Name: פיתוח נייד מסוג ספציפי נגד HIV gp120 aptamers למסירה siRNA (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: למד לבחור aptamers RNA ספציפיים ל-HIV-1 gp120 באמצעות שיטת SELEX על מסנן ניטרוצלולוזה. השיטה מאפשרת בידוד רצפים בעלי אפיניות ננומולרית ופיתוח כימרות aptamer-siRNA לטיפול ממוקד ב-HIV.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים בריטה Hoehn, Guihua Sun, האריס Soifer וליסה שרר לדיונים מועילים. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות AI29329 ו HL07470 הוענק JJR ריאגנטים הבאים התקבלו באמצעות האיידס NIH מחקר מגיב תוכנית הפניה, אגף איידס, NIAID, NIH: CHO CHO-EE ו-gp160 תא קו; pNL4-3 לוק וקטור; HIV-1 באל gp120 מ DAIDS, NIAID.

<ol><li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment%3A+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249, 505-510 (1990).</li>
<li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346, 818-822 (1990).</li>
<li>Robertson, D. L., Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+in+vitro+of+an+RNA+enzyme+that+specifically+cleaves+single-stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Selection in vitro of an RNA enzyme that specifically cleaves single-stranded DNA.</a> Nature. 344, 467-468 (1990).</li>
<li>Fitzwater, T., Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SELEX+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">A SELEX primer.</a> Methods Enzymol. 267, 275-301 (1996).</li>
<li>Weiss, C. D., White, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+stable+Chinese+hamster+ovary+cells+expressing+wild-type%2C+secreted%2C+and+glycosylphosphatidylinositol-anchored+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of stable Chinese hamster ovary cells expressing wild-type, secreted, and glycosylphosphatidylinositol-anchored human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein.</a> J Virol. 67, 7060-706 (1993).</li>
<li>Vodicka, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indicator+cell+lines+for+detection+of+primary+strains+of+human+and+simian+immunodeficiency+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Indicator cell lines for detection of primary strains of human and simian immunodeficiency viruses.</a> Virology. 233, 193-198> (1997).</li>
<li>Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection%2C+characterization+and+application+of+new+RNA+HIV+gp+120+aptamers+for+facile+delivery+of+Dicer+substrate+siRNAs+into+HIV+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Selection, characterization and application of new RNA HIV gp 120 aptamers for facile delivery of Dicer substrate siRNAs into HIV infected cells.</a> Nucleic Acids Res. , (2009).</li>
<li>Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+biology+of+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">The chemical biology of aptamers.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 48, 2672-2689 (2009).</li>
<li>Famulok, M., Hartig, J. S., Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+aptamers+and+aptazymes+in+biotechnology%2C+diagnostics%2C+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional aptamers and aptazymes in biotechnology, diagnostics, and therapy.</a> Chem Rev. 107, 3715-3743 (2007).</li>
<li>Chu, T. C., Twu, K. Y., Ellington, A. D., Levy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer+mediated+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Aptamer mediated siRNA delivery.</a> Nucleic Acids Res. 34, e73-e73 (2006).</li>
<li>McNamara, J. O., 2nd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+delivery+of+siRNAs+with+aptamer-siRNA+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific delivery of siRNAs with aptamer-siRNA chimeras.</a> Nat Biotechnol. 24, 1005-1015 (2006).</li>
<li>Dassie, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+administration+of+optimized+aptamer-siRNA+chimeras+promotes+regression+of+PSMA-expressing+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systemic administration of optimized aptamer-siRNA chimeras promotes regression of PSMA-expressing tumors.</a> Nat Biotechnol. 27, 839-849 (2009).</li>
<li>Zhou, J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+potential+of+cell-internalizing+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The therapeutic potential of cell-internalizing aptamers.</a> Curr Top Med Chem. 9, 1144-1157 (2009).</li>
<li>Zhou, J., Li, H., Li, S., Zaia, J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+dual+inhibitory+function+aptamer-siRNA+delivery+system+for+HIV-1+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Novel dual inhibitory function aptamer-siRNA delivery system for HIV-1 therapy.</a> Mol Ther. 16, 1481-1489 (2008).</li>
</ol>

י R ו JZ יש פטנט על &quot;מערכת מסוג Cell aptamer-siRNA ספציפיים מסירה לטיפול ב-HIV-1&quot;. USPTO, מס<strong&gt; 12/328994</strong&gt;, תאריך פרסום: 11 ביוני, 2009.

