Name: הקרנת תפוקה גבוהה של פעילות Endoglucanase פטרייתיים ב Escherichia coli /em (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: למד שיטת סקרינינג בעלת תפוקה גבוהה לפעילות אנדוגלוקנאז פטרייתית ב-Escherichia coli באמצעות צבע Congo Red. שיטה זו מאפשרת הערכה חזותית מהירה של פעילות אנזימטית ללא צורך בטיהור חלבונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי גורדון ובטי מור קרן, ועל ידי היוזמה המדע UNCF / מרק.

1. צלחת הקרנת הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף LB 25 גרם צמיחה בינוני, אגר 15g ו 1.5g carboxymethyl תאית (CMC) המצע במים מזוקקים עד 1 ליטר ו החיטוי לעקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מעוקר, לאפשר בינוני להצטנן ולהוסיף אנטיביוטיקה המתאימה IPTG לריכוז סופי של 100μM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים לתוך כל אחד בינוני 200 מ"ל 5 צלחות פטרי גדול מרובע / מגשים המבדק (240 x 240 x 20 מ"מ או יותר). אפשר צלחות להתייבש לחלוטין. </li></ol> 2. Endoglucanase הדור ספריה מסך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת ספרייה של תחום קטליטי endoglucanase (ים). ניתן להשיג בדרכים רבות (למשל, אתר מכוונת או mutagenesis רקומבינציה אקראית, וכו ') נקבעת על ידי החוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Clone הספרייה לתוך וקטור כזה כי הם תחת שליטתה של האמרגן T7 עם המפעיל לאק, ומכילים רצף האות pelB עבור המיקוד periplasm. דוגמה וקטור מתאים pET22b (+) מ Novagen. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרה הספרייה endoglucanase לתוך E. coli זן BL21 (DE3) ו צלחת מושבות אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שינוי בן לילה ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת קיסמים סטרילי, לחסן שיבוטים לתוך 96 צלחות היטב היטב עמוק המכיל מדיום LB 400μL בתוספת אנטיביוטיקה מתאימה. לדגור על 37 מעלות צלזיוס לילה עם רועד בסל"ד 250. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף גליצרול סטרילי עד 96 תרבויות לילה טוב לריכוז סופי של 10% עבור אחסון לטווח ארוך ב -80 ° C. זו תהיה צלחת מאסטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות חותמת 96 פינים, לשכפל תרבויות צלחת לילה על גבי צלחות ההקרנה המכיל IPTG ו CMC. עד 5 סטים של תרבויות לילה יכול להיות מוטבע על כל צלחת ההקרנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבל צלחות ההקרנה כך זהות והכיוון של הצלחת 96 כל טוב ידוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הספריות חותמת בטמפרטורת החדר (17-25 מעלות) למשך הלילה או עד מושבות גלוי יצרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף צלחת עם מים מזוקקים עד כל עקבות המושבות יוסרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים קונגו האדום (CR; 0.5% במים) לצלחת שטף. הקפד להוסיף CR מספיק כדי לכסות את הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 15 דקות בטמפרטורת החדר. לא יעלה על 15 דקות הדגירה CR. פעמים הדגירה ארוכים תגרום הילות פחות ברורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את CR ומוסיפים כמות נדיבה (יותר ממספיק כדי לכסות את צלחת) של NaCl 1M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 15 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את NaCl לחשוף הילות השפלה CMC. לקבלת רזולוציה טובה יותר של הילות, פעמים הדגירה כבר עם מכבסת NaCl NaCl או מרובים ייתכן שתידרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת קיסם סטרילי, להרים פעיל שיבוטים אנזימים מהצלחת האב אפיון נוסף. </li></ol> 3. נציג תוצאות: דוגמה readout עבור תפוקה גבוהה במסך זה מוצג באיור 3. המשובטים ניתן לזהות פעיל, פעיל חלושות, ופעיל מאוד בהתבסס על גודל של אזורי השפלה. תכונה זו שימושית במיוחד אם אנזים הפעילות ידוע נכלל בספריה כהפניה. כפי שמוצג כאן, זיהוי של אנזימים פעילים איתנה לשחזור. עם זאת, יש להיות מודעים לכך תיוג נאותה של לוחות ההקרנה הוא מאוד חשוב. החוקר חייב להיות מסוגל לזהות גרסאות פעיל לאחר כביסה המושבות משם, על מנת לאסוף אותם מהצלחת האב מאוחסנים -80 ° C לאפיון נוסף. לבסוף, קשה להעריך מראש את הקשר בין פעילות על מצעים מלאכותיים מול טבעיים. לכן, החוקר חייב לבדוק את כל שיבוטים חיובית על חומר תעשייתי רלוונטי לקביעת כושר חלבון. <img src="/files/ftp_upload/2942/2942fig1.jpg" alt="איור 1"> באיור 1. מתווה סכמטי של תהליך המיון. תאים הופכים עם ספריה endoglucanase ו מצופה סלקטיבי עבור מושבות אחת. המשובטים הרים גדל בן לילה לאחסון (1) ב -80 ° C ו (2) ציפוי העתק על צלחות המכילות CMC ו IPTG לגרום ביטוי endoglucanase ב 96 צלחות היטב עמוק היטב. שיבוטים פעילים נקטפים מהצלחת האב מאוחסנים -80 ° C. <img src="/files/ftp_upload/2942/2942fig2.jpg" alt="איור 2"> איור 2. שיבוט וביטוי של תחומים קטליטי פטרייתי ב E. coli. (א) וקטור Endoglucanase הביטוי. הגנים היו משובטים לתוך pET22b (+) (Novagen) תחת שליטה של ​​האמרגן T7. (ב) פאנל ימין: endoglucanase-לבטא BL21 (DE3) המושבות. פאנל משמאל: הילות השפלה CMC לאחר שטיפה ופיתוח עם קונגו האדום. <img src="/files/ftp_upload/2942/2942fig3.jpg" alt="איור 3"> איור 3. תוצאות המדגם מן המסך האדום CMC / קונגו. תמונות שצולמו של צלחות ההקרנה לאחר שטיפה ופיתוח קונגו האדום. כל מושבות על זהצלחות creening היו בסדר גודל דומה.

