Multi-פוטון הדמיה של הפלישה תאים סרטניים במודל עכבר orthotopic של קרצינומה של תאים קשקשיים אוראלי

סקירה מקיפה של טכניקות מעורב ביצירת מודל עכברי של סרטן הפה ניטור כמותי של הפלישה הגידול בתוך הלשון באמצעות מיקרוסקופ רב פוטון של תאים שכותרתו מוצג. מערכת זו יכולה לשמש פלטפורמה שימושי להערכת יעילות התרופה מולקולרית של תרכובות אנטי פולשנית.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר מודל עכברי של סרטן הפה המאפשר הדמיה וכימות של פלישת הגידול בלשון. זה מושג על ידי יצירת תאי קרצינומה קשקשית אוראלית לראשונה להדמיית שני פוטונים על ידי זיהום לנטי-ויראלי של דובדבן מעשה M וברירה משובטת יציבה. לאחר מכן, גידולי קסנוגרפט אורתוטופיים מיוצרים בעכברים עירומים על ידי הזרקת תאים בעלי תווית דובדבן מעשה חיים M ללשונות של עכברים מורדמים.

לאחר מכן מצלמים לשונות המכילות גידול על ידי שני מיקרוסקופ פוטונים. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות פלישת גידול אוראלי מקומית מכומתת בתוך שריר הלשון באמצעות הדמיה של שני פוטונים של רקמת לשון טרייה ושחזור תלת מימדי של גידולים ראשוניים וקבוצות תאיות שפלשו לאזור. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו אימונוהיסטוכימיה או הדמיה ביולוגית, הוא שניתן למדוד כמותית פלישת תאים גידוליים בתלת מימד

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על התערבות טיפולית בסרטן הפה מכיוון שהיא מספקת מערכת מודל לניתוח חלבונים המעורבים בפלישת גידולים, כמו גם הערכה של תרכובות פרה-קליניות על אסטרטגיות טיפוליות אנטי פולשניות. בדרך כלל, אנשים חדשים בטכניקה זו יתקשו מכיוון שהזרקת תאי הגידול ללשון והכנת הלשון לשתי מיקרוסקופיות צילום היא תובענית מבחינה טכנית, ודורשת מיומנות ותרגול. הדמיה של שיטה זו היא קריטית מכיוון שהזרקת הגידול בשני שלבי פוטון קשה ללמידה ודורשת מיומנות מיוחדת כדי להתחיל בתרבות.

קווי תאי גידול ראש וצוואר אנושיים במדיום שלם המורכב מ-DMEM בתוספת 10% FBS, 1% פניצילין סטרפטומיצין ו-1% חומצות אמינו לא חיוניות. על מנת להעביר את רצף ציפוי הדובדבן של LIFE Act M לאתר וקטור לנטי-ויראלי PLL 7.0, נדרשת תחילה מוטגנזה מכוונת כדי להכניס שלוש מוטציות שקטות לאתר זיהוי אחד ב-mCherry CD NA האם. לאחר מכן, PCR מגביר את רצף mCherry של Modified Life Act עם ECO R אחד, SBF אחד אתרים ותת-קלינט לתוך PLL 7.0. כדי ליצור מבנה דובדבן PLL 7.0 LIFE Act M בעקבות תרבית מערכת ביטוי לנטי-ויראלית, קו תאי האריזה 2 9 3 T 17 עד 40% מפגש במדיום שלם.

באמצעות Cal Foss העבירו את התאים עם וקטורים PLL 7.0 LIFE Act M, PS PACS two ו-P-V-S-V-G ביחס של שלושה לשניים לאחד בהתאמה. לאחר 24 שעות, החלף את המדיום במדיום טרי ושלם, אסוף וחדש את המדיום כל 12 שעות למשך 72 שעות, ואחסן את המדיום שנאסף בארבע מעלות צלזיוס כדי לייצר קווי תאי ראש וצוואר עם ביטוי דובדבן יציב של מעשה M. סובב את המדיום שנאסף ב-2000 סל"ד למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, הוסף מיליליטר אחד של המדיום המובהר המכיל את הנגיף לתאי OSC 19 או US CCC אחד למשך 12 שעות.