Aptamers הן במבחנה התפתח חומצות גרעין להניח כי ספציפיים יציב צורות תלת ממדיות, ובכך לספק מאוד ספציפיות, וכפותים מולקולות ממוקדות 8. הזיקה נמוך מחייב nanomolar וספציפיות מעודן של aptamers אל המטרות שלהם להפוך אותם כלים תכליתי עבור אבחון, in vivo הדמיה ותרופות 9. עם כניסתו של הטכנולוגיה aptamer למסירה siRNA ממוקד עכשיו זה אפשרי להשתמש בפונקציה מחייב aptamer עבור אנדוציטוזה קולטן בתיווך של siRNAs 10-12. Aptamers שהועלו כנגד קולטני קר...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> MF-Millipore קרום מסנן </td><td> Millipore </td><td> HAWP01300 </td><td> גודל הנקבוביות 0.45 מיקרומטר </td></tr><tr><td> Swinnex בעל מסנן </td><td> Millipore </td><td> SX0001300 </td><td> קוטר 13 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> QIAquick ג&#39;ל הפקת Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 28706 </td><td> דנ&quot;א לטיהור </td></tr><tr><td> Microcon YM-30 טור </td><td> Millipore </td><td> 42410 </td><td> RNA ריכוז </td></tr><tr><td> ביו ספין 30 טור </td><td> Bio-Rad </td><td> 732-6250 </td><td> RNA טיהור </td></tr><tr><td> תקי PCR DNA פולימראז </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> D1806 </td><td></td></tr><tr><td> ThermoScript RT-PCR מערכת </td><td> Invitrogen </td><td> 11146-024 </td><td></td></tr><tr><td> DuraScribe T7 ערכת שעתוק </td><td> EpiCentre </td><td> DS010925 </td><td></td></tr><tr><td> dNTP עבור ה-PCR </td><td> רוש </td><td> 1 581 295 </td><td></td></tr><tr><td> חומצה ריבונוקלאית, העברת E.coli </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> R1753 </td><td> tRNA מתחרה </td></tr><tr><td> HIV-1 Ba-L gp120 חלבון </td><td> המחקר איידס מגיב תוכנית הפניה </td><td> 4961 </td><td> יעד חלבון </td></tr><tr><td> SiRNA משתיק ערכת תיוג - Cy3 </td><td> Ambion </td><td> 1632 </td><td></td></tr><tr><td> חומצה פנול / כלורופורם 01/05 פתרון (pH 4.5) </td><td> Ambion </td><td> AM9720 </td><td></td></tr><tr><td> כלורופורם / Isopropanol 24 / 1 פתרון </td><td> סיגמא </td><td> C0549 </td><td></td></tr><tr><td> עגל phosphatase מעיים (CIP) </td><td> ניו אינגלנד BioLab </td><td> M0290L </td><td></td></tr><tr><td> קינאז polynucleotide T4 </td><td> ניו אינגלנד BioLab </td><td> M0201L </td><td></td></tr><tr><td> גליקוגן </td><td> רוש </td><td> 10 901 393 001 </td><td> RNA משקעים </td></tr><tr><td> Gamma-32-P-ATP </td><td> MP ביו </td><td> 013502002 </td><td> Radiactivity </td></tr><tr><td> 40% AccuGel 19:01 </td><td> אבחון הלאומי </td><td> EC-850 </td><td></td></tr><tr><td> 10xTBE </td><td> אבחון הלאומי </td><td> EC-860 </td><td></td></tr><tr><td> N, N, N, N&#39;-Tetramethylethylenediamine (TMEMD) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> T9281 </td><td></td></tr><tr><td> חנקתי persulfate (APS) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> A3678 </td><td></td></tr><tr><td> L-methioine sulfoximine </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> M5379-250 מ&quot;ג </td><td></td></tr><tr><td> RPMI מדיה 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11835-030 </td><td></td></tr><tr><td> פתרון נתרן ביקרבונט, 7.5% w / v </td><td> Invitrogen </td><td> 25080-094 </td><td></td></tr><tr><td> בינוני Essential Minimum (ממ) (10 ) </td><td> Invitrogen </td><td> 11430-030 </td><td></td></tr><tr><td> ממ שאינם חיוניים חומצת אמינו (100 ) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> ת&quot;א ערכה עם שיבוט PCR 2.1 </td><td> Invitrogen </td><td> K2040-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