<ol><li>Atsumi, S., Hanai, T., Liao, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-fermentative+pathways+for+synthesis+of+branched-chain+higher+alcohols+as+biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels.</a> Nature. 451, 86-89 (2008).</li>
<li>Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulases+and+biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cellulases and biofuels.</a> Curr Opin Biotechnol. 20, 295-299 (2009).</li>
<li>Qin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+endoglucanase+II+from+Trichoderma+reesei+to+improve+the+catalytic+efficiency+at+a+higher+pH+optimum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering endoglucanase II from Trichoderma reesei to improve the catalytic efficiency at a higher pH optimum.</a> J Biotechnol. 135, 190-195 (2008).</li>
<li>Nakazawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+endoglucanase+III+%28Cel12A%29+from+Trichoderma+reesei%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of endoglucanase III (Cel12A) from Trichoderma reesei.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 83, 649-657 (2009).</li>
<li>Heinzelman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+family+of+thermostable+fungal+cellulases+created+by+structure-guided+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">A family of thermostable fungal cellulases created by structure-guided recombination.</a> Proc Natl Acad Sci. 106, 5610-5615 (2009).</li>
<li>Heinzelman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCHEMA+recombination+of+a+fungal+cellulase+uncovers+a+single+mutation+that+contributes+markedly+to+stability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">SCHEMA recombination of a fungal cellulase uncovers a single mutation that contributes markedly to stability.</a> J Biol Chem. 284, 26229-26233 (2009).</li>
<li>Lantz, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypocrea+jecorina+CEL6A+protein+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Hypocrea jecorina CEL6A protein engineering.</a> Biotechnol Biofuels. 8, 3-20 (2010).</li>
<li>Mahadevan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+and+CBM+engineering+of+Cel5A+%28Thermotoga+maritima%29%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis and CBM engineering of Cel5A (Thermotoga maritima).</a> FEMS Microbiol Lett. 287, 205-211 (2008).</li>
<li>Nakazawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+catalytic+domains+of+Trichoderma+reesei+endoglucanase+I%2C+II%2C+and+III%2C+expressed+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the catalytic domains of Trichoderma reesei endoglucanase I, II, and III, expressed in Escherichia coli.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 81, 681-689 (2008).</li>
<li>Wang, H., Jones, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+Macrophomina+phaseolina+endoglucanase+%28EGL+1%29+gene+product+in+bacterial+and+yeast+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Biochem+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Properties of the Macrophomina phaseolina endoglucanase (EGL 1) gene product in bacterial and yeast expression systems.</a> Appl Biochem Biotechnol. 81, 153-160 (1999).</li>
<li>Howard, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+activity+of+a+Phanerochaete+chrysosporium+cellobiohydrolase+%28CBHI.1%29+expressed+as+a+heterologous+protein+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Afr+J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Enzyme activity of a Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase (CBHI.1) expressed as a heterologous protein from Escherichia coli.</a> Afr J Biotechnol. 2, 296-300 (2003).</li>
<li>Howard, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+a+chimeric+Phanerochaete+chrysosporium+cellobiohydrolase+expressed+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Afr+J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Characterisation of a chimeric Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase expressed from Escherichia coli.</a> Afr J Biotechnol. 3, 349-352 (2004).</li>
<li>Teather, R. M., Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Congo+red-polysaccharide+interactions+in+enumeration+and+characterization+of+cellulolytic+bacteria+from+the+bovine+rumen%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Env+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen.</a> Appl Env Microbiol. 43, 777-780 (1982).</li>
<li>Gilkes, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mode+of+action+and+substrate+specificities+of+cellulases+from+cloned+bacterial+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Mode of action and substrate specificities of cellulases from cloned bacterial genes.</a> J Bio Chem. 259, 10455-10459 (1984).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

