ג'ין אספקה ​​יעילה לתוך השטחים CNS מרובים באמצעות בתוך הרחם Electroporation

המטרה הכוללת של הליך זה היא לשנות את ביטוי הגנים במערכת העצבים המרכזית העוברית. זה מושג על ידי השגת נקבות הרות מתוזמנות והכנתן לניתוח. לאחר מכן קרני הרחם נחשפות על ידי יצירת חתך בבטן.

לאחר חשיפת העוברים, מוזרק DNA לחדר הצדדי, לחדר השלישי או לחלל התת-רשתית. השלב האחרון של ההליך הוא הפעלת זרם חשמלי על העובר דרך דופן הרחם, כיוון אלקטרודות ההנעה כך שהקוטב החיובי ממוקם מעל אתר הטרנספקציה המועדף. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות את ההתפשטות, הנדידה וההתמיינות של אבות עצביים בקלון הקלון המת קלון והרשתית באמצעות מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית.

היתרון העיקרי של טכניקה זו או שיטות קיימות, כמו ניוון של עכברים טרנסגניים, הוא שהיא מהירה, מאפשרת מחקרי תפוקה גבוהים יותר ובעלת עלות נמוכה יותר. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ההתפתחות העצבית, כגון אילו גנים מווסתים אב עצבי, התפשטות תאים, אפיון גורל התא, התמיינות עצבית ונדידת תאים. ההשלכות של טכניקה זו עשויות להתרחב להבנה טובה יותר של המסלולים הגנטיים שהדגישו פגמים בהתפתחות מערכת העצבים המרכזית, שרבים מהם גורמים לפגיעה קוגניטיבית והפרעות התנהגותיות בבני אדם מעבר לתועלתה בהבנת התפתחות מערכת העצבים המרכזית.

ניתן ליישם טכניקה זו גם על מערכות איברים אחרות כגון מערכת העצבים ההיקפית המתפתחת, הלב והשליה. ניתן ליישם אותו גם לחקר מודלים של מחלות בעכברים כמו גם אורגניזמים מודלים אחרים כגון אפרוח וקסיפ. בדרך כלל, המכשול העיקרי להצלחה עבור אנשים חדשים בטכניקה זו הוא טיפול בהישרדות העוברים תוך כדי מניפולציה, הזרקה ונקבוביות של העוברים.

הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר נזקקנו לאמצעי מהיר למניפולציה של ביטוי גנים בעובר, בטלנצפלון וברשתית. פיתחנו את הטכניקה הזו במעבדה שלנו על ידי שינוי הטכניקה שתוארה לראשונה על ידי סאל, שפורסמה בכתב העת Developmental Biology בשנת 2001. עבדנו גם עם מעבדת התרסקות כדי לבסס את הפרוטוקול הזה גם בדילון המתפתח.

ההדגמה החזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את שלבי ההזרקה והאלקטרופורציה מכיוון שהם דורשים מניפולציה זהירה מאוד של העוברים ואתרי ההזרקה לפעמים יכולים להיות קטנים מאוד. דוגמה, החלל התת-רשתית המדגים את ההליך היום יהיה רג'יב, פוסט-דוקטורנט ממעבדת שרמן להתחיל לנקות ולעקר את כל הכלים הכירורגיים. לאחר מכן, מלאו מזרקים בתמיסת מלח ותמיסת רינגר חלב והניחו אותם על כרית חימום לחימום באזור הניתוח.

עקרו כרית חימום עם 70% אתנול, ולאחר מכן כסו אותה בכרית מעוקרת פחות גזה. הגדר את כרית החימום ל-37 מעלות צלזיוס. הכניסו את החיה לתא הרדמה קטן והורדמו על ידי אספקת 5% פלואור עם חמצן בליטר אחד לדקה דרך וופורייזר.

הקפד לאסוף את פליטת הפלואור באמצעות מערכת נבלות. ברגע שהנשימה של החיה עמוקה וסדירה, הוציאו אותה מהחדר. השתמש בצביטה בבהונות וברפלקסים של מצמוץ עיניים.

להבטחת הרדמה מלאה. הנח את החיה המורדמת על בטנה והשתמש בצינור הנשמה כדי לספק 2.25% קרח פלואור במהלך הניתוח. יש להזריק בופרנורפין בריכוז של 0.1 מיליגרם לק"ג משקל גוף תת עורי בעורף.

