Name: Biofilm ניתוח שבעל פה של Palatal expanders על ידי הכלאה ב-situ פלואורסצנטי מיקרוסקופיה Confocal סריקת לייזר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: למדו לנתח ביופילם פה טבעי ממכשירי הרחבה פלטינליים באמצעות FISH ומיקרוסקופיית לייזר סריקה קונפוקלית. שיטה זו מאפשרת חקר הרכב ומבנה קהילות חיידקיות בפה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי Fonds היגיינה של הרפואי של אוניברסיטת גראץ. כל הנבדקים נתנו את הסכמתם המיודעת. לאישור מוסדי של פרוטוקול המחקר שהתקבלו לרפואה של אוניברסיטת גראץ.

1. הדגימה אוסף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר קבוע palatal expanders לאחר 4 חודשי עבודות שירות intraoral. השתמש המערכת נולה שדה יבש לבודד את המכשירים לפני הסרתם (איורים 1 ו -2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש צבת מעוקרים, כפפות מגשי להסיר expanders מבלי להוסיף זיהום (איורים 3 ו -4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות חפצים Sarstedt 120 מ"ל בקבוקונים ב -20 ° C. קח למעבדה על הקרח תהליך בתוך 24 שעות. </li></ol> 2. Biofilm קיבעון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרד biofilm פתיתים עם אזמל סטרילי, או לאסוף חתיכות עם מלקחיים סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף קר כקרח 4% פתרון PFA עד המדגם הוא מכוסה היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את התערובת על 4 ° C (לא להקפיא) למשך 3 עד 12 שעות. פעמים קיבעון ארוכים או קיבעון בטמפרטורות גבוהות עלול להפוך את מעטפות תא של גרם שליליים תאים חדירים פחות בדיקות oligonucleotide. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון PFA ולשטוף עם קרים כקרח 1X PBS. חזור על פעולה זו 2-3 פעמים rסר PFA שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend המדגם כרך 1. קר כקרח 1X PBS ולהוסיף 1 כרך. קר כקרח 96% (v / v) אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את המדגם ב -20 ° C. דוגמאות קבוע על פי פרוטוקול זה יכול להיות מאוחסן במשך מספר חודשים עד שנים. </li></ol> 3. התייבשות של דוגמאות קבוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל μl 5-30 של החומר-PFA קבוע מדגם המיקרוסקופ שקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש ב 46 מעלות צלזיוס כ 15 דקות או בטמפרטורת החדר למשך זמן ארוך יותר. ההפשרה ליזוזים ואת לפוראמיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μl של ליזוזים (1mg/ml) בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, ובכך להקל על חדירה של בדיקות לתוך התאים על ידי נטרולם של קירות התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים להחליק לתוך 50%, 80% ו 96% (v / v) אתנול עבור 3 דקות כל אחד. ההשפעה dehydrating של הסדרה ריכוז האתנול יהיה לפורר את קרום התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש את השקופיות על 46 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li></ol> 4. In-situ הכלאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 מ"ל שלהכלאה חיץ טרי (ראה לוח 1 עבור ריכוזים). ריכוזים לפוראמיד השתמשו במחקר זה: 10% (EUBmix), 20% (Bac303, POGI, MUT590) או 45% (LGCmix). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההפשרה פתרונות בדיקה oligonucleotide. בדיקות מופשר יש לשמור על הקרח ומוגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μl של בדיקה לכל 200 μl של חיץ הכלאה, ומערבבים היטב וליישם את התערובת המדגם מיובש על שקופיות מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים פיסת נייר לתוך צלחת פטרי רבוע ויוצקים את החיץ הכלאה שנותרו על הנייר את הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד למקום את השקופית אופקית לתוך התבשיל ולסגור את המנה. דגירה בתנור על 46 מעלות צלזיוס במשך 1-5 שעות (90 דקות יספיקו ברוב המקרים). הפונקציות צלחת כמו חדר לחות ומניעת אידוי של פתרון הכלאה של השקופית. בפרט, אידוי לפוראמיד יכול לגרום הלא ספציפית מחייב בדיקה ליעד הלא תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50 