Name: פיתוח נייד מסוג ספציפי נגד HIV gp120 aptamers למסירה siRNA (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: למד לבחור aptamers RNA ספציפיים ל-HIV-1 gp120 באמצעות שיטת SELEX על מסנן ניטרוצלולוזה. השיטה מאפשרת בידוד רצפים בעלי אפיניות ננומולרית ופיתוח כימרות aptamer-siRNA לטיפול ממוקד ב-HIV.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים בריטה Hoehn, Guihua Sun, האריס Soifer וליסה שרר לדיונים מועילים. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות AI29329 ו HL07470 הוענק JJR ריאגנטים הבאים התקבלו באמצעות האיידס NIH מחקר מגיב תוכנית הפניה, אגף איידס, NIAID, NIH: CHO CHO-EE ו-gp160 תא קו; pNL4-3 לוק וקטור; HIV-1 באל gp120 מ DAIDS, NIAID.

<ol><li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment%3A+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249, 505-510 (1990).</li>
<li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346, 818-822 (1990).</li>
<li>Robertson, D. L., Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+in+vitro+of+an+RNA+enzyme+that+specifically+cleaves+single-stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Selection in vitro of an RNA enzyme that specifically cleaves single-stranded DNA.</a> Nature. 344, 467-468 (1990).</li>
<li>Fitzwater, T., Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SELEX+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">A SELEX primer.</a> Methods Enzymol. 267, 275-301 (1996).</li>
<li>Weiss, C. D., White, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+stable+Chinese+hamster+ovary+cells+expressing+wild-type%2C+secreted%2C+and+glycosylphosphatidylinositol-anchored+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of stable Chinese hamster ovary cells expressing wild-type, secreted, and glycosylphosphatidylinositol-anchored human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein.</a> J Virol. 67, 7060-706 (1993).</li>
<li>Vodicka, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indicator+cell+lines+for+detection+of+primary+strains+of+human+and+simian+immunodeficiency+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Indicator cell lines for detection of primary strains of human and simian immunodeficiency viruses.</a> Virology. 233, 193-198> (1997).</li>
<li>Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection%2C+characterization+and+application+of+new+RNA+HIV+gp+120+aptamers+for+facile+delivery+of+Dicer+substrate+siRNAs+into+HIV+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Selection, characterization and application of new RNA HIV gp 120 aptamers for facile delivery of Dicer substrate siRNAs into HIV infected cells.</a> Nucleic Acids Res. , (2009).</li>
<li>Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+biology+of+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">The chemical biology of aptamers.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 48, 2672-2689 (2009).</li>
<li>Famulok, M., Hartig, J. S., Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+aptamers+and+aptazymes+in+biotechnology%2C+diagnostics%2C+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional aptamers and aptazymes in biotechnology, diagnostics, and therapy.</a> Chem Rev. 107, 3715-3743 (2007).</li>
<li>Chu, T. C., Twu, K. Y., Ellington, A. D., Levy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer+mediated+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Aptamer mediated siRNA delivery.</a> Nucleic Acids Res. 34, e73-e73 (2006).</li>
<li>McNamara, J. O., 2nd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+delivery+of+siRNAs+with+aptamer-siRNA+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific delivery of siRNAs with aptamer-siRNA chimeras.</a> Nat Biotechnol. 24, 1005-1015 (2006).</li>
<li>Dassie, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+administration+of+optimized+aptamer-siRNA+chimeras+promotes+regression+of+PSMA-expressing+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systemic administration of optimized aptamer-siRNA chimeras promotes regression of PSMA-expressing tumors.</a> Nat Biotechnol. 27, 839-849 (2009).</li>
<li>Zhou, J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+potential+of+cell-internalizing+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The therapeutic potential of cell-internalizing aptamers.</a> Curr Top Med Chem. 9, 1144-1157 (2009).</li>
<li>Zhou, J., Li, H., Li, S., Zaia, J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+dual+inhibitory+function+aptamer-siRNA+delivery+system+for+HIV-1+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Novel dual inhibitory function aptamer-siRNA delivery system for HIV-1 therapy.</a> Mol Ther. 16, 1481-1489 (2008).</li>
</ol>

י R ו JZ יש פטנט על &quot;מערכת מסוג Cell aptamer-siRNA ספציפיים מסירה לטיפול ב-HIV-1&quot;. USPTO, מס<strong&gt; 12/328994</strong&gt;, תאריך פרסום: 11 ביוני, 2009.