המשך לעקוב אחר נשימת החיה ולהתאים את זרימת האיזוף פלואור במידת הצורך. לאחר מכן הדביקו על החזה של החיה המורדמת ובדקו שוב אם יש תגובת נסיגה על ידי צביטה של כף הרגל האחורית במלקחיים קהים. בעזרת ספוגית קצה כותנה סטרילית, מורחים שכבה עבה של קרם דה על הבטן ומוודאים שהפרווה התחתונה מצופה לחלוטין.

השאירו את הקרם למשך כשלוש דקות ובדקו לסירוגין אם יש הסרת שיער. בעזרת ספוגית סטרילית יש להרטיב כרית גזה סטרילית במים סטריליים ולנגב את השיער מהבטן. לאחר מכן, יש לעקר את מקום החתך עם כלורהקסידין ועוד מים.

יבש את הבטן עם גזה סטרילית נקייה. חזור על שלב זה עם 70% אתנול באמצעות גזה כותנה מעוקרת טרייה. התכוננו לניתוח על ידי לבישת לבוש כירורגי כדי לחשוף את קרני הרחם.

ראשית, אתר את האלבה הליניארית כקו הקלוש מתחת לעור בקו האמצע בעזרת מלקחיים, משוך את העור הרחק מדופן הבטן וחתוך חתך ישר קטן מאמצע הבטן כלפי מטה בעזרת מספריים לעור בעזרת מלקחיים ומספריים מעוקלים. חזור על התהליך עם הצפק. אחוז בצפק בעזרת המלקחיים.

משוך משם ואז חתך חתך גדול מספיק כדי למשוך את הרחם דרכו. מניחים גזה סטרילית עם חריץ אנכי קטן מעל החתך ומרטיבים אותה במי מלח סטריליים חמים. לאחר מכן, החלק את המלקחיים לתוך החתך ואתר את הרחם המחזיק את החתך פתוח בעזרת המלקחיים.

אחוז ברחם בין העובר הראשון והשני הנראה לעין ומשוך את שני צידי קרני הרחם אל הגזה. ספרו את מספר העוברים תוך ציון ספיגה או עוברים בגודל גוף קטן. על מנת להכין את המספר הנכון של זריקות DNA, הרטיבו את קרני הרחם במי מלח והחזירו בזהירות קרן רחם אחת לבטן.

כדי לתעב את המחטים הכירורגיות, השתמש בפיפט משוך כלפי מעלה עם פיה מחוברת כדי לשאוב 10 מיקרוליטר של שלושה מיליגרם למיליליטר. תמיסת DNA נטולת אנדוטוקסין המכילה צבע מתיל ירוק ומוציאה את ה-DNA למחט כירורגית. התקן את המחט המלאה הראשונה על המניפולטור המיקרו

עמדו מחוברים למזרק החל מהעובר הקרוב ביותר לשחלה. השתמש במלקחיים עגולים כדי לסובב בעדינות את העובר בתוך הדצידואה כך שהוא ממוקם עם הפנים קדימה, מה שמאפשר להזריק להתרחש בגליל ROS לכיוון הקורטי. שימוש במקור אור סיבים אופטיים לזיהוי קו האמצע של המוח העוברי.

שימו לב לחדרים הצדדיים הגדולים המוקפים באזורי הרוסטרל. החזיקו את העובר במקומו באמצעות מלקחיים מעוקלים ומקמו את המחט הניתוחית המלאה מעל הרחם כך שזווית הכניסה למוח תהיה כ-45 מעלות. בתנועה מהירה ויציבה, סובב את החוגה במניפולטור המיקרו כדי להכניס את קצה המחט דרך דופן הרחם לתוך החדר הצדדי של המוח העוברי.

לאחר מכן, לחץ על כרית הרגל של מזרק המיקרו. כדי להזריק את תמיסת ה-DNA, ניתן לדמיין בקלות הזרקה מוצלחת על ידי פיזור צבע המתיל הירוק בכל חדרי המוח העובריים. כעת, לאחר שה-DNA הוזרק, משוך לאט את המחט בחזרה כדי להסיר אותה מבלי לגרום לשבירה.

מניחים את העובר המוזרק על הגזה הסטרילית ומרטיבים היטב במי מלח חמים. אחזו ברחם עם הקוטב החיובי של אלקטרודת ההנעה המונחת מעל אתר הטרנספקציה הרצוי. לאחר מכן ספק חמישה פולסים חשמליים מרובעים של 40 עד 50 וולט ו-50 אלפיות השנייה בקצב של פעימה אחת לשנייה.