מ"ל של חיץ כביסה (ראו טבלה 2 עבור concentrations). הכן את החיץ כביסה בתוך שפופרת 50 מ"ל ו - מחממים עד 48 מעלות צלזיוס באמבט מים. צעד כביסה מבוצעת 48 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת עם שקופית מהתנור הכלאה. מיד לשטוף את המאגר הכלאה עם נפח קטן של חיץ מראש חימם כביסה, ולהעביר את השקופית לתוך המאגר כביסה הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור המכיל את מאגר כביסה השקופית בחזרה לאמבטיה מים לדגור על 48 מעלות צלזיוס במשך 10-15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר שקופיות הצינור לטבול לתוך קר כקרח DDH 2 O ל 2-3 שניות כדי לחסל חיץ כביסה שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוויר יבש השקופיות מהר ככל האפשר (את השימוש של אוויר דחוס מומלץ). ייבוש מהיר תפחית בדיקה דיסוציאציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלשות יבשים ניתן לאחסן בחושך ב -20 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות ללא איבוד משמעותי של אות בדיקה שמעניקה פלואורסצנטי. </li></ol> 5. מיקרוסקופיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי הדגים כביסה, Apply שתי טיפות antifadent לסגור את הקצוות השמאליים והימניים של שקופית (פרוסות קפוא יש לחמם לטמפרטורת החדר לפני שלב זה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום כיסוי מיקרוסקופ להחליק על גבי ולהמתין עד antifadent התפשט על פני השקופית כולה. שים לב כי כמות מוגזמת של antifadent יכול לטשטש את תמונת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את דגימות תחת מיקרוסקופ סורק לייזר confocal מצויד מסננים או לייזרים מתאים. השתמשנו TCS לייקה יחידה (HCX PL APO/63x: NA 1.2). הנתונים ניתן לנתח עם תוכנות כגון IMARIS או עמירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות מוטבעים antifadent ניתן לאחסן 4 ° C (לא להקפיא) עד 7 ימים לפני בדיקה, שמעניקה הקרינה מתחילה לרדת. לחלופין, antifadent ניתן להסיר עם DDH 2 O, ואת השקופיות יבשים ניתן לאחסן -20 ° C במשך תקופה ארוכה של זמן. </li></ol> 6. נציג תוצאות: אוספות את biofilm מכשירים אורתודונטים קבועים (איור 5) תשואות פתיתים מתאים (איור 6) כי יכול להיות הכלאה ישירות על שקופיות הזכוכית מצופה עבור במיקרוסקופ. בדרך זו, קבוצות שונות של חיידקים orobiome ניתן לזהות את הסביבה הטבעית תלת ממדי על ידי rRNA תיוג חיידקי עם בדיקות ספציפיות שכותרתו שונה (איורים 7 ו -8). באיור 7, biofilm היה מוכתם EUBmix (ירוק, כל החיידקים) ו LGCmix (צהוב, Firmicutes). Firmicutes מופיעים ירוק, כפי שהם היו מוכתמות צהוב וכחול. באיור 8, biofilm היה מוכתם EUBmix (אדום, כל החיידקים), Bac303 (כחול, Bacteroidetes) ו POGI (צהוב, gingivalis Porphyromonas). Gingivalis Porphyromonas מוצג לבן צהבהב, כמו בכל שלוש בדיקות להיקשר ל-DNA שלו, את החפיפה תוצאות הצבעים אות לבנה. הבדלים מורפולוגיים בין קבוצות של חיידקים יכולים גם להיות מזוהה (איורים 9 ו -10). אשכולות גדולים של חיידקים coccoid מוצגים באיור 9, שם מכתים בוצע EUBmix (ירוק, כל תואר ראשוןcteria). צורות שונות של חיידקים דרך הפה היו דמיינו איור 10, שבו חיידקים coccoid ו פילמנטיות ניתן להבחין על ידי צביעה עם EUBmix (אדום). כמו כן, מבנה אופייני דמוי הפטרייה של biofilm יכול להיות מעובד באמצעות מודלים 3D של הנתונים CLSM (איורים 11 ו -12) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2967/Film1%20Klug%20Santigli%2001_2_JES_Web.mov">לחץ כאן כדי לצפות בסרט של מודלים 3D.</a> <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. קבוע palatal expander באתרם. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. מערכת נולה שדה יבש. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> באיור 3. צבת הוא עיקר, כפפות מגש. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. הוסר ההרחבה. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 5"> איור 5. אוספות את biofilm עם אזמל סטרילי. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig6.