פיתוח נייד מסוג ספציפי נגד HIV gp120 aptamers למסירה siRNA

המטרה הכללית של הניסויים הבאים היא להפיק Aptima RNA in vitro עבור חלבון HIV-1 gp120 באמצעות ממבrane ניטרוסלולוז. דבר זה מושג על ידי PCR ותמלול T7 subsequent in vitro. כדי להכין את ה-DNA הראשוני ואת ספריית ה-RNA האקראית, כשלב שני, תערובת של חלבון המטרה וספריית ה-RNA נמרח על מסנן ניטרוסלולוז שהורטב מראש, המאפשר בידוד של מולקולות RNA קשורות ממיני RNA שאינם קשורים.

לאחר 12 סבבי סלקציה, ספריית ה-RNA משתבטת ומורצפה על מנת לזהות את המועמדים הבודדים לאפטימרים של RNA מהספרייה. התוצאות שמתקבלות מזהות מספר אפטימרים חדשים בעלי זיקה נאנומולרית, בהסתמך על בדיקות gel shift ומיקרוסקופיה קונפוקלית. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות מדידה קיימות, כגון בידים (beads) או שיטות בידוד מבוססות עמודה, הוא הפשטות שלה והעובדה שהיא אינה דורשת טיפול מקדים של החלבון או הספריות, כגון קיבוע של החלבון על גבי הבידים. ספריית ה-RNA לבידוד של RNA Aptamers נגד HIV GP120 מוכנה מספריית DNA שסונתזה מסחרית ומכילה 50 נוקלאוטידים של רצפים אקראיים.

רצף ספריית האוליגו של ה-DNA החד-גדילי הוא באורך 81 נוקלאוטידים. כפי שמוצג בתרשים זה, האזור האקראי מוקף באזורים קבועים, A 30 tumor בקצה חמש פריים, ו-16 MA בקצה שלוש פריים. האזורים הקבועים כוללים את מקדם ה-T seven עבור תמלול in vitro, ותג שלוש פריים עבור R-T-P-C-R.

הגבירו את ספריית האוליגו-רנדום של ה-DNA בעל הגדיל الواحد באמצעות PCR; הגבילו את ה-PCR ל-10 מחזורים כדי לשמר את השפע של ספריית ה-DNA המקורית. לאחר תגובות ה-PCR, שחזרו את מאגר ה-DNA בעל הגדיל הכפול המוגבר באמצעות ערכה לטיהור ג'ל. לאחר מכן, המירו את ה-DNA בעל הגדיל הכפול לספריית RNA באמצעות ערכת ה-cript לפי הוראות היצרן; בתערובת תגובת השעתוק, החליפו את ה-CTP וה-UTP ב-two fluoro pyrimidine CTP וב-two fluoro pyrimidine UTP כדי להפיק RNA העמיד לריבונוקלאס.

עם השלמת תגובות השעתוק, יש לעכל את התגובות באמצעות DS one להסרת ה-DNA התבנית ולטהר באמצעות ג'ל פוליאקרילאמיד 8% עם urea שבע מולארית. לבסוף, יש לכמת את ספריית ה-RNA המטוהרת באמצעות ספקטרופוטומטר UV. לפני בחירת ה-optimas, הכין את הבאפרים הדרושים ושמור אותם בטמפרטורות המתאימות.

בפר באטמפר בטמפרטורת החדר ובבפרים לקיפול מחדש של RNA ולקישור RNA בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. לפני תחילת מחזור הבחירה הראשון, הכשיר את מאגר ה-RNA האקראי על מסנן ניטרוסלולוז שהורטב מראש בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, כדי למזער קישור לא ספציפי למסנן. לאחר 30 דקות, הסר את מסנן הניטרוסלולוז.

שלבו את מאגר ה-RNA האקראי שעבר ניקוי מקדים ואת חלבון HIV one bowel GP one 20 בבאפר קישור RNA עם מלח בריכוז נמוך, והדגירו על פלטפורמה מסתובבת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, העבירו את התגובה דרך מסנן ניטרוסלולוז שהורטב מראש ושטפו עם 1 mL של באפר קישור RNA עם מלח בריכוז נמוך כדי להמיס את ה-RNA הקשור מהמסנן. הוציאו את ממברנת הניטרוסלולוז מתוכנית מחזיק המסנן.