Aptamers הן במבחנה התפתח חומצות גרעין להניח כי ספציפיים יציב צורות תלת ממדיות, ובכך לספק מאוד ספציפיות, וכפותים מולקולות ממוקדות 8. הזיקה נמוך מחייב nanomolar וספציפיות מעודן של aptamers אל המטרות שלהם להפוך אותם כלים תכליתי עבור אבחון, in vivo הדמיה ותרופות 9. עם כניסתו של הטכנולוגיה aptamer למסירה siRNA ממוקד עכשיו זה אפשרי להשתמש בפונקציה מחייב aptamer עבור אנדוציטוזה קולטן בתיווך של siRNAs 10-12. Aptamers שהועלו כנגד קולטני קר...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> MF-Millipore קרום מסנן </td><td> Millipore </td><td> HAWP01300 </td><td> גודל הנקבוביות 0.45 מיקרומטר </td></tr><tr><td> Swinnex בעל מסנן </td><td> Millipore </td><td> SX0001300 </td><td> קוטר 13 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> QIAquick ג&#39;ל הפקת Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 28706 </td><td> דנ&quot;א לטיהור </td></tr><tr><td> Microcon YM-30 טור </td><td> Millipore </td><td> 42410 </td><td> RNA ריכוז </td></tr><tr><td> ביו ספין 30 טור </td><td> Bio-Rad </td><td> 732-6250 </td><td> RNA טיהור </td></tr><tr><td> תקי PCR DNA פולימראז </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> D1806 </td><td></td></tr><tr><td> ThermoScript RT-PCR מערכת </td><td> Invitrogen </td><td> 11146-024 </td><td></td></tr><tr><td> DuraScribe T7 ערכת שעתוק </td><td> EpiCentre </td><td> DS010925 </td><td></td></tr><tr><td> dNTP עבור ה-PCR </td><td> רוש </td><td> 1 581 295 </td><td></td></tr><tr><td> חומצה ריבונוקלאית, העברת E.coli </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> R1753 </td><td> tRNA מתחרה </td></tr><tr><td> HIV-1 Ba-L gp120 חלבון </td><td> המחקר איידס מגיב תוכנית הפניה </td><td> 4961 </td><td> יעד חלבון </td></tr><tr><td> SiRNA משתיק ערכת תיוג - Cy3 </td><td> Ambion </td><td> 1632 </td><td></td></tr><tr><td> חומצה פנול / כלורופורם 01/05 פתרון (pH 4.5) </td><td> Ambion </td><td> AM9720 </td><td></td></tr><tr><td> כלורופורם / Isopropanol 24 / 1 פתרון </td><td> סיגמא </td><td> C0549 </td><td></td></tr><tr><td> עגל phosphatase מעיים (CIP) </td><td> ניו אינגלנד BioLab </td><td> M0290L </td><td></td></tr><tr><td> קינאז polynucleotide T4 </td><td> ניו אינגלנד BioLab </td><td> M0201L </td><td></td></tr><tr><td> גליקוגן </td><td> רוש </td><td> 10 901 393 001 </td><td> RNA משקעים </td></tr><tr><td> Gamma-32-P-ATP </td><td> MP ביו </td><td> 013502002 </td><td> Radiactivity </td></tr><tr><td> 40% AccuGel 19:01 </td><td> אבחון הלאומי </td><td> EC-850 </td><td></td></tr><tr><td> 10xTBE </td><td> אבחון הלאומי </td><td> EC-860 </td><td></td></tr><tr><td> N, N, N, N&#39;-Tetramethylethylenediamine (TMEMD) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> T9281 </td><td></td></tr><tr><td> חנקתי persulfate (APS) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> A3678 </td><td></td></tr><tr><td> L-methioine sulfoximine </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> M5379-250 מ&quot;ג </td><td></td></tr><tr><td> RPMI מדיה 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11835-030 </td><td></td></tr><tr><td> פתרון נתרן ביקרבונט, 7.5% w / v </td><td> Invitrogen </td><td> 25080-094 </td><td></td></tr><tr><td> בינוני Essential Minimum (ממ) (10 ) </td><td> Invitrogen </td><td> 11430-030 </td><td></td></tr><tr><td> ממ שאינם חיוניים חומצת אמינו (100 ) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> ת&quot;א ערכה עם שיבוט PCR 2.1 </td><td> Invitrogen </td><td> K2040-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

פיתוח נייד מסוג ספציפי נגד hiv gp120 aptamers למסירה sirna

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

מגפה עולמית של זיהום על ידי HIV יצרה צורך דחוף כיתות חדשות של סוכנים תרופתי. היכולת חזק של קטן (SI) RNAs התערבות כדי לבלום את הביטוי של תעתיקי רנ&quot;א משלימים המנוצלת כמו סוג חדש של הרפוי עבור מגוון רחב של מחלות כולל איידס. דיווחים קודמים רבים הראו כי הרומן RNAi מבוסס anti-HIV/AIDS אסטרטגיות טיפוליות יש הבטחה רבה, עם זאת, מכשול מרכזי ליישום טיפולית מוצלחת תרגום הקליניים של siRNAs היא מסירה יעילה. במיוחד, בהתחשב הבטיחות והיעילות של RNAi מבוסס הרפוי, רצוי מאוד לפתח משלוח ממוקד תאיים siRNA הגישה אוכלוסיות תאים או רקמות ספציפיות. HIV-1 gp120 חלבון, מעטפה גליקופרוטאין על פני השטח של HIV-1, ממלא תפקיד חשוב בכניסה ויראלי לתאי CD4. האינטראקציה של gp120 ו CD4 שמפעיל HIV-1 כניסה יוזם היתוך תא יאומת כאסטרטגיה אנטי ויראלית רלוונטיות קלינית לגילוי סמים. בזאת, אנחנו קודם כל לדון הבחירה וזיהוי של 2&#39;-F שונה אנטי HIV aptamers gp120-RNA. בשיטה הקונבנציונלית nitrocellulose לסנן Selex, aptamers חדש מספר עם זיקה nanomolar בודדו מתוך 50 מקרי NT-RNA הספרייה. על מנת להשיג בהצלחה המינים קשורים עם זיקה גבוהה יותר, חומרא הבחירה נשלטת בקפידה על ידי התאמת התנאים. Aptamers שנבחרו במיוחד יכולים להיקשר ולהיות הפנימו במהירות לתוך תאים המבטאים את חלבון ה-HIV-1 המעטפה. בנוסף, aptamers לבדו יכול לנטרל HIV-1 infectivity. בהתבסס על aptamer מיטב A-1, יש לנו גם ליצור רומן כפול פונקציה מעכבות אנטי gp120 aptamer-siRNA הכימרה שבו הן aptamer ואת מנות siRNA יש עוצמה אנטי HIV פעילויות. יתר על כן, אנו מנצלים את gp120 aptamer-siRNA מפלצות למסירה התא סוג מסוים של siRNA לתוך HIV-1 תאים נגועים. זה תפקיד כפול הכימרה מראה פוטנציאל רב לשילוב שונים סוכני חומצות גרעין טיפולית (aptamer ו siRNA) ב-HIV-1 דיכוי, מה שהופך את aptamer-siRNA מפלצות מועמדים אטרקטיביים טיפולית לחולים באי טיפול תרופתי פעיל מאוד (HAART).

מספר 2&#39;-Fluoro aptamers נגד HIV-RNA 1Ba-L gp120 עם זיקה nanomole מבודדים מספריית RNA על ידי<em&gt; במבחנה</em&gt; הליך Selex. חדש כפול פונקציה מעכבות אנטי gp120 aptamer-siRNA הכימרה נוצר מראה הבטחה רבה לטיפול אנטי HIV מערכתית.

פיתוח נייד מסוג ספציפי נגד HIV gp120 aptamers למסירה siRNA

המגפה העולמית של זיהום ב-HIV יצרה צורך דחוף במחלקות חדשות של סוכנים אנטי-רטרו-ויראליים. היכולת העוצמתית של RNA מפריע קטן (small interfering RNA)...

המטרה הכללית של הניסויים הבאים היא להפיק Aptima RNA in vitro עבור חלבון HIV-1 gp120 באמצעות ממבrane ניטרוסלולוז. דבר זה מושג על ידי PCR ותמלול T7 subsequent in vitro. כדי להכין את ה-DNA הראשוני ואת ספריית ה-RNA האקראית, כשלב שני, תערובת של חלבון המטרה וספריית ה-RNA נמרח על מסנן ניטרוסלולוז שהורטב מראש, המאפשר בידוד של מולקולות RNA קשורות ממיני RNA שאינם קשורים.לאחר 12 סבבי סלקציה, ספריית ה-RNA משתבטת ומורצפה על מנת לזהות את המועמדים הבודדים לאפטימרים של RNA מהספרייה. התוצאות שמתקבלות מזהות מספר אפטימרים חדשים בעלי זיקה נאנומולרית, בהסתמך על בדיקות gel shift ומיקרוסקופיה קונפוקלית. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות מדידה קיימות, כגון בידים (beads) או שיטות בידוד מבוססות עמודה, הוא הפשטות שלה והעובדה שהיא אינה דורשת טיפול מקדים של החלבון או הספריות, כגון קיבוע של החלבון על גבי הבידים. ספריית ה-RNA לבידוד של RNA Aptamers נגד HIV GP120 מוכנה מספריית DNA שסונתזה מסחרית ומכילה 50 נוקלאוטידים של רצפים אקראיים.רצף ספריית האוליגו של ה-DNA החד-גדילי הוא באורך 81 נוקלאוטידים. כפי שמוצג בתרשים זה, האזור האקראי מוקף באזורים קבועים, A 30 tumor בקצה חמש פריים, ו-16 MA בקצה שלוש פריים. האזורים הקבועים כוללים את מקדם ה-T seven עבור תמלול in vitro, ותג שלוש פריים עבור R-T-P-C-R.הגבירו את ספריי

development-cell-type-specific-anti-hiv-gp120-aptamers-for-sirna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

הבנת קונפורמציות של אנטיגנים על פני השטח של הנגיף נדרשת כדי להעריך את נטרול הנוגדנים ולהדריך את התכנון של אימונוגנים יעילים לחיסון. כאן אנו מתארים בדיקת ELISA מבוססת תאים המאפשרת לחקור את הזיהוי של HIV-1 Env טרימרי המתבטא על פני תאים שעברו טרנספטציה על ידי נוגדנים ספציפיים נגד Env.

הערכת קונפורמציה של HIV-1 trimeric מעטפת גליקופרוטאינים שימוש ELISA Assay מבוסס Cell

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצור וקטור הוכחה של עיקרון סוג אדנווירוס דו הערכי 5 (Ad5) Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6 על ידי ניצול אסטרטגית Antigen capsid על-ההתאגדות. וקטור זה הודגם להפגין כושר איכותי, היכולת להימלט סרה Ad5 חיובית במבחנה, וantigenicity כמו גם חיסונית לאנטיגנים המשולבים.

ניצול capsid על-התאגדות האסטרטגיה Antigen לפיתוח גישות Adenovirus סרוטיפ 5-וקטורי חיסון

פרוטוקול זה מתאר את השיטות לבניית מודל עכבר מח עצם/כבד/תימוס אנושי עם חסינות מהונדסת מבוססת תאי גזע נגד זיהום HIV.

תאי גזע מהונדסים חסינות בהתבסס נגד HIV זיהום במודל העכבר האנושי

מתוארות שיטות להערכת היעילות והרעילות של מולקולות RNA המכוונות לשלבים שלאחר האינטגרציה של מחזור השכפול של HIV-1. שיטות אלו שימושיות לסינון מולקולות חדשות ולאופטימיזציה של הפורמט של מולקולות קיימות.

הערכת היעילות והרעילות של RNAs מיקוד ייצור HIV-1 לשימוש ב ג&#39;ין או טיפול תרופתי

בגישה מודולרית הסינתזה של N- glycans עבור הקובץ המצורף הזכוכית מצופה אלומיניום אוקסיד שקופיות (שקופית ACG) וגם microarray glycan פותחה לשימוש פרופיל של HIV בהרחבה נטרול נוגדנים הוכח.

כימותרפיה-אנזימטי סינתזה של N- glycans עבור מערך פיתוח נוגדן HIV פרופיל

אנו מתארים וזמינותו מבוססת תא לדווח על HIV-1 היתוך באמצעות הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק לזיהוי על ידי מיקרוסקופ לזרום cytometry או קרינה פלואורסצנטית. זה יכול לשמש כדי לבדוק את מעכבי נגיפי כניסה (במיוחד בשלב fusion) במערכות זיהום תא ולתא.

Cre-עצלן תפוקה גבוהה מופעל ממברנה ויראלי Assay פיוז'ן לזהות מעכבי של היתוך ממברנה נגיפי HIV-1

שיטת BSelex כדי לזהות ולשחזר נוגדנים ספציפיים אנטיגן ספציפי של הדם היקפיים היקפי תאים מונמונומנט משלבת הזרימה cy, לנסות עם תא בודד PCR ו שיבוט.

שיטת הקרנה של תא בודד לבחירת ושחזור של נוגדנים עם הצורך הרצוי מתוך זיכרון אנושי מועשר B אוכלוסיות תאים

שיטה מפורטת מסופקת כאן ומתארת את הטיהור, הקיפול והאפיון של חלקיקי חלבון בהרכבה עצמית (סאפאנס) לשימוש בפיתוח החיסונים.

ייצור של E. coli-הביע עצמית הרכבה חלקיקי חלבון עבור חיסונים הדורשים Trimeric אפירופה מצגת

דפוס הגליקוזילציה של הנוגדן קובע את ביצועיו הקליניים, ולכן נמשכים המאמצים התעשייתיים והאקדמיים לשלוט בגליקוזילציה. מאחר שקמפיינים טיפוסיים של גליקו-הנדסה הם עתירי זמן ועבודה, יצירת פרוטוקול מהיר לאפיון ההשפעה של גנים של גליקוסילציה באמצעות השתקה חולפת תתברר כיעילה.

גליקו-הנדסה מהירה של נוגדנים בתאי שחלת אוגר סיניים

אנו מספקים פרוטוקול שניתן ליישם באופן כללי על אפטמרים נבחרים הנקשרים לווירוסים זיהומיים בלבד ולא לווירוסים שהפכו ללא מדבקים בשיטת חיטוי או לכל וירוסים דומים אחרים. זה פותח את האפשרות לקבוע את מצב ההדבקה בבדיקות ניידות ומהירות.

בחירה חוץ גופית של Aptamers כדי להבדיל וירוסים זיהומיים ולא זיהומיים

למד לבחור aptamers RNA ספציפיים ל-HIV-1 gp120 באמצעות שיטת SELEX על מסנן ניטרוצלולוזה. השיטה מאפשרת בידוד רצפים בעלי אפיניות ננומולרית ופיתוח כימרות aptamer-siRNA לטיפול ממוקד ב-HIV.

פיתוח נייד מסוג ספציפי נגד HIV gp120 aptamers למסירה siRNA

גלה סרטונים נוספים