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 6"> איור 6. פתיתים שרף הכלאה ישירות על שקופיות הזכוכית מצופה. <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig7.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 7"> איור 7 תמונה CLSM:. בידול של קבוצת חיידקים ספציפיים. כיסוי 2D ערימת נתונים 3D CLSM. Biofilm מוכתם EUBmix (ירוק, כל החיידקים) ו LGCmix (צהוב, Firmicutes). <img alt="איור 8" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig8.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 8"> איור 8 תמונה CLSM:. בידול של קבוצת חיידקים ספציפיים. כיסוי 2D ערימת נתונים 3D CLSM. Biofilm מוכתם EUBmix (אדום, כל החיידקים), Bac303 (כחול, Bacteroidetes) ו POGI (צהוב, gingivalis Porphyromonas). <img alt="איור 9" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig9.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 9"> איור 9 תמונה CLSM:. בידול של מורפולוגיות ספציפיים. כיסוי 2D ערימת נתונים 3D CLSM. Biofilm מוכתם EUBmix (ירוק, כל החיידקים). אשכולות גדולים של חיידקים coccoid (חיצים). <img alt="איור 10" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig10.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 10"> . איור 10 CLSM תמונות: בידול של מורפולוגיות ספציפיים. כיסוי 2D ערימת נתונים 3D CLSM. Biofilm מוכתם EUBmix (אדום, כל החיידקים). Coccoid (חץ למטה) וחיידקים פילמנטיות (חץ למעלה) ניתן להבחין. <img alt="איור 11" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig11.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 11"> איור 11. מבנה פטריות, תצוגות 3D מלמטה. ערימות של biofilm פתיתים (לגרד פני השטח של מכשיר אורתודונטי), מוכתם EUBmix ו processed עם IMARIS (תמונה CLSM). <img alt="איור 11" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig11.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 11"> איור 12. מבנה פטריות, להציג צד 3D. ערימות של biofilm פתיתים (לגרד פני השטח של מכשיר אורתודונטי) מעובד עם IMARIS (תמונה CLSM). <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="4"> הכלאה חיץ (200 μl) </td></tr><tr><td> לפוראמיד ריכוז </td><td> 10% </td><td> 20% </td><td> 45% </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> 36 </td><td> 36 </td><td> 36 </td></tr><tr><td> 1 M טריס-HCl </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 2% SDS </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> FA </td><td> 20 </td><td> 40 </td><td> 90 </td></tr><tr><td>2 O </td><td> 138 </td><td> 118 </td><td> 68 </td></tr><tr><td> כל בדיקה FISH </td><td> 2 </td><td> 2 </td><td> 2 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. מרכיבי חיץ הכלאה (ריכוזים ב μl). <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="4"> חיץ כביסה (50 מ"ל) </td></tr><tr><td> לפוראמיד ריכוז </td><td> 10% </td><td> 20% </td><td> 45% </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> 4500 </td><td> 2150 </td><td> 300 </td></tr><tr><td> 1 M טריס-HCl </td><td> 1000 </td><td> 1000 </td><td> 1000 </td></tr><tr><td> 0.5 M EDTA </td><td> 0 </td><td> 500 </td><td> 500 </td></tr><tr><td> DDH 2 O </td><td> 44 500 </td><td> 46 350 </td> 48 200 </tr></tbody></table> טבלה 2. מרכיבי חיץ כביסה (ריכוזים ב μl). סרט 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2967/Film1%20Klug%20Santigli%2001_2_JES_Web.mov">לחץ כאן כדי לראות את הסרט.</a>

<ol><li>Sunde, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+for+direct+visualization+of+bacteria+in+periapical+lesions+of+asymptomatic+root-filled+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of bacteria in periapical lesions of asymptomatic root-filled teeth.</a> Microbiology. 149, 1095-1102 (2003).</li>
