו את המיקרו-מניפולטור ביחס לדגימה כך שקצה המיקרו-פיפטה ימוקם מעל האתר המבוקש. כעת, כדי למנוע התרחבות של העורקים, השלימו זרם עיכוב באמצעות מתכנת המיקרו-פרזיס.זרם העיכוב משתנה בהתאם לגודל קצה המיקרופיפט ולריכוז האגוניסט, אך הוא הדיר רב עבור פרמטרים מוגדרים. כעת, באמצעות בקרים של המיקרו-מניפולטור ותוך צפייה דרך המיקרוסקופ, מקם בזהירות את קצה המיקרופיפט לצד דופן של העלילטור (arteriole). עם התנסות, ניתן לבצע זאת מבלי לשבור את הקצה או לגרום נזק לרקמה.כדי להפעיל טריגר עדין של כולין, הפעילו את מתכנת המיקרו-יונטופורזה באמצעות פולס TTL של חמישה וולטים לפחות. באמצעות תוכנה מסחרית, ניתן לשלוח טריגר אלקטרוני למחשב, אשר שולח בו-זמנית את פולס ה-TTL ומתחיל את הקלטת התמונות הדיגיטליות מהמצלמה. משך פולס הגירוי נשלט על ידי התוכנה.מתכנת המיקרופורזיס שולט בזרם ההדפה. כאשר הוא מקבל את פולס ה-TTL, זרם העיכוב מופסק וזרם ההדפה מועבר. בעורק של עכבר זה ישנם תאי אנדותל המבטאים GFP הרגיש לסידן, הפולט פלואורסצנציה באופן פרופורציונלי לעליות בריכוז הסידן התוך-תאי מעל רמה סף; גירוי קל באמצעות כולין עורר תגובה פלואורסצנטית ככל שמשך גירוי האצטילכולין עלה.גם פלואורסצנציית הסידן של תאי האנדותל בעורק עלתה. עוצמת הפלואורסצנציה עלתה באתר הגירוי, והפלואורסצנציה התפשטה למרחקים גדלים בהדרגה לאורך העורק. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי יעילות המיקרופורזיס נקבעת על ידי הקוטר הפנימי של הקצה, ריכוז האגוניסט בתוך המיקרופיפט, ועוצמת ומשך זרם ההזרקה.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של האופן שבו ניתן להשתמש במיקרו-פרזיס (micro pheresis) כדי להעביר מולקולה טעונה ממיקרו-פיפטה לאתר מוגדר. בהכנה הניסויית.

microiontophoresis-micromanipulation-for-intravital-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטה צדדי חדש להסתכלות של microcirculation מוצג. זה נחשב מתאים תצפית ארוכת טווח, ועל בשילוב עם התערבויות ביולוגיות pharmacophysiological או המולקולרית.

במדידה Micro-vivo מחזור בשרירי השלד על ידי מיקרוסקופית תוך חיוני

מיקרוסקופיה Intravital לעקוב אחרי האירועים hemodynamic ו דלקתיות ומרחב ב microcirculation pial.

מיקרוסקופית Intravital של microcirculation המוח עכבר באמצעות חלון גולגולתי סגור

ניתן להשתמש במיקרוסקופיה תוך-חיונית בבעלי חיים כדי להמחיש ולמדוד את קוטר כלי הדם ברשתית, מהירויות זרם הדם וזרימת הדם הכוללת ברשתית.

מדידות מיקרוסקופ וידאו תוך-חיוני של זרימת הדם ברשתית בעכברים

המטריצה ​​תאית עוברת שיפוץ משמעותי בריפוי פצעים, דלקות והיווצרות גידול. אנו מציגים גישה מיקרוסקופית immunofluorescence intravital רומן כדי להמחיש את הדינמיקה של סיבי, כמו גם רכיבי מטריצת רשת כמו עם רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה באמצעות epifluorescence או שני פוטונים במיקרוסקופ.

לטווח ארוך Intravital Immunofluorescence הדמיה של רקמות מטריקס רכיבים עם Epifluorescence ומיקרוסקופי שני פוטונים

אנו מציגים הליך הוצאה מקומית אופטימיזציה באמצעות זכוכית מיקרו-פיפטה ומהיר שני פוטון hyperstack שיטה הדמיה, אשר מאפשר מדידה מדויקת של שינויים בקוטר נימי וחקירה של התקנה שלה בשלושה ממדים.

בVivo תלת מימדי 2-פוטון מיקרוסקופית למחקר שנערכו תגובות כלי דם על ידי הוצאה ATP מקומי באמצעות זכוכית מיקרו פיפטה

אנו מתארים שיטה כדי להמחיש gfp γδ iels התווית באמצעות הדמיה intravital של המעי הדק מורטין על ידי מיקרוסקופית הפוכה דיסק מיקרוסקופ קונפוקלית. טכניקה זו מאפשרת מעקב של תאים חיים בתוך רירית עד 4 h והוא יכול לשמש כדי לחקור מגוון של אינטראקציות מעיים החיסונית-אפיתל.

אינטרטל הדמיה של לימפוציטים תוך-אפיתל במעי קטן מוריין

כדי לכמת את זרימת מיקרונימי הדם ממהירות גבוהה מהירות רצף נימי תמונה, פיתחנו צוות (ניתוח זמני מרחבי של זרימת שפילד) תוכנה. מעבר לשדה התמונה המלא ולאורך הזמן, הצוות מעריך מהירויות זרימה ומייצר רצף של מפות מרחבית בצבע לצורך הדמיה ותפוקה טבלאית עבור ניתוחים כמותיים.

אנליזה מרחבית של תזרים שדות במיקרוvasקובלטורה

פרוטוקול זה מתאר את ההליכים הניתוחיים והטכניים המאפשרים הדמיית פלואורסצנטיות מולטי-פוטונית בזמן אמת של מוח המכרסמים במהלך טיפולים ממוקדים באולטרסאונד ובמיקרו-חלוק כדי להגביר את חמיצוץ מחסום הדם - מוח.

מיקרוסקופיה מולטי-פוטונית תוך-וינטלית בזמן אמת להדמיית טיפולים ממוקדים באולטרסאונד ובמיקרו-חלוק כדי להגביר את חדחול מחסום הדם-מוח

גיוס לויקוציטים וטסיות דם מהווה מרכיב חיוני הדרוש לצמיחה יעילה של עורקי בטחונות במהלך העורקים. מיקרוסקופ מולטיפוטון הוא כלי יעיל למעקב אחר דינמיקה של תאים עם רזולוציה מרחבית-טמפורלית גבוהה in vivo ופחות רעילות לאור לחקר גיוס לויקוציטים ואקסטרווסציה במהלך העורקים.

הדמיה תוך-חיונית מולטיפוטון לניטור גיוס לויקוציטים במהלך דלקת עורקים במודל מורין גפיים אחוריות

אנו מציגים פרוטוקול ליישום מיקרוסקופיה של השתקפות הפרעות ומיקרוסקופיה כוללת-פנימית-השתקפות-פלואורסצנטית להדמיה בו-זמנית של מיקרו-טובולים דינמיים וחלבונים הקשורים למיקרו-טובולים המסומנים באופן פלואורסצנטי.

השתקפות הפרעה סימולטנית ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת להדמיה מיקרוטובולים דינמיים וחלבונים נלווים

ניתן להשתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית תוך-ורידית כדי לחקור אינטראקציות לויקוציטים-אנדותל וזלוף נימי בזמן אמת. פרוטוקול זה מתאר שיטות לדמות ולכמת פרמטרים אלה במיקרו-סירקולציה ריאתית באמצעות מערכת הדמיית ריאות המיוצבת בריק.

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית תוך-ורידית של מיקרו-סירקולציה ריאתית בפגיעה חריפה ניסיונית של הריאות באמצעות מערכת הדמיה מיוצבת ואקום

למד מיקרו-יונטופורזיס לשחרור אצטילכולין באתרים ספציפיים במיקרו-מחזור הדם. טכניקה זו מאפשרת מחקר אותות תאיים בווסת זרימת הדם וביולוגיה וסקולרית.

Microiontophoresis ו המיקרומניפולציה עבור דימות פלואורסצנטי Intravital של microcirculation

גלה סרטונים נוספים