הוסיפו 200 µL של elu buffer לממברנה וחממו בטמפרטורה של 95 °C למשך חמש דקות. לאחר שה-RNA נשטף מהמסנן, סובבו את המבחנה קצרות (spin), העבירו את תמיססת ה-RNA למבחנה חדשה ובצעו מיצוי פנול-כלורופורם (phenol chloroform extraction) לנוזל השטוף. השתמשו בעמודת MicroCon YM 30 כדי לרכז את ה-RNA ושטפו את ה-RNA שהושג באמצעות 20 µL של RNAs free water.

לאחר מכן, מאגר ה-RNA שהופק עובר תעתוק הפוך והגברה של 15 מחזורי PCR. לאחר טיהור המאגר הדו-גדילי שהוגבר, הוא מתעתק למאגר RNA חדש כפי שהודגם בעבר, לפני סבב הברירה הבא. יש לקפל מחדש את מאגר ה-RNA בבפר HBS בריכוז פי 1, לחמם ל-95 °C למשך שלוש דקות, ולאחר מכן להניח לקירור איטי ל-37 °C.

המשיכו בדגירה בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 דקות. ספחו את ה-RNA המקופל מחדש, והעבירו למסנן ניטרוסלולוז למשך 30 דקות לפני הדגירה עם חלבון ה-HIV gp120 המטרה עבור סבב הברירה הבא. על מנת להשיג בהצלחה את ה-aptamers בעלי זיקה גבוהה יותר לקשירה, יש לשלוט בקפידה ברמת מחמירות הברירה על ידי התאמת תנאי הברירה.

תנאי הברירה מוצגים בטבלה זו. עבור סבבי cellex ראשון עד רביעי, דגרו את מאגר ה-RNA שעבר ניקוי מקדים עם חלבון המטרה בבופר קישור ל-RNA בריכוז מלח נמוך למשך 30 דקות. לאחר הסבב הרביעי של cellex, השתמשו בבופר קישור ל-RNA בריכוז מלח גבוה ככל שה-cellex מתקדם.

הפחית את כמות חלבון GP120 והעלה את כמות ה-tRNA של שמרים מתחרים כדי להגביר את רמת הסלקטיביות (stringency) של בחירת האפטמרים בכל מחזור. התקדמות בחירת האפטמרים ל-HIV-1 GP120 מנוטרת באמצעות בדיקת קישור למסנן (filter binding assay). בסרטון זה, תיבחן הדגימה של 12 מאגרי ה-RNA שנאספו לאחר כל מחזורי הבחירה.

ראשית, הסירו את קבוצת ה-tri phosphate בקצה five prime על ידי טיפול של כל מאגר ה-RNA ב-calf intestinal phosphatase למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 °C. כדי להכין את ה-RNA שעובד ב-CIP לסימון באמצעות T four polynucleotide kinase ו-P 32 80 p, חממו ל-95 °C למשך חמש דקות, ולאחר מכן קררו על קרח. סימון ה-RNA מבוצע בחדר חם המיועד לניסויים הכוללים רדיואקטיביות, עם PNK buffer, T four Polynucleotide kinase, 1 µL של gamma P 32 A TP ומים עד לנפח של 20 µL. דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות.

לאחר 30 דקות, הוסף 20 µL מים לכל תגובה וטהר באמצעות עמודת G 50. לבסוף, השג 40 µL של RNA מסומן בריכוז סופי של 250 nM refold, כאשר כל מאגר RNA מסומן נמצא בבופר HBS בריכוז פי 1, וחמם ל-95 °C למשך שלוש דקות. לאחר מכן, אפשר לדגימה להתקרר ל-37 °C, תהליך שייקח 30 עד 40 דקות.

המשיכו את הדגירה בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 דקות. לאחר שה-RNA pool עבר קיפול מחדש, בצעו תגובת קישור של 100 µL. ערבבו את ה-RNA pool המסומן בקצה עם חלבון GP one 20 ועודף מולרי של פי עשרה של TRNA מתחרה שאינו ספציפי בבופר קישור RNA בריכוז מלח גבוה, והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

בסיום 30 הדקות, יש להפריד 50 µL מתגובת הקישור באמצעות מסנן ניטרוסלולוז שהורטב מראש. לאחר מכן, יש לשטוף את המסנן עם 2 mL של בופר קישור ולמדוד את הפעילות הרדיואקטיבית שנותרה על המסנן באמצעות מונה סינליציה רב-תכליתי כביקורת קלט. במקביל, עבור 50 µL הנותרים מתגובת הקישור, נותח מבחן הקישור של מאגר ה-RNA לאחר כל מחזור בחירה באמצעות מבחן קישור למסנן עם tRNA תחרותי, כדי לעקוב אחר ההתקדמות של HIV-1 gp120.

פעילויות קישור הבחירה של Optima חושבו כאחוז ה-RNA שהוכנס שנשאר על המסנן כקומפלקס חלבון-RNA, כפי שמוצג כאן. מאגר ה-RNA ההתחלתי מראה רק 0.1% מה-RNA שהוכנס שנשאר על הממברנה. עם זאת, לאחר תשעה סבבי בחירה, לספריית ה-RNA התשעית יש 9.72% מה-RNA שהוכנס קשור.

למרות שבוצעו סבבי בחירה נוספים, לא נצפתה העשרה נוספת, מה שמעיד על כך שהושגה קשירה מקסימלית של מאגר ה-RNA. פעילויות הקשירה של מאגרי ה-RNA אושרו בהמשך באמצעות בדיקות gel shift. תוצאות אלו מדגימות כי ליגנדים מסוימים בעלי ספציפיות קשירה גבוהה לחלבון המטרה הועשרו באופן עקבי במאגרי RNA אלו.

בדוגמה זו, מאגר ה-RNA ה-12 הראה את פעילות הקישור הגבוהה ביותר מאחר שניתן להגיע לקישור מרבי של מאגר ה-RNA לאחר סבב הבחירה ה-12; מאגר RNA זה הועבר לתעתוק הפוך ל-CDNA, אשר הוגבר לאחר מכן באמצעות PCR. תוצר ה-PCR טוהה ואז שובט בתוך וקטור TA cloning, ורצפו לאחר יישור של 140 שבטים. שש קבוצות של anti GP one 20 optimas זוהו.

בטבלה זו מצוינות רק הרצפים האקראיים של אזורי הליבה של ה-Aptima. כ-40% מהשבטים מכילים רצף שמור. רצף מייצג אחד מכל קבוצה נבחר לאפיון נוסף בשל שכיחותם היחסית בתוך קבוצתם באמצעות בדיקת הזזת ניידות בג'ל טבעי (native gel mobility shift assay), וחושב קבוע הדיסוציאציה KD של ה-abers המייצגים הללו, לדוגמה, A one.

למיטב ה-abers יש ערך KD גלוי של 52 nanomolar. כפי שמוצג כאן. abers נבחרים אלו יכולים להיקשר באופן סלקטיבי עם יעד ה-HIV-1 gp120, אך לא עם חלבון ה-HIV-gp120 CM. תאי CHO G160 המבטאים באופן יציב את הגליקופרוטאין של מעטפת ה-HIV, gp160, שימשו לבדיקת קישור והפנמה של ה-anti GP120 optimas שנבחרו.

תאים אלה אינם מעבדים GP one 60 ל-GP one 20 ו-G 41 מכיוון שחסרות להם הפרוטאזות המקודדות על ידי gag הדרושות לעיבוד המעטפת. ניתוח בציטומטריה של זרימה מעלה כי ה-abers המסומנים ב-S3 נקשרים באופן ספציפי לתאי CHO GP one 60, אך לא לתאי הבקרה cho EE, שאינם מבטאים GP one 60. יתרה מכך, מיקרוסקופיה קונפוקלית של תאים חיים בזמן אמת בציר Z מעידה כי לאחר שעתיים של אינקובציה, ה-aptima המסומן ב-SI three נבלע באופן סלקטיבי על ידי תאי CHO GP one 60, אך לא על ידי תאי הבקרה cho EE. כמו כן, נצפה כי ה-aptima הצטבר בתוך הציטופלזמה, מה שמרמז כי ה-GP one 20 aptima עשוי להיכנס לתאים באמצעות פגוציטוזה מתווכת רצפטורים.

לבסוף, לאחר הצפייה בסרטון זה, תרכישו הבנה טובה באופן שבו ניתן להשתמש במדידות מבוססות שטח כדי לבודד RNA Abers.