<li>Sussman, M., Loya, Y., Fine, M., Rosenberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marine+fireworm+Hermodice+carunculata+is+a+winter+reservoir+and+spring-summer+vector+for+the+coral-bleaching+pathogen+Vibrio+shiloi%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The marine fireworm Hermodice carunculata is a winter reservoir and spring-summer vector for the coral-bleaching pathogen Vibrio shiloi.</a> Environ. Microbiol. 5, 250-255 (2003).</li>
<li>Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Communication+among+oral+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Communication among oral bacteria.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66, 486-505 (2002).</li>
<li>Zijnge, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+biofilm+architecture+on+natural+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Oral biofilm architecture on natural teeth.</a> PLoS One. 5, e9321-e9321 (2010).</li>
<li>Thurnheer, T., Gmur, R., Giertsen, E., Guggenheim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+fluorescent+in+situ+hybridization+for+the+specific+detection+and+quantification+of+oral+streptococci+in+dental+plaque%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated fluorescent in situ hybridization for the specific detection and quantification of oral streptococci in dental plaque.</a> J. Microbiol. Methods. 44, 39-47 (2001).</li>
<li>Hojo, K., Nagaoka, S., Ohshima, T., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+interactions+in+dental+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Dent.+Res%22%5BJournal%5D)">Bacterial interactions in dental biofilm development.</a> J. Dent. Res. 88, 982-990 (2009).</li>
<li>Jung, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+initial+bacterial+colonization+on+dentine+and+enamel+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Visualization of initial bacterial colonization on dentine and enamel in situ.</a> J. Microbiol. Methods. 81, 166-174 (2010).</li>
<li>Al-Ahmad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+colonization+of+enamel+in+situ+investigated+using+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial colonization of enamel in situ investigated using fluorescence in situ hybridization.</a> J. Med. Microbiol. 58, 1359-1366 (2009).</li>
<li>Bryers, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medical+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Medical biofilms.</a> Biotechnol. Bioeng. 100, 1-18 (2008).</li>
<li>Cardinale, M., Vieira de Castro, J., Muller, H., Berg, G., Grube, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+analysis+of+the+bacterial+community+associated+with+the+reindeer+lichen+Cladonia+arbuscula+reveals+predominance+of+Alphaproteobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">In situ analysis of the bacterial community associated with the reindeer lichen Cladonia arbuscula reveals predominance of Alphaproteobacteria.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 66, 63-71 (2008).</li>
<li>Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+normal+bacterial+flora+of+the+oral+cavity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Defining the normal bacterial flora of the oral cavity.</a> J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).</li>
<li>Chin, M. Y., Busscher, H. J., Evans, R., Noar, J., Pratten, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+biofilm+formation+and+the+effects+of+antimicrobial+agents+on+orthodontic+bonding+materials+in+a+parallel+plate+flow+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Orthod%22%5BJournal%5D)">Early biofilm formation and the effects of antimicrobial agents on orthodontic bonding materials in a parallel plate flow chamber.</a> Eur. J. Orthod. 28, 1-7 (2006).</li>