פרוטוקול המתואר כאן מאפשר זיהוי מהיר תפוקה גבוהה של אנזימים פעילים, עם מניפולציה מינימלית. איתור פעילות רגיש למדי, איכותית משקף את היקף הפעילות בתוך התא. קלות השימוש שעושה שיטה זו מתאימה למגוון רחב של ספריות האנזים, מוגבל רק על ידי ביטוי פונקציונלית E. coli. יתר על כן, הקרנת פעילות מסוג זה אינו מוגבל cellulases פטרייתי, אבל ניתן להתאים לכל פעילות endoglucanase, או כל פעילות cellulase שעבורם יש מצע מסיסים (כמו CMC).

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר מוצר </th></tr><tr><td> IPTG </td><td> סיגמא </td><td> I1284 </td></tr><tr><td> קונגו אדום </td><td> סיגמא </td><td> C6277 </td></tr><tr><td> Carboxymethyl תאית </td><td> סיגמא </td><td> 360384 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> סיגמא </td><td> S1679 </td></tr><tr><td> Bacto-agar </td><td> BD Biosciences </td><td> 214030 </td></tr><tr><td> המבדק צלחות </td><td> Thermo Scientific </td><td> 240845 </td></tr></tbody></table>

הקרנת תפוקה גבוהה של פעילות endoglucanase פטרייתיים ב escherichia coli</em

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase אנזימים (endoglucanases, cellobiohydrolases, ו β-glucosidases) hydrolyze תאית לסוכרים רכיב, אשר בתורו יכול להיות מומר כהלים דלק 1. הפוטנציאל הידרוליזה אנזימטית של ביומסה cellulosic לספק אנרגיה מתחדשת הגביר את המאמצים מהנדס cellulases עבור 2 דלק חסכוני הייצור. עניין מיוחד הם cellulases פטרייתי 3-8, אשר כבר נמצאים בשימוש תעשייתי עבור מזונות ועיבוד טקסטיל. זיהוי וריאנטים פעיל בין ספריה של cellulases מוטציה הוא קריטי לתהליך ההנדסה; מוטנטים פעילים ניתן לבדוק נוספת תכונות משופרות ו / או נתון mutagenesis נוספים. הנדסה יעיל של cellulases פטרייתי כבר הקשו על ידי היעדר כלים גנטית אורגניזמים מקומיים על ידי קשיים בהבעת האנזימים המארחים Heterologous. לאחרונה, פיתח Morikawa ועמיתיו שיטה לביטוי ב E. coli התחומים הקטליטית של endoglucanases מ ח jecorina 3,9, פטריות תעשייתי חשוב עם יכולת להפריש cellulases בכמויות גדולות. פונקציונלית E. הביטוי coli כבר דווח על cellulases מן פטריות אחרים, כולל Macrophomina phaseolina 10 ו Phanerochaete chrysosporium 11-12. אנו מציגים שיטה ההקרנה תפוקה גבוהה של פעילות endoglucanase פטרייתי ב E. coli. (איור 1) שיטה זו משתמשת חיידקים המשותף צבען האדום קונגו (CR) כדי להמחיש השפלה אנזימטית של תאית carboxymethyl (CMC) על ידי תאים גוברת על בינוני מוצק. Assay פעילות דורשת ריאגנטים זולה, מניפולציה מינימלית, נותן תוצאות חד משמעיות כמו אזורי השפלה (&quot;הילות&quot;) במקום מושבה. למרות מדד כמותי של הפעילות האנזימטית לא ניתן לקבוע לפי שיטה זו, מצאנו כי גודל הילה בקורלציה עם הפעילות האנזימטית הכולל בתא. אפיון נוסף של שיבוטים חיובי הפרט יקבע, כושר חלבון יחסית. מסורתית חיידקי כל CMC / CR תא פעילות מבחני 13 לערב לשפוך CMC אגר המכיל על מושבות, אשר כפופה זיהום צולב, או תרבויות דוגרים בבארות אגר CMC, המהווה פחות נגישה ניסויים בקנה מידה גדול. כאן אנו מדווחים על פרוטוקול משופר משנה לשטוף שיטות קיימות 14 לפעילות cellulase: התאים גדלו על צלחות אגר CMC מוסרים לפני מכתים CR. פרוטוקול שלנו מפחית באופן משמעותי את זיהום צולבות היא מדרגית, המאפשר הקרנת מהירה של אלפי שיבוטים. בנוסף ח אנזימים jecorina, יש לנו הביע הוקרן וריאנטים endoglucanase מן aurantiacus Thermoascus ו Penicillium decumbens (שמוצג באיור 2), טוען כי פרוטוקול זה הוא ישים אנזימים מתוך מגוון רחב של אורגניזמים.

אנו מתארים עלות נמוכה, גבוה שיטת התפוקה למסך לפעילות endoglucanase פטרייתי ב<em&gt; א coli.</em&gt; השיטה מסתמכת על readout ויזואלית פשוטה של ​​השפלה המצע, אינו דורש טיהור האנזים, והיא ניתנת להרחבה. זה מאפשר הקרנה מהירה של ספריות גדולות של וריאנטים של האנזים.

הקרנת תפוקה גבוהה של פעילות Endoglucanase פטרייתיים ב Escherichia coli</em

אנזימי צלולאז (אנדוגלוקנזים, צלוביוהידרולזים ו-&beta;-גלוקוסידזים) ממיסים צלולוז לסוכרים מרכיבים, אשר בתורם יכולים להומר...

בסריקה זו בעלת תפוקה גבוהה לפעילות אנדוגלוקונאט פטרייתית ב-e coli, משתמשים בצבע המיקרוביאלי הנפוץ Congo Red כדי להדגים ויזואלית פירוק אנזימטי של carboxy methyl cellulose על ידי תאים הגדלים על מצע מוצק; תחילה, התאים עוברים טרנספורמציה עם ספריית אנדוגלוקונאט ונזרעים באופן סלקטיבי לקבלת מושבות בודדות. לאחר מכן, נבחרים שבטים בודדים והם גדלים למשך לילה בלוחות של 96 בארות. בשלב הבא, מבוצעת סריקה אנזימטית באמצעות זריעה בשכבה (replica plating) על לוחי CMC המכילים IPTG להשראת ביטוי של אנדוגלוקונאט.לבסוף, שבטי ה-act נבחרים מלוח המאסטר המאוחסן במינוס 80 מעלות Celsius. בדיקה זו מניבה תוצאות חד-משמעיות כשהיא יוצרת אזורי פירוק באתר המושבה, כאשר גודל ההילה מתואם לפעילות האנזימטית ומאפשר הערכה איכותנית של כשירות חלבונית יחסית. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שיטת ה-overlay, הוא שהיא מאפשרת ניתוח בתפוקה גבוהה עם שיעור נמוך מאוד של תוצאות חיוביות שגויות.הוסיפו 25 גרם של מצע גידול LB, 15 גרם אגר ו-1.5 גרם של תַּשִׁית carboxy methylcellulose לליטר אחד של מים מזוקקים, ועקרו באמצעות אוטוקלאב. לאחר קירור המצע, הוסיפו אנטיביוטיקה מתאימה ו-IPTG לריכוז סופי של 100 micromolar. כעת שפכו 200 מיליליטר של מצע לכל אחת מחמש צלחות פטרי ריבועיות גדולות או תבניות לבדיקה ביולוגית, והמתינו שהצלחות יתייבשו לחלוטין.ראשית, ייצרו ספרייה של דומיינים קטליים של endo gluconate לתוך וקטור מתאים כגון PET 22 B plus מבית novagen. ראשית, ייצרו ספרייה של דומיינים קטליים של endo gluconate לתוך וקטור מתאים כגון PET 22 B plus מבית Novagen, המכיל את פרומוטר T7 עם ኦפרטור lac ורצף אות PAL LV למיקוד לפריפלזמה. טרנספורמציה של ספריית ה-endo gluconate לתוך זן e coli BL 21 DE3 על מצעים לקבלת מושבות בודדות באמצעות חרוזים מזכוכית, והדגירה של הטרנספורמציה למשך לילה ב-37 °C. באמצעות קיסמים סטריליים, זרקו את השבטים למבחנות 96.מלאו פלטות בארות עמוקות (deep well plates) ב-400 µL של מצע LB בתוספת אנטיביוטיקה מתאימה. דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה עם ניעור במהירות של 250 RPM. כעת הוסיפו גליצרול סטרילי לתרביות הלילה בפלטות של 96 בארות לצורך אחסון ארוך טווח בטמפרטורה של -80 °C.לוח זה ישמש כלוח המקור (master plate) באמצעות חותמת בעלת 96 פינים; העבירו את תרביות הלילה ללוחות הסריקה המכילים IPTG ו-CMC עבור כל לוח סריקה. החתימו חמישה סטים של תרביות לילה, סמנו אותן והדגירו בטמפרטורת החדר עד להיווצרות מושבות גלויות. המשיכו לשטוף את הלוח במים מזוקקים עד להסרת כל השאריות של המושבות.שפכו כמות מספקת של Congo red בריכוז 0.5% כדי לכסות את הצלחת השטופה, והדגירו למשך מקסימום 15 דקות בטמפרטורת החדר. שפכו החוצה את הצבע והוסיפו כמות נדיבה של sodium chloride בריכוז one molar, והדגירו למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השליכו את ה-sodium chloride כדי לחשוף הילה של פירוק CMC.בעזרת קיסם סטרילי, בחרו אנזימים פעילים מהלוח הראשי לצורך אפיון נוסף. בדוגמה זו, וקטורים לביטוי endo gluconate נוצרו ב-PET 22 B plus תחת בקרת ה-T seven promoter עם lack operator. המושבות של BL 21 המבטאות endo gluconate שנוצרו עברו סינון כדי להפיק הילות של פירוק CMC. לאחר שטיפה ופיתוח עם Congo Red, ניתן בדרך כלל לזהות את השיבוטים בלוחות סינון אלה כבלתי פעילים, פעילים באופן חלש או פעילים מאוד, בהתבסס על גודל אזורי הפירוק.במקרה זה, זיהוי האנזימים הפעילים הוא חסון וניתן לשחזור. חשוב לזכור לסמן כראוי את לוחות הסריקה כדי לזהות נכון את השיבוטים החיוביים בלוח המאסטר.

high-throughput-screening-fungal-endoglucanase-activity-escherichia

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מתאר מסך התפוקה גבוהה לפעילות cellulolytic מספריית metagenomic לידי ביטוי Escherichia coli. המסך הוא פתרון מבוסס מאוד אוטומטיות, ומשתמש אחד סיר כימיה 384 microplates היטב עם readout הסופי כמו מדידת ספיגת.

מסך התפוקה גבוהה עבור Biomining פעילות cellulase מספריות Metagenomic

מקור: קים, ה. ואח', סקר רב-אנזימטי באמצעות מערכת סקר אנזימים גנטית בעלת תפוקה גבוהה. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים שיטת סינון גנטית לזיהוי ביטוי אנזימים באמצעות ספריות פוסמידים מטאגנומיות וסובסטרטים כרוגניים. ציטומטריית זרימה מזהה ומבודדת תאים בודדים המייצרים תוצרים צבעוניים, ומאפשרת בחירה בתפוקה גבוהה של תאים פעילים המבטאים אנזימים.

זיהוי ביטוי אנזימי מטרה בתאים חיידקיים מהונדסים גנטית

בסרטון זה, אנו מדגימים בדיקת תפוקה גבוהה לבדיקת אנזימים פעילים בפחמימות באמצעות מצעי הידרוג'ל פולימריים כרומוגניים בלתי מסיסים. האנזים מפרק מצעים אלה למוצר צבעוני מסיס שניתן לכמת על ידי מדידת עוצמת הצבע של המוצר.

