Multi-פוטון הדמיה של הפלישה תאים סרטניים במודל עכבר orthotopic של קרצינומה של תאים קשקשיים אוראלי

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להפיק מודל עכברי של סרטן הפה המאפשר ויזואליזציה וכימות של פלישת הגידול בלשון. דבר זה מושג תחילה על ידי יצירת תאי קרצינומה סקוואמוזית של הפה לצורך דימות בדו-פוטון באמצעות זיהום לנטיבירי של life Act M cherry וברירה קלונאלית יציבה. לאחר מכן, גידולי קסנוגרפט אורטוטופים מופקים בעכברי nude על ידי הזרקה של תאים המסומנים ב-life Act M cherry ללשונותיהם של עכברים תחת הרדמה.

לאחר מכן, לשונות המכילות גידולים מדויקות באמצעות מיקרוסקופיית פוטון כפול. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות פלישה מקומית של גידול פה בתוך שריר הלשון באופן כמותי, וזאת באמצעות הדמיית פוטון כפול של רקמת לשון טרייה ושחזור תלת-ממדי מ komputer של גידולים ראשוניים וקבוצות תאים שפלו regionaly.

ההשלכות של טכניקה זו חוללות התקדמות לעבר התערבות טיפולית בסרטן הפה, שכן היא מספקת מערכת מודל לניתוח חלבונים המעורבים בפלישת גידולים, וכן להערכת תרכובות פרה-קליניות באסטרטגיות טיפוליות אנטי-אינבזיביות. באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בטכניקה זו יתקלו בקושי, שכן הזרקת תאי הגידול ללשון והכנת הלשון למיקרוסקופיה דו-פוטונית הן דרישות תובעניות מבחינה טכנית, הדורשות מיומנות ותרגול. ויזואליזציה של שיטה זו היא קריטית, כיוון ששלבי הזרקת הגידול והמיקרוסקופיה הדו-פוטונית קשים ללמידה ודורשים מיומנות מיוחדת כדי להתחיל את התרבית.

קווי תאי גידולים של ראש וצוואר אנושיים במצע מלא המורכב מ-DMEM בתוספת 10% FBS, 1% penicillin streptomycin, ו-1% חומצות אמינו שאינן חיוניות. על מנת להעביר את רצף הציפוי של LIFE Act M cherry לאתר הווקטור הלנטיבי PLL 7.0, נדרש תחילה מוטגנזה מכוונת לאתר (site directed mutagenesis) כדי להחדיר שלוש מוטציות שקטות לאתר זיהוי SBF one ב-mCherry cDNA ההורה. לאחר מכן, בצעו הגברה באמצעות PCR לרצף ה-Life Act mCherry המותאם, עם אתרי ECO R one SBF one משני צדדיו, ובצעו סב-קלון (subcloning) לתוך PLL 7.0. כדי לייצר מבנה PLL 7.0 LIFE Act M cherry, בהתאם למערכת ביטוי לנטיבית, תרבתו את קו תאי האריזה 2 9 3 T עד להגעה ל-17% עד 40% התמסרות (confluence) במצע מלא.

בצע טרנספקציה לתאים באמצעות CalFoss עם הווקטורים PLL 7.0, LIFE Act M cherry, PS PACS 2 ו-P-VSV-G ביחס של 3:2:1 בהתאמה. לאחר 24 שעות, החלף את המצע במצע טרי ומלא; אסוף והחלף את המצע מדי 12 שעות למשך 72 שעות, ואחסן את המצע שנאסף בטמפרטורה של 4°C כדי להפיק שורות תאי ראש וצוואר עם ביטוי יציב של LIFE Act M cherry. סבב את המצע שנאסף במהירות של 2000 RPM למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4°C, והוסף 1 mL של המצע המזוקק המכיל את הווירוס לתאי OSC 19 או US CCC 1 למשך 12 שעות.

שטפו את התאים, ולאחר מכן הוסיפו מיליליטר נוסף של וירוס לתקופה של 12 שעות נוספות. גדלו את התאים במדריך המכיל 200 milligrams per milliliter של pur mycin למשך שבועיים כדי לבחור מושבות עמידות. בצעו סריקה חזותית של המושבות השורדות כדי לזהות ביטוי של m cherry באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. בצעו trypsin eyes למושבות חיוביות בודדות באמצעות דיסקי שיבוט סטריליים של three millimeter.