שטפו את התאים, ולאחר מכן הוסיפו מיליליטר נוסף של וירוס לתקופה נוספת של 12 שעות. תרבית התאים במדיום המכיל 200 מיליגרם למיליליטר של מיצין פור למשך שבועיים כדי לבחור מושבות עמידות, סינון חזותי של מושבות שורדות לכל החיים. מעשה m ביטוי דובדבן על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי טריפסין עיניים, מושבות חיוביות בודדות באמצעות דיסקי שיבוט סטריליים של שלושה מילימטרים.

שמור על תאים חיוביים במדיום המכיל 200 מיליגרם למיליליטר של מיצין פור עד להקפאה בחזרה, או משמש להזרקה אורתוטופית ליצירת גידול אורתוטופי xenograft טריפסין חיים Act. M דובדבן המבטא תאי גידול ואז צנטריפוגה את התרבית והשהה מחדש כ -2.5 פעמים 10 לתאים הרביעיים ב -50 מיקרוליטר של מדיום שלם. טען את תאי הגידול למזרק מיליליטר אחד המחובר למחט בגודל 27 אינץ '.

לאחר מכן, נקבת שועל אתימית בת שמונה שבועות. עכבר עירום אחד עם שילוב של 80 מיליגרם לק"ג קטמין ו-10 מיליגרם לק"ג קסילזין. לאחר שהחיה מפסיקה לזוז, מרחו משחת סיכוך עיניים ובדקו את ההיענות על ידי לחיצה על ציפורן לתוך כרית כף הרגל.

שמור את העכברים על כרית חימום בין 37 ל -40 מעלות צלזיוס. בעזרת מלקחיים סטריליים, אחוז בעדינות בקצה הלשון ומשוך אותו החוצה מחלל הפה. הזרקו לאט את התאים לצד אחד של כל לשון כדי ליצור מסה בולבוסית במרכז הלשון.

הזריקו לעכברים 2.1 מיליגרם לק"ג יוהי והחזירו אותם לכרית החימום כדי לפקח עליהם במהלך ההתאוששות מההרדמה. מניחים עכברים בכלובים סטריליים המכילים דיאטת בצק טרנסגנית רכה. שקלו את העכברים כל יומיים-שלושה ועקבו אחריהם ויזואלית להופעת הגידול.

כדי להכין לשונות עכברים להדמיה ex vivo, המתת חסד של עכברים המכילים גידולים בנקודות זמן שונות. בעזרת שאיפת פחמן דו חמצני, חלצו את הלשונות ושטפו אותן עם XPBS אחד. לאחר מכן השתמשו בחוט תפירה מונופילמנט מחנות תחביבים מקומית ומחט תפירה בגודל שמונה.

חבר את הלשון לצד אחד של קלטת הטמעת רקמת פרפין קונבנציונלית. לאחר שהלשון משותקת, טבלו את כל מכלול הקסטה ב-XPBS אחד. עבד מיד את הלשונות באמצעות שני מיקרוסקופ פוטונים כדי לדמות את הלשונות באמצעות שני מיקרוסקופ פוטונים.

טבלו את קלטות הלשון בצלחת של 60 מילימטר המכילה XPBS אחד. אבטח את המנה במחזיק בעיצוב מותאם אישית על זרוע שלוחה נשלפת הממוקמת מתחת למטרה של שני מיקרוסקופ הפוטונים. הנח עדשת אובייקט טבילה במים עם צמצם מספרי בגודל 40 x 0.8 ישירות על או מעל נגע גידול גלוי.

דמיין את הלשון על ידי שני מיקרוסקופ פוטונים עם לייזר ספיר טיטניום בעוצמה של 60 מילי-וואט ואורך גל כניסה של 755 ננומטר. כדי לייעל את אות הדובדבן M, אסוף תמונות סריקת לייזר של מיקרומטר אחד בעומקים מצטברים של מיקרומטר אחד על פני עומק רקמה כולל בין 15 ל-100 מיקרומטר. עם תצורה זו ניתן לנתח גידולים בעומק רקמה של עד מילימטר אחד.

השתמש בתמונת סריקה כדי ללכוד תמונות. תמונת סריקה מייצרת פלט דו-ערוצי של דפוסי סריקת רסטר כדי לשלוט במראות סריקה מטריות של גלבון XY ובמקביל לוכדת קלט אות ארבעה ערוצים מקסימלי בו-זמנית מצינורות מכפיל תמונות דרך לוח רכישת נתונים. תמונת סריקה אוספת תמונות מחסנית Z על ידי שליטה בציר Z של המטרה ואוספת תמונות זמן-lapse במצב יחיד או מחזורי.

שמור את התמונות בקובץ TIF יחיד בעומק של 16 סיביות. באמצעות תוכנת Amira, עבד ערימות תמונות גידול לתמונה תלת מימדית אחת על ידי פתיחת קובץ TIF המכיל את קבוצת תמונות מחסנית Zs. השתמש בפונקציה TEX כדי ליצור עיבוד תלת מימדי.

סביר להניח שתמונת גידול ראשונית גדולה עם מספר קבוצות פולשניות מנותקות קטנות יותר או igs תהיה נוכחת בתמונה המעובדת. כדי למדוד את נפח הגידול, הגדר את הסף של אזור הגידול הראשוני וכל פרוסה של ערימת התמונות תתקן ותבטל את הקרינה ברקע. חזור על הליך הסף עבור כל קבוצה פולשנית.

לאחר בחירת הגידול הראשוני וכל ה-igs, קבע את מדידת הנפח וכן את קואורדינטות ה-OID של הגידול X, Y ו-Z עבור הגידול הראשוני. על מנת לחשב מרחקים של igs מנקודת הגידול המרכזית, חשב את האינדקס הפולשני של הגידול או ti באמצעות ti שווה ל-N NT כפול VT כפול dt. כאשר NT שווה למספר הכולל של igs בתמונה, VT שווה לנפח הכולל של כל ה-igs ו-DT שווה למרחק הכולל שעברו כל הקבוצות הפולשניות ממרכז הגידול הראשוני.

ניתן ליצור עיבודים תלת-ממדיים עם פירוט טופוגרפי גדול יותר על-ידי ייבוא קובצי הקצה המקוריים בשחור-לבן של 16 סיביות לרכיבי NIS של Nikon בתוך התוכנה. צרו קובץ דחיסות נייטרלית מאוסף תמונות. לאחר מכן כייל את המסמך באופן ידני כדי לציין את גודל הפיקסלים לעיבודים באיכות גבוהה יותר.

הוסף פרוסות נוספות במישור Z. איור זה מציג דוגמה לנתונים הגולמיים שנרכשו משני רכיבי NIS של תמונת פוטון או מראה. ניתן להשתמש בתוכנה כדי לשחזר את הנתונים הגולמיים של גידולי הלשון, המוצגים באיור זה.

לוח זה מציג דוגמה לעיבוד תלת מימדי באמצעות פונקציית TEX בתוכנת Amira. להלן דוגמה לסף של קטע בודד של שני פוטונים מערימת התמונה כדי לזהות קבוצות פולשניות מהגידול הראשוני כמו גם ממרכז הגידול הראשוני או ה-oid. לאחר ניתוח כל קטע סף, אמירה מכמתת את הנפח והמרחק שעברה כל קבוצה פולשנית מהסנטרו.

ניתן להדגים נתונים אלה באופן גרפי ולהשתמש בהם כדי להשיג את הערך המספרי עבור הרמה המלאה של פלישת תאי הגידול. ניתן לייחס לאתר הראשוני המוצג כאן תמונות מייצגות של גידולים כפי שהם מוצגים על ידי תיוג אימונוהיסטוכימיה פתולוגי קונבנציונאלי בהשוואה לתמונה תלת מימדית של גידול דומה באמצעות הפרוטוקול המתואר לאחר שליטה מנקודת מיצוי הלשון ועד לעיבוד התלת מימד הסופי, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשעתיים אם מבוצעת כראוי תוך ניסיון הליך זה, הקפד לא לנקב את הלשון עם המחט, ובכך לאבד תאי גידול ולעכב את הגידול לנקוט לאחר הליך זה. ניתן לבצע בדיקות של תרכובות טיפוליות או תאים עם רמות חלבון שעברו מניפולציה על מנת לקבוע את יעילותם על פלישת סרטן הפה.

בסביבה in vivo, אל תשכח שעבודה עם תאי גידול אנושיים ששונו עם lentivirus היא אמצעי זהירות מסוכנים כגון PPE מתאים ועבודה במכסה המנוע הלמינרי המוסמך BSL יש לנקוט תמיד בזמן עבודה עם עכברים מוזרקים.