בדיקת סינון אנזימים על בסיס הידרוג'ל פולימרי כרומוגני: שיטה בעלת תפוקה גבוהה לסינון האנזימים הפעילים בפחמימות באמצעות מצעים סינתטיים

גישה יעילה לבדיקות סקר לאיתור הביטוי של חלבונים בממברנה רקומביננטי בcoli Escherichia מבוסס על היתוך לחלבון פלואורסצנטי ירוק מוצגת.

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

ביטוי משותף של חלבונים הוא אלטרנטיבה רבת עוצמה לבנייה מחדש במבחנה של קומפלקסים של חלבונים, והוא מסייע בביצוע בדיקות ביוכימיות וגנטיות in vivo. כאן אנו מדווחים על השימוש בביטוי משותף של חלבונים ב-Escherichia coli כדי להשיג קומפלקסים של חלבונים, ולכוונן את תדירות המוטציות של התאים.

תועלת רבה פנים של Co-ביטוי חלבון ב<em&gt; Coli Escherichia</em

עבודה זו מציגה שיטה לסריקת תפוקה גבוהה באמצעות מערכת סינון אנזימים גנטית אוניברסלית שניתן ליישם באופן תיאורטי על למעלה מ-200 אנזימים. כאן, מערכת הסינון היחידה מזהה שלושה אנזימים שונים (ליפאז, צלולאז ופוספטאז אלקליין) פשוט על ידי שינוי הסובסטרט המשמש (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside ופניל פוספט).

הקרנה רב-אנזים באמצעות מערכת הקרנת אנזים הגנטי תפוקה גבוהה

מתואר מבחן תפוקה גבוהה לבדיקת אנזימים. ערכת בדיקה מוכנה לשימוש מרובה זו מורכבת ממצעי Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) שנבחרו מראש ומצעי Chromogenic B iomass (ICB) מורכביםI בלתי מסיסים. אנזימי המטרה הם אנדו-אנזימים ופרוטאזות מפרקים רב-סוכרים.

הקרנת תפוקה גבוהה של אנזימים פחמימות-משפיל שימוש רומן מסיסים chromogenic המצע Assay ערכות

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה תפוקה גבוהה על המסך באופן פונקציונלי עבור חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס.

הקרנה תפוקה גבוהה של חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס

חיידקי מעיים עשויים להשפיע באופן חיובי או שלילי על בריאות המארח שלהם באמצעות מנגנונים ספציפיים או שמורים. Caenorhabditis elegans היא פלטפורמה נוחה לסינון עבור חיידקים כאלה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר סינון בתפוקה גבוהה של 48 חיידקים מבודדים להשפעה על עמידות לעקה של נמטודה, המשמשים כפרוקסי לבריאות התולעים.

הקרנה בתפוקה גבוהה של מבודדים מיקרוביאליים עם השפעה על בריאות Caenorhabditis elegans

עבודה זו מתארת פרוטוקול לבדיקה גנטית מדכאת מולטי-קופיות בסכיזוזאכרומיצס פומבה. מסך זה משתמש בספריית פלסמידים כלל-גנומית כדי לזהות שיבוטים מדכאים של פנוטיפ אובדן תפקוד הקשור לזן מוטנטי שאילתה. מדכאים גנטיים חדשים של מוטציית האפס ell1 זוהו באמצעות מסך זה.

בדיקה גנטית לזיהוי מדכאי ריבוי עותקים בסכיזוזאכרומיצס פומבה

פרוטוקול זה מציג תהליך סינון סטנדרטי עם תפוקה גבוהה עבור מיקרואורגניזמים תעשייתיים. הוא כולל בניית ספריית מוטנטים באמצעות מוטגנזה של ARTP, ביצוע סקר חיובי לטיפות באמצעות מיקרופלואידיקה אוטומטית, ולאחר מכן אימות התוצאות. אמינות זרימת העבודה אושרה על ידי סינון זני B. coagulans בעלי תפוקה גבוהה.

סקר מהיר של מוטנטים של חיידקים קואגולנס המופרזים בחומצה L-לקטית באמצעות פלטפורמה מיקרופלואידית אוטומטית של טיפות

למד שיטת סקרינינג בעלת תפוקה גבוהה לפעילות אנדוגלוקנאז פטרייתית ב-Escherichia coli באמצעות צבע Congo Red. שיטה זו מאפשרת הערכה חזותית מהירה של פעילות אנזימטית ללא צורך בטיהור חלבונים.

הקרנת תפוקה גבוהה של פעילות Endoglucanase פטרייתיים ב Escherichia coli

גלה סרטונים נוספים