פיתוח נייד מסוג ספציפי נגד hiv gp120 aptamers למסירה sirna

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

מגפה עולמית של זיהום על ידי HIV יצרה צורך דחוף כיתות חדשות של סוכנים תרופתי. היכולת חזק של קטן (SI) RNAs התערבות כדי לבלום את הביטוי של תעתיקי רנ&quot;א משלימים המנוצלת כמו סוג חדש של הרפוי עבור מגוון רחב של מחלות כולל איידס. דיווחים קודמים רבים הראו כי הרומן RNAi מבוסס anti-HIV/AIDS אסטרטגיות טיפוליות יש הבטחה רבה, עם זאת, מכשול מרכזי ליישום טיפולית מוצלחת תרגום הקליניים של siRNAs היא מסירה יעילה. במיוחד, בהתחשב הבטיחות והיעילות של RNAi מבוסס הרפוי, רצוי מאוד לפתח משלוח ממוקד תאיים siRNA הגישה אוכלוסיות תאים או רקמות ספציפיות. HIV-1 gp120 חלבון, מעטפה גליקופרוטאין על פני השטח של HIV-1, ממלא תפקיד חשוב בכניסה ויראלי לתאי CD4. האינטראקציה של gp120 ו CD4 שמפעיל HIV-1 כניסה יוזם היתוך תא יאומת כאסטרטגיה אנטי ויראלית רלוונטיות קלינית לגילוי סמים. בזאת, אנחנו קודם כל לדון הבחירה וזיהוי של 2&#39;-F שונה אנטי HIV aptamers gp120-RNA. בשיטה הקונבנציונלית nitrocellulose לסנן Selex, aptamers חדש מספר עם זיקה nanomolar בודדו מתוך 50 מקרי NT-RNA הספרייה. על מנת להשיג בהצלחה המינים קשורים עם זיקה גבוהה יותר, חומרא הבחירה נשלטת בקפידה על ידי התאמת התנאים. Aptamers שנבחרו במיוחד יכולים להיקשר ולהיות הפנימו במהירות לתוך תאים המבטאים את חלבון ה-HIV-1 המעטפה. בנוסף, aptamers לבדו יכול לנטרל HIV-1 infectivity. בהתבסס על aptamer מיטב A-1, יש לנו גם ליצור רומן כפול פונקציה מעכבות אנטי gp120 aptamer-siRNA הכימרה שבו הן aptamer ואת מנות siRNA יש עוצמה אנטי HIV פעילויות. יתר על כן, אנו מנצלים את gp120 aptamer-siRNA מפלצות למסירה התא סוג מסוים של siRNA לתוך HIV-1 תאים נגועים. זה תפקיד כפול הכימרה מראה פוטנציאל רב לשילוב שונים סוכני חומצות גרעין טיפולית (aptamer ו siRNA) ב-HIV-1 דיכוי, מה שהופך את aptamer-siRNA מפלצות מועמדים אטרקטיביים טיפולית לחולים באי טיפול תרופתי פעיל מאוד (HAART).