כסו את העובר המוזרק והמדורג אלקטרו בגזה רטובה מגן, ולאחר מכן המשיכו להזריק את העובר הבא. עם השלמת ההזרקה והאלקטרו פרינג של כל העוברים הרצויים בקרן הרחם, דחפו אותו בזהירות בחזרה לחלל הגוף. הסר את קרן הרחם השנייה כדי להתחיל בהזרקה ואלקטרופורציה של העוברים הנותרים.

לאחר שכל העוברים חוזרים לרחם, הוסף שניים עד שלושה מיליליטר של מי מלח חמים לחלל הבטן, ולאחר מכן הסר את הגזה מהבטן כדי לחשוף את דפנות הצפק. השתמש בקו משי קלוע שחור כדי לתפור את הצפק על ידי עיגון הקו על הצפק הקרוב ביותר לעצם החזה והמשך התפור הרחק מהעוגן. ודא שכל התפרים הדוקים ושלא נתפרים איברים או עור בסיסיים לתוך הצפק.

גזור את קו התפר הנותר והשליך. משוך את העור סגור מעל קו התפרים בעזרת מלקחיים באמצעות סיכות לסגירת העור. יש להצמיד את העור תוך הקפדה לא להדק את קו התפר שמתחתיו או למשוך את העור חזק מדי.

לאחר סיום, ודא שהסיכות הדוקות על ידי לחיצה עדינה יחד עם כלי התפר כאן, A-P-C-I-G שני וקטורי ביטוי המניעים את הביטוי של GFP עבר אלקטרופוציה לתוך הניאו-קורטקס המתפתח ב-E 12. ככל שההתפתחות הניאו-קורטיקלית מתקדמת, האבות האפיקליים מתמיינים לאבות בסיסיים משניים או לנוירונים פוסט-מיטוטיים וממשיכים לבטא GFP. לאחר מכן ניתן לנתח תאים עצביים אלה לביטוי של סמנים אופייניים של תת-הסוג העצבי המוצג באדום.

במבט מושחת זה של מוח קדמי של עובר שאושר ב-E 12 ונותח ב-E 14, האתר החשמלי מסומן על ידי הקרינה הירוקה של האפי על ידי E 14. ביטוי GFP נראה בתלמוס, קדם תלמוס והיפותלמוס מה שמצביע על כך שטריטוריות LIC גוססות עברו בהצלחה. תיבת המקף מסמנת את מיקום החתך באזור חדר אחד.

מבט מקרוב על אזור החדר מראה את הנדידה של תאי GFP מחוץ לאזור החדר לאזור המעטפת. היכן שייווצרו גרעיני היפותלמוס, הרשתית העוברית גם היא אלקטרופוטית בקלות, כפי שמוצג בקטע עטרה זה באמצעות E 16.5 I אלקטרופוט עם PCIC ב-E 15.5. כאן, הצטברות של תאים חיוביים לדובדבן m היא ספציפית לשכבת הנוירובלסטים החיצונית ואינה נראית בשלושה תאי גנגליון רשתית חיוביים B בשכבת תאי הגנגליון לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 30 דקות אם לא מתעוררים סיבוכים בלתי צפויים.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב להשתמש בטכניקות סטריליות מתאימות, יד יציבה בעת מניפולציה של העוברים, ולהכין את כל החומרים הדרושים לפני הכנסת האישה ההרה להרדמה. בעקבות הליך זה, ניתן לאפשר לעוברים קלועים אלקטרו לחיות עד לבגרות, ואז ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מבחנים התנהגותיים ותפקודיים כדי לענות על שאלות נוספות הנוגעות לאופן שבו מניפולציה של גנים מסוימים בעובר משפיעה על תפקוד עצבי אצל הבוגר. מאז פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום התפתחות מערכת העצבים המרכזית לחקור את תפקוד הגנים in vivo in mouse.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכניס DNA זר לצינור העצבי העוברי. באופן ספציפי, אנו מראים לך כיצד להכין אישה בהריון לניתוח. חשפו את הרחם, הזריקו DNA ואלקטרוליט את העובר.

אל תשכח שעבודה עם איזוף פלואור עלולה להיות מסוכנת, ויש לנקוט באמצעי זהירות כגון מערכת נבלות בעת ביצוע הליך זה.