<li>Loy, A., Maixner, F., Wagner, M., Horn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((probeBase--an+online+resource+for+rRNA-targeted+oligonucleotide+probes%3A+new+features+2007%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes: new features 2007.</a> Nucleic. Acids. Res. 35, (2007).</li>
<li>Diaz, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+subject-specific+oral+microflora+during+initial+colonization+of+enamel%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of subject-specific oral microflora during initial colonization of enamel.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 2837-2848 (2006).</li>
<li>Dige, I., Nilsson, H., Kilian, M., Nyvad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+identification+of+streptococci+and+other+bacteria+in+initial+dental+biofilm+by+confocal+laser+scanning+microscopy+and+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Oral+Sci%22%5BJournal%5D)">In situ identification of streptococci and other bacteria in initial dental biofilm by confocal laser scanning microscopy and fluorescence in situ hybridization.</a> Eur. J. Oral Sci. 115, 459-467 (2007).</li>
<li>Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+interactions+and+successions+during+plaque+development%5BTitle%5D)+AND+%22Periodontology%22%5BJournal%5D)">Bacterial interactions and successions during plaque development.</a> Periodontology. 42, 47-79 (2000).</li>
<li>Kolenbrander, P. E., Palmer, R. J., Periasamy, S., Jakubovics, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+multispecies+biofilm+development+and+the+key+role+of+cell-cell+distance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Oral multispecies biofilm development and the key role of cell-cell distance.</a> Nat. Rev. Microbiol. 8, 471-480 (2010).</li>
<li>Chalmers, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+quantum+dot+luminescent+probes+to+achieve+single-cell+resolution+of+human+oral+bacteria+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of quantum dot luminescent probes to achieve single-cell resolution of human oral bacteria in biofilms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 630-636 (2007).</li>
<li>Wecke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+monitoring+the+development+of+bacterial+biofilms+in+human+periodontal+pockets%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">A novel technique for monitoring the development of bacterial biofilms in human periodontal pockets.</a> FEMS Microbiol. Lett. 191, 95-101 (2000).</li>
<li>Moter, A., Gobel, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+for+direct+visualization+of+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of microorganisms.</a> J. Microbiol. Methods. 41, 85-112 (2000).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

להלן פרוטוקול המתואר היא גישה מעשית מאוד biofilms מכתים שנאספו חומרים קשים. דגימה הכלאה השלבים הקריטיים ביותר. במהלך הדגימה, יש להקפיד כי פרוסות בעובי הולם נאספים כדי להבטיח את מבנה biofilm נשאר שלם. במהלך ההכלאה, זה חיוני כדי למנוע תנודות מוגזמות בטמפרטורה, ובכך נמנע הלא ספציפית מחייב, או אובדן של הכריכה, של בדיקות שכותרתו fluorescently. זה פרוטוקול FISH היא שיטה אלגנטית להכתים biofilm הטרוגנית רגילה ישירות על שקופיות זכוכית מבלי לשבש את הרכבו. השקופיות יכול מיד לשמש מיקרוסקופיה ללא צורך להזיז את המדגם שוב. בדרך זו, שיפור פני מכתים בתוך צינורות מושגת על ידי כוח גזירה פחות מוחל על biofilm. Slices&gt; 50 מיקרומטר עבה יכול להיות מוכן לחקור באופן זה.