מספר 2&#39;-Fluoro aptamers נגד HIV-RNA 1Ba-L gp120 עם זיקה nanomole מבודדים מספריית RNA על ידי<em&gt; במבחנה</em&gt; הליך Selex. חדש כפול פונקציה מעכבות אנטי gp120 aptamer-siRNA הכימרה נוצר מראה הבטחה רבה לטיפול אנטי HIV מערכתית.

פיתוח נייד מסוג ספציפי נגד HIV gp120 aptamers למסירה siRNA

המגפה העולמית של זיהום ב-HIV יצרה צורך דחוף במחלקות חדשות של סוכנים אנטי-רטרו-ויראליים. היכולת העוצמתית של RNA מפריע קטן (small interfering RNA)...

המטרה הכללית של הניסויים הבאים היא להפיק Aptima RNA in vitro עבור חלבון HIV-1 gp120 באמצעות ממבrane ניטרוסלולוז. דבר זה מושג על ידי PCR ותמלול T7 subsequent in vitro. כדי להכין את ה-DNA הראשוני ואת ספריית ה-RNA האקראית, כשלב שני, תערובת של חלבון המטרה וספריית ה-RNA נמרח על מסנן ניטרוסלולוז שהורטב מראש, המאפשר בידוד של מולקולות RNA קשורות ממיני RNA שאינם קשורים.לאחר 12 סבבי סלקציה, ספריית ה-RNA משתבטת ומורצפה על מנת לזהות את המועמדים הבודדים לאפטימרים של RNA מהספרייה. התוצאות שמתקבלות מזהות מספר אפטימרים חדשים בעלי זיקה נאנומולרית, בהסתמך על בדיקות gel shift ומיקרוסקופיה קונפוקלית. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות מדידה קיימות, כגון בידים (beads) או שיטות בידוד מבוססות עמודה, הוא הפשטות שלה והעובדה שהיא אינה דורשת טיפול מקדים של החלבון או הספריות, כגון קיבוע של החלבון על גבי הבידים. ספריית ה-RNA לבידוד של RNA Aptamers נגד HIV GP120 מוכנה מספריית DNA שסונתזה מסחרית ומכילה 50 נוקלאוטידים של רצפים אקראיים.רצף ספריית האוליגו של ה-DNA החד-גדילי הוא באורך 81 נוקלאוטידים. כפי שמוצג בתרשים זה, האזור האקראי מוקף באזורים קבועים, A 30 tumor בקצה חמש פריים, ו-16 MA בקצה שלוש פריים. האזורים הקבועים כוללים את מקדם ה-T seven עבור תמלול in vitro, ותג שלוש פריים עבור R-T-P-C-R.הגבירו את ספריית האוליגו-רנדום של ה-DNA בעל הגדיל الواحد באמצעות PCR; הגבילו את ה-PCR ל-10 מחזורים כדי לשמר את השפע של ספריית ה-DNA המקורית. לאחר תגובות ה-PCR, שחזרו את מאגר ה-DNA בעל הגדיל הכפול המוגבר באמצעות ערכה לטיהור ג'ל. לאחר מכן, המירו את ה-DNA בעל הגדיל הכפול לספריית RNA באמצעות ערכת ה-cript לפי הוראות היצרן; בתערובת תגובת השעתוק, החליפו את ה-CTP וה-UTP ב-two fluoro pyrimidine CTP וב-two fluoro pyrimidine UTP כדי להפיק RNA העמיד לריבונוקלאס.עם השלמת תגובות השעתוק, יש לעכל את התגובות באמצעות DS one להסרת ה-DNA התבנית ולטהר באמצעות ג'ל פוליאקרילאמיד 8% עם urea שבע מולארית. לבסוף, יש לכמת את ספריית ה-RNA המטוהרת באמצעות ספקטרופוטומטר UV. לפני בחירת ה-optimas, הכין את הבאפרים הדרושים ושמור אותם בטמפרטורות המתאימות.בפר באטמפר בטמפרטורת החדר ובבפרים לקיפול מחדש של RNA ולקישור RNA בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. לפני תחילת מחזור הבחירה הראשון, הכשיר את מאגר ה-RNA האקראי על מסנן ניטרוסלולוז שהורטב מראש בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, כדי למזער קישור לא ספציפי למסנן. לאחר 30 דקות, הסר את מסנן הניטרוסלולוז.שלבו את מאגר ה-RNA האקראי שעבר ניקוי מקדים ואת חלבון HIV one bowel GP one 20 בבאפר קישור RNA עם מלח בריכוז נמוך, והדגירו על פלטפורמה מסתובבת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, העבירו את התגובה דרך מסנן ניטרוסלולוז שהורטב מראש ושטפו עם 1 mL של באפר קישור RNA עם מלח בריכוז נמוך כדי להמיס את ה-RNA הקשור מהמסנן. הוציאו את ממברנת הניטרוסלולוז מתוכנית מחזיק המסנן.הוסיפו 200 µL של elu buffer לממברנה וחממו בטמפרטורה של 95 °C למשך חמש דקות. לאחר שה-RNA נשטף מהמסנן, סובבו את המבחנה קצרות (spin), העבירו את תמיססת ה-RNA למבחנה חדשה ובצעו מיצוי פנול-כלורופורם (phenol chloroform extraction) לנוזל השטוף. השתמשו בעמודת MicroCon YM 30 כדי לרכז את ה-RNA ושטפו את ה-RNA שהושג באמצעות 20 µL של RNAs free water.לאחר מכן, מאגר ה-RNA שהופק עובר תעתוק הפוך והגברה של 15 מחזורי PCR. לאחר טיהור המאגר הדו-גדילי שהוגבר, הוא מתעתק למאגר RNA חדש כפי שהודגם בעבר, לפני סבב הברירה הבא. יש לקפל מחדש את מאגר ה-RNA בבפר HBS בריכוז פי 1, לחמם ל-95 °C למשך שלוש דקות, ולאחר מכן להניח לקירור איטי ל-37 °C.המשיכו בדגירה בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 דקות. ספחו את ה-RNA המקופל מחדש, והעבירו למסנן ניטרוסלולוז למשך 30 דקות לפני הדגירה עם חלבון ה-HIV gp120 המטרה עבור סבב הברירה הבא. על מנת להשיג בהצלחה את ה-aptamers בעלי זיקה גבוהה יותר לקשירה, יש לשלוט בקפידה ברמת מחמירות הברירה על ידי התאמת תנאי הברירה.תנאי הברירה מוצגים בטבלה זו. עבור סבבי cellex ראשון עד רביעי, דגרו את מאגר ה-RNA שעבר ניקוי מקדים עם חלבון המטרה בבופר קישור ל-RNA בריכוז מלח נמוך למשך 30 דקות. לאחר הסבב הרביעי של cellex, השתמשו בבופר קישור ל-RNA בריכוז מלח גבוה ככל שה-cellex מתקדם.הפחית את כמות חלבון GP120 והעלה את כמות ה-tRNA של שמרים מתחרים כדי להגביר את רמת הסלקטיביות (stringency) של בחירת האפטמרים בכל מחזור. התקדמות בחירת האפטמרים ל-HIV-1 GP120 מנוטרת באמצעות בדיקת קישור למסנן (filter binding assay). בסרטון זה, תיבחן הדגימה של 12 מאגרי ה-RNA שנאספו לאחר כל מחזורי הבחירה.ראשית, הסירו את קבוצת ה-tri phosphate בקצה five prime על ידי טיפול של כל מאגר ה-RNA ב-calf intestinal phosphatase למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 °C. כדי להכין את ה-RNA שעובד ב-CIP לסימון באמצעות T four polynucleotide kinase ו-P 32 80 p, חממו ל-95 °C למשך חמש דקות, ולאחר מכן קררו על קרח. סימון ה-RNA מבוצע בחדר חם המיועד לניסויים הכוללים רדיואקטיביות, עם PNK buffer, T four Polynucleotide kinase, 1 µL של gamma P 32 A TP ומים עד לנפח של 20 µL. דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות.לאחר 30 דקות, הוסף 20 µL מים לכל תגובה וטהר באמצעות עמודת G 50. לבסוף, השג 40 µL של RNA מסומן בריכוז סופי של 250 nM refold, כאשר כל מאגר RNA מסומן נמצא בבופר HBS בריכוז פי 1, וחמם ל-95 °C למשך שלוש דקות. לאחר מכן, אפשר לדגימה להתקרר ל-37 °C, תהליך שייקח 30 עד 40 דקות.המשיכו את הדגירה בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 דקות. לאחר שה-RNA pool עבר קיפול מחדש, בצעו תגובת קישור של 100 µL. ערבבו את ה-RNA pool המסומן בקצה עם חלבון GP one 20 ועודף מולרי של פי עשרה של TRNA מתחרה שאינו ספציפי בבופר קישור RNA בריכוז מלח גבוה, והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.בסיום 30 הדקות, יש להפריד 50 µL מתגובת הקישור באמצעות מסנן ניטרוסלולוז שהורטב מראש. לאחר מכן, יש לשטוף את המסנן עם 2 mL של בופר קישור ולמדוד את הפעילות הרדיואקטיבית שנותרה על המסנן באמצעות מונה סינליציה רב-תכליתי כביקורת קלט. במקביל, עבור 50 µL הנותרים מתגובת הקישור, נותח מבחן הקישור של מאגר ה-RNA לאחר כל מחזור בחירה באמצעות מבחן קישור למסנן עם tRNA תחרותי, כדי לעקוב אחר ההתקדמות של HIV-1 gp120.פעילויות קישור הבחירה של Optima חושבו כאחוז ה-RNA שהוכנס שנשאר על המסנן כקומפלקס חלבון-RNA, כפי שמוצג כאן. מאגר ה-RNA ההתחלתי מראה רק 0.1% מה-RNA שהוכנס שנשאר על הממברנה. עם זאת, לאחר תשעה סבבי בחירה, לספריית ה-RNA התשעית יש 9.72% מה-RNA שהוכנס קשור.למרות שבוצעו סבבי בחירה נוספים, לא נצפתה העשרה נוספת, מה שמעיד על כך שהושגה קשירה מקסימלית של מאגר ה-RNA. פעילויות הקשירה של מאגרי ה-RNA אושרו בהמשך באמצעות בדיקות gel shift. תוצאות אלו מדגימות כי ליגנדים מסוימים בעלי ספציפיות קשירה גבוהה לחלבון המטרה הועשרו באופן עקבי במאגרי RNA אלו.בדוגמה זו, מאגר ה-RNA ה-12 הראה את פעילות הקישור הגבוהה ביותר מאחר שניתן להגיע לקישור מרבי של מאגר ה-RNA לאחר סבב הבחירה ה-12; מאגר RNA זה הועבר לתעתוק הפוך ל-CDNA, אשר הוגבר לאחר מכן באמצעות PCR. תוצר ה-PCR טוהה ואז שובט בתוך וקטור TA cloning, ורצפו לאחר יישור של 140 שבטים. שש קבוצות של anti GP one 20 optimas זוהו.בטבלה זו מצוינות רק הרצפים האקראיים של אזורי הליבה של ה-Aptima. כ-40% מהשבטים מכילים רצף שמור. רצף מייצג אחד מכל קבוצה נבחר לאפיון נוסף בשל שכיחותם היחסית בתוך קבוצתם באמצעות בדיקת הזזת ניידות בג'ל טבעי (native gel mobility shift assay), וחושב קבוע הדיסוציאציה KD של ה-abers המייצגים הללו, לדוגמה, A one.למיטב ה-abers יש ערך KD גלוי של 52 nanomolar. כפי שמוצג כאן. abers נבחרים אלו יכולים להיקשר באופן סלקטיבי עם יעד ה-HIV-1 gp120, אך לא עם חלבון ה-HIV-gp120 CM. תאי CHO G160 המבטאים באופן יציב את הגליקופרוטאין של מעטפת ה-HIV, gp160, שימשו לבדיקת קישור והפנמה של ה-anti GP120 optimas שנבחרו.תאים אלה אינם מעבדים GP one 60 ל-GP one 20 ו-G 41 מכיוון שחסרות להם הפרוטאזות המקודדות על ידי gag הדרושות לעיבוד המעטפת. ניתוח בציטומטריה של זרימה מעלה כי ה-abers המסומנים ב-S3 נקשרים באופן ספציפי לתאי CHO GP one 60, אך לא לתאי הבקרה cho EE, שאינם מבטאים GP one 60. יתרה מכך, מיקרוסקופיה קונפוקלית של תאים חיים בזמן אמת בציר Z מעידה כי לאחר שעתיים של אינקובציה, ה-aptima המסומן ב-SI three נבלע באופן סלקטיבי על ידי תאי CHO GP one 60, אך לא על ידי תאי הבקרה cho EE. כמו כן, נצפה כי ה-aptima הצטבר בתוך הציטופלזמה, מה שמרמז כי ה-GP one 20 aptima עשוי להיכנס לתאים באמצעות פגוציטוזה מתווכת רצפטורים.לבסוף, לאחר הצפייה בסרטון זה, תרכישו הבנה טובה באופן שבו ניתן להשתמש במדידות מבוססות שטח כדי לבודד RNA Abers.

development-cell-type-specific-anti-hiv-gp120-aptamers-for-sirna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

הבנת קונפורמציות של אנטיגנים על פני השטח של הנגיף נדרשת כדי להעריך את נטרול הנוגדנים ולהדריך את התכנון של אימונוגנים יעילים לחיסון. כאן אנו מתארים בדיקת ELISA מבוססת תאים המאפשרת לחקור את הזיהוי של HIV-1 Env טרימרי המתבטא על פני תאים שעברו טרנספטציה על ידי נוגדנים ספציפיים נגד Env.

הערכת קונפורמציה של HIV-1 trimeric מעטפת גליקופרוטאינים שימוש ELISA Assay מבוסס Cell

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצור וקטור הוכחה של עיקרון סוג אדנווירוס דו הערכי 5 (Ad5) Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6 על ידי ניצול אסטרטגית Antigen capsid על-ההתאגדות. וקטור זה הודגם להפגין כושר איכותי, היכולת להימלט סרה Ad5 חיובית במבחנה, וantigenicity כמו גם חיסונית לאנטיגנים המשולבים.

ניצול capsid על-התאגדות האסטרטגיה Antigen לפיתוח גישות Adenovirus סרוטיפ 5-וקטורי חיסון

מתוארות שיטות להערכת היעילות והרעילות של מולקולות RNA המכוונות לשלבים שלאחר האינטגרציה של מחזור השכפול של HIV-1. שיטות אלו שימושיות לסינון מולקולות חדשות ולאופטימיזציה של הפורמט של מולקולות קיימות.

הערכת היעילות והרעילות של RNAs מיקוד ייצור HIV-1 לשימוש ב ג&#39;ין או טיפול תרופתי

בגישה מודולרית הסינתזה של N- glycans עבור הקובץ המצורף הזכוכית מצופה אלומיניום אוקסיד שקופיות (שקופית ACG) וגם microarray glycan פותחה לשימוש פרופיל של HIV בהרחבה נטרול נוגדנים הוכח.

כימותרפיה-אנזימטי סינתזה של N- glycans עבור מערך פיתוח נוגדן HIV פרופיל

אנו מתארים וזמינותו מבוססת תא לדווח על HIV-1 היתוך באמצעות הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק לזיהוי על ידי מיקרוסקופ לזרום cytometry או קרינה פלואורסצנטית. זה יכול לשמש כדי לבדוק את מעכבי נגיפי כניסה (במיוחד בשלב fusion) במערכות זיהום תא ולתא.

Cre-עצלן תפוקה גבוהה מופעל ממברנה ויראלי Assay פיוז'ן לזהות מעכבי של היתוך ממברנה נגיפי HIV-1

שיטה מפורטת מסופקת כאן ומתארת את הטיהור, הקיפול והאפיון של חלקיקי חלבון בהרכבה עצמית (סאפאנס) לשימוש בפיתוח החיסונים.

ייצור של E. coli-הביע עצמית הרכבה חלקיקי חלבון עבור חיסונים הדורשים Trimeric אפירופה מצגת

חלבון הנוגדן הרקומביננטי המתבטא בתאי pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO ובנוגדנים חד-שבטיים המיוצרים בטכנולוגיית היברידימה מסורתית יכול לזהות ולהיקשר לחלבון אמינופפטידאז N (APN) חזירי.

ייצור נוגדנים חד-שבטיים המכוונים לאמינופפטידאז N באפיתל רירית המעי החזירי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי אפיטופים נטרול על חלקיקים דמויי וירוס אנטיגן מציגים (VLPs). אימונופרציפיטציה של נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV) נגזר VLPs מתבצע באמצעות נוגדנים חד שבטיים ספציפיים glycoproteins מעטפה בשילוב חלבון חרוזים מגנטיים מצומדים G. VLPs שנתפסו כפופים לאחר מכן SDS-PAGE וניתוח כתם מערבי באמצעות חלבון הליבה הנגיפי נוגדנים ספציפיים ל-Gag.

זיהוי אפיטופים רגישים לנטרול באנטיגנים המוצגים על חיסונים מבוססי חלקיקים דמויי וירוס (VLP) באמצעות בדיקת לכידה

דפוס הגליקוזילציה של הנוגדן קובע את ביצועיו הקליניים, ולכן נמשכים המאמצים התעשייתיים והאקדמיים לשלוט בגליקוזילציה. מאחר שקמפיינים טיפוסיים של גליקו-הנדסה הם עתירי זמן ועבודה, יצירת פרוטוקול מהיר לאפיון ההשפעה של גנים של גליקוסילציה באמצעות השתקה חולפת תתברר כיעילה.

גליקו-הנדסה מהירה של נוגדנים בתאי שחלת אוגר סיניים

אנו מספקים פרוטוקול שניתן ליישם באופן כללי על אפטמרים נבחרים הנקשרים לווירוסים זיהומיים בלבד ולא לווירוסים שהפכו ללא מדבקים בשיטת חיטוי או לכל וירוסים דומים אחרים. זה פותח את האפשרות לקבוע את מצב ההדבקה בבדיקות ניידות ומהירות.

בחירה חוץ גופית של Aptamers כדי להבדיל וירוסים זיהומיים ולא זיהומיים

למד לבחור aptamers RNA ספציפיים ל-HIV-1 gp120 באמצעות שיטת SELEX על מסנן ניטרוצלולוזה. השיטה מאפשרת בידוד רצפים בעלי אפיניות ננומולרית ופיתוח כימרות aptamer-siRNA לטיפול ממוקד ב-HIV.

פיתוח נייד מסוג ספציפי נגד HIV gp120 aptamers למסירה siRNA

גלה סרטונים נוספים