יש לתחזק את התאים החיוביים במדיום המכיל 200 mg/mL של purmycin עד להקפאתם מחדש, או עד לשימושם להזרקה אורתוטופית לצורך יצירת קסנוגרפט של גידול אורתוטופי של תאי גידול המבטאים M cherry trypsin life Act. לאחר מכן, יש לסבב את התרבית במ centri-fuge ולסבב מחדש כ-2.5 × 10⁴ תאים ב-50 µL של מדיום מלא. יש להעביר את תאי הגידול למזרק של 1 mL המחובר למחט במידה 27 באורך חצי אינץ'.

בשלב הבא, הרדימו נקבת עכבר עירום (athymic fox) בת שמונה שבועות. השתמשו בשילוב של 80 milligrams per kilogram של ketamine ו-10 milligrams per kilogram של xylazine. ברגע שהבעל החיים מפסיק לזוז, מרחו משחת לסיכוך העיניים ובדקו את רמת התגובה באמצעות לחיצה עם הציפורן על כרית כף הרגל.

שמרו את העכברים על פלטת חימום בטמפרטורה של בין 37 ל-40 °C. בעזרת פינצטה סטרילית, אחזו בעדינות בקצה הלשון ומשכו אותה החוצה מחלל הפה. מזריקו באיטיות את התאים לצד אחד של כל לשון כדי ליצור מסה בולטת במרכז הלשון.

הזריקו לעכברים 2.1 מיליגרם לקילוגרם של yohi being והחזירו אותם למשטח החימום כדי לעקוב אחריהם במהלך ההתאוששות מההרדמה. הניחו את העכברים בכלובים סטריליים המכילים תזונת בצק טרנסגנית רכה. שקלו את העכברים מדי יומיים עד שלושה ימים ועקבו אחריהם באופן חזותי כדי לזהות הופעת גידולים.

כדי להכין לשונות עכברים לדימות ex vivo, יש להקרין עכברים הנושאים גידולים בנקודות זמן שונות. באמצעות שאיפת פחמן דו-חמצני, הוצא את הלשונות ושטוף אותן ב-XPBS. לאחר מכן, השתמש בחוט תפירה מונופילמנט מחנות תחביבים מקומית ובמחט תפירה בגודל שמונה.

הצמידו את הלשון לאחד הצדדים של קסאט (cassette) סטנדרטי להטבעת רקמות בפראפין. לאחר שהלשון קובעה, טבלו את כל מכלול הקסאט ב-one XPBS. עבדו מיד את הלשונות באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית כדי לדגמה את הלשונות במיקרוסקופיה דו-פוטונית.

טבלו את קסטות הלשון בצלחת של 60 מילימטר המכילה XPBS אחד. קבעו את הצלחת במחזיק בעיצוב מותאם על זרוע קנטילבר נשלפת הממוקמת תחת העדשה של מיקרוסקופ פוטונים כפולים. מקמו עדשת אובייקטיב טבילה במים בעלת הגדלה של 40 ופתח מספרי (numerical aperture) של 0.8 ישירות על או מעל נגע גידולי גלוי.

בצעו הדמיה של הלשון באמצעות מיקרוסקופיה של שני פוטונים עם לייזר טיטניום-ספיר בעוצמה של 60 milliwatts ואורך גל כניסה של 755 nanometers. כדי למקסם את אות ה-M cherry, אספו סדרת תמונות סריקת לייזר של 1 micrometer בעומקים הדרגתיים של 1 micrometer, לאורך עומק רקמה כולל שבין 15 ל-100 micrometers. בתצורה זו, ניתן לנתח גידולים בעומק רקמה של עד 1 millimeter.

השתמשו ב-scan image ללכידת תמונות. Scan image מייצר פלט דו-ערוצי של דפוסי סריקה רסטרית לשליטה במראות סריקה גלוונומטריות בצירי XY, ובמקביל לוכד אות קלט של עד ארבעה ערוצים ממכפלי פוטונים (photo multiplier tubes) באמצעות כרטיס רכישת נתונים. Scan image אוסף תמונות Z stack על ידי שליטה בציר Z של העדשה, ואוסף תמונות time-lapse במצב בודד או מחזורי.

שמרו את התמונות בקובץ TIF יחיד בעומק 16 ביט. השתמשו בתוכנת Amira כדי לרנדר את ערימות תמונות הגידול לתמונה תלת-ממדית אחת, על ידי פתיחת קובץ ה-TIF המכיל את סט תמונות ה-Zs stack. השתמשו בפונקציית TEX כדי להפיק רינדור תלת-ממדי.

בדימוי המעובד תופיע ככל הנראה תמונה של גידול ראשוני גדול עם מספר קבוצות פולשניות מופרדות (igs) קטנות יותר. כדי למדוד את נפח הגידול, הגדירו את סף השטח של הגידול הראשוני ובכל פרוסה של ערימת התמונות תקנו והסירו את הפלואורסצנציית הרקע. חזרו על הליך קביעת הסף עבור כל קבוצה פולשנית.

לאחר בחירת הגידול הראשוני וכל ה-igs, קבע את מדידת הנפח וכן את קואורדינטות ה-OID בצירי X, Y ו-Z של הגידול הראשוני. כדי לחשב את המרחקים של ה-igs מהנקודה המרכזית של הגידול, חשב את מדד הפלישה של הגידול או ti באמצעות הנוסחה ti equals N NT times VT times dt. כאשר NT שווה למספר הכולל של igs בתמונה, VT שווה לנפח הכולל של כל ה-igs ו-DT שווה למרחק הכולל שעברו כל קבוצות הפלישה ממרכז הגידול הראשוני.

ניתן להפיק הדמיות תלת-ממדיות עם פירוט טופוגרפי גבוה יותר על ידי ייבוא קבצי הקצה המקוריים במונוכרום של 16 ביט אל Nikon NIS elements בתוך התוכנה. צור קובץ ND ממעטפת תמונות (image stack). לאחר מכן, כייל את המסמך באופן ידני כדי להגדיר את גודל הפיקסל עבור הדמיות באיכות גבוהה יותר.

הוסיפו פרוסות נוספות במישור Z. דמות זו מציגה דוגמה לנתונים הגולמיים שנרכשו מדימוי פוטון כפול באמצעות NIS elements או מראה. ניתן להשתמש בתוכנה כדי לשחזר את הנתונים הגולמיים של גידולי לשון, המוצגים בדמות זו.

לוח זה מציג דוגמה לרינדור תלת-ממדי באמצעות פונקציית ה-TEX בתוכנת Amira. כאן מוצגת דוגמה לסף (thresholding) של חתך בודד במיקרוסקופיה של שני פוטונים מתוך מחסנית התמונות, כדי לזהות קבוצות פולשניות מהגידול הראשוני, וכן את מרכז הגידול הראשוני או ה-oid. לאחר ניתוח של כל חתך שעבר סף, תוכנת Amira מכמתת את הנפח ואת המרחק שעברו כל אחת מהקבוצות הפולשניות מהמרכז (Centro).

ניתן להציג נתונים אלו גרפית ולהשתמש בהם כדי לקבל את הערך המספרי של רמת הפלישה המלאה של תאי הגידול. התמונות המוצגות כאן, המיוחסות לאתר הראשוני, הן תמונות מייצגות של גידולים כפי שנראים בסימון אימונוהיסטוכימיה פתולוגי קונבנציונלי, בהשוואה לתמונה תלת-ממדית של גידול דומה באמצעות הפרוטוקול המתואר. לאחר השליטה בטכניקה, החל משלב חילוץ הלשון ועד לרינדור התלת-ממדי הסופי, ניתן לבצע את התהליך תוך כשעתיים אם הוא מבוצע כראוי. בעת ביצוע פרוטוקול זה, יש להיזהר לא לנקב את הלשון עם המחט, כדי למנוע איבוד של תאי גידול המפריע למעקב אחר הגידול. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע בדיקה של תרכובות טיפוליות או תאים עם רמות חלבון שעברו מניפולציה, על מנת לקבוע את יעילותם נגד פלישה של סרטן הפה.

במסגרת ניסוי in vivo, יש לזכור כי עבודה עם תאי גידול אנושיים ששונו באמצעות לנטי-וירוס היא מסוכנת; יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון ציוד מיגון אישי (PPE) מתאים ועבודה במכסיר זרימה למינרית מאושר לרמה BSL 2, בעת העבודה עם עכברים מוזרקים.