biofilm ניתוח שבעל פה של palatal expanders על ידי הכלאה ב-situ פלואורסצנטי מיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר

Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy

לייזר Confocal מיקרוסקופיית (CLSM) של biofilm הטרוגנית טבעית היום בהנחייתם של מגוון רחב של טכניקות צביעה, אחד מהם הוא הקרינה הכלאה באתרו (FISH). 1,2 ביצענו מחקר פיילוט שבו דגימות biofilm אוראלי שנאספו קבוע מכשירי אורתודונטי (palatal expanders) הוכתמו על ידי דגים, המטרה להיות כדי להעריך את הארגון התלת מימדי של biofilm טבעי הצטברות פלאק. 3,4 דגים יוצר הזדמנות להכתים תאים בסביבה biofilm האם שלהם על ידי שימוש 16S שכותרתו fluorescently rRNA במיקוד בדיקות. 4-7,19 לעומת טכניקות חלופיות כמו תיוג immunofluorescent, זוהי טכניקה זולה, וסימון מדויק וישיר לחקור קבוצות חיידקים שונים קונסורציומים biofilm מעורבת. 18,20 בדיקות כלליות שימשו אשר נקלטות על ידי Eubacteria ( EUB338 + + EUB338II EUB338III; להלן EUBmix), 8-10 Firmicutes (LGC354 AC;. LGCmix להלן), 9,10 ו Bacteroidetes (Bac303) 11 בנוסף, בדיקות ספציפיות מחייב mutans סטרפטוקוקוס (MUT590) 12,13 ו gingivalis Porphyromonas (POGI) 13,14 שימשו . הקשיות קיצונית של החומרים משטח מעורב (נירוסטה שרף אקרילי) אילצה אותנו למצוא דרכים חדשות להכנת biofilm. כאשר חומרים אלה משטח לא ניתן לחתוך בקלות עם cryotome, שיטות דגימה שונים נחקרו להשיג biofilm אוראלי ללא פגע. עביד ביותר של גישות אלה מוצגת בתקשורת זו. פתיתים קטנים של שרף biofilm נושאי אקריליק היו לגרד עם אזמל סטרילי, נזהרת שלא לפגוע במבנה biofilm. מלקחיים ששימשו לאיסוף biofilm מן משטחי פלדה. לאחר שנאספו, מהדגימות היו קבועים ממוקם ישירות על polysine שקופיות זכוכית מצופה. FISH בוצעה ישירות עם מ &#39;בדיקות בשקופיות אלהentioned לעיל. פרוטוקולים דגים שונים היו משולבים שונה כדי ליצור פרוטוקול חדש זה היה קל להתמודד. 5,10,14,15 לאחר מכן הדגימות נותחו על ידי מיקרוסקופ לייזר confocal סריקה. ידוע תצורות 3,4,16,17 יכול להיות דמיינו, כולל פטריות בסגנון תצורות ואשכולות של חיידקים coccoid הספוגה ערוצים. בנוסף, הרכב חיידקי של מבנים אלה biofilm טיפוסי נותחו ותמונות 2D and 3D נוצר.

אנו מציגים פרוטוקול לניתוח מבניים ההלחנה של biofilm אוראלי טבעי עם מכשירים אורתודונטים<em&gt; באתרו</emהכלאה&gt; (FISH) ו מיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר (CLSM). דגימות biofilm אוראלי נאספו palatal expanders, גירוד, שרף אקרילי פתיתי את פני השטח שלהם ומתייחסים אליהם לעיבוד מולקולרית.

Biofilm ניתוח שבעל פה של Palatal expanders על ידי הכלאה ב-situ פלואורסצנטי מיקרוסקופיה Confocal סריקת לייזר

מיקרוסקופיה קונפוקלית סורקת בלייזר (CLSM) של ביופילם הטרוגני טבעי מונחית כיום על ידי מגוון מקיף של טכניקות צביעה, אחת מ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להשיג ביופילם פה טבעי ממגבירי חך עבור היברידיזציה באתר במקום (fluorescence in situ hybridization). הדבר מבוצע תחילה על ידי הסרת מגביר החך, הנושא את הביופילם בנ לה חודשים מהמטופל. לאחר מכן, שבבי שרף אקרילי המכילים את הביופילם נגרדים ממגביר החך.לאחר מכן, ביצוע היברידיזציה פלואורסצנטית (FISH) של הביופילם המקובע נעשה ישירות על שקופיות מצופות. לבסוף, ניתוח של הביופילם הצבוע מבוצע באמצעות מיקרוסקופיית סריקה לייזר קונפוקלית (CLSM). לסיכום, המבנה וההרכב של קהילות ביופילם חיידקי מוצגים באמצעות היברידיזציה פלואורסצנטית במקום (FISH) ומיקרוסקופיית סריקה לייזר קונפוקלית. הרעיון לשיטה זו עלה אצלנו לראשונה כאשר נתקלנו בביופילמים עבים על מרחיבים אורתודונטיים שהיו גלויים לעין בלתי מזומנת.הם גרמו לנו לחשוב על קשרים אפשריים ביניהם לבין מחלות חניכיים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום המיקרוביולוגיה הפהית, כגון ההסדר המרחבי וההרכב של ביופילמים טבעיים בחלל הפה. השיטה היא רב-תחומית ויש לבצעה על ידי מומחים שונים.כדי להתחיל, אליזבת היא אורתודונטית וברברה היא ביולוגית של מעבדת מולקולות. לאחר ארבעה חודשים של חשיפה לפני השטח התוך-פה, השתמשו במערכת השדה היבש של NOLA כדי לבודד את המרחיב החיכי הקבוע על מנת למנוע זיהום. הסירו את המכשיר מפיו של המטופל באמצעות פליירים סטריליים, כפפות ותבניות.יש לאחסן את הדגימות במבחנות בנפח 120 milliliter בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius. יש להעביר אותן למעבדה על קרח ולעבד אותן תוך 24 שעות לצורך קיבוע הדגימות. גרדו פתיתי ביופילם באמצעות סכין מנתחים סטרילית או אספו חתיכות באמצעות פינצטה סטרילית.חיוני לגרד פתיתי שרף אקרילי בעובי מתאים כדי להבטיח שמבנה הביופילם יישאר שלם בטמפרטורה קרה מאוד. הוסיפו תמיסת paraldehyde בריכוז 4% עד שהמדגם מכוסה היטב. דגרו את התערובת בטמפרטורה של 4 °C למשך 3 עד 12 שעות.זמני קיבוע ממושכים יותר או טמפרטורות קיבוע גבוהות יותר עשויים להפוך את מעטפות התאים של תאים גרם-שליליים לפחות חדירות לגששים של אוליגונוקלאוטידים. לאחר האינקובציה, הסירו את תמיסת הפראלדהיד ושטפו פעם אחת עם PBS בריכוז 1X קר מאוד. חזרו על שלב זה שתיים עד שלוש פעמים כדי להסיר שאריות פראלדהיד, השתמשו בנפח אחד של PBS בריכוז 1X קר מאוד עבור הדגימה והוסיפו נפח אחד של אתנול 96% קר מאוד; אחסנו את הדגימה בטמפרטורה של 20°C-.ניתן לאחסן דגימות למשך מספר חודשים עד שנים כדי לייבש את הדגימה. ראשית, יש להניח 5 עד 30 µL של חומר דגימה מקובע ב-paraldehyde על סרט מיקרוסקופ. יש לייבש את הדגימה למשך 15 דקות ב-46 °C, או למשך זמן ממושך יותר בטמפרטורת החדר, בזמן שהדגימה מתייבשת, כדי שהליזוזים והפורמאלדה יפרקו חלקית את דפנות התאים.כדי לשפר את חדירת הגששים, הוסיפו 250 µL של תמיסת ליזוזים בריכוז 1 mg/mL למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן טבלו את השקופיות ב-ethanol בריכוזים של 50%, 80% ו-96% למשך שלוש דקות בכל שלב. אפקט ההתייבשות של סדרת ריכוזי ה-ethanol יפרק את הממברנות כדי לשפר את ספיגת הגששים האוליגוניוקלאוטידיים. לבסוף, ייבשו את השקופיות בטמפרטורה של 46 °C כדי לבצע היברידיזציית U in situ.התחילו בהכנת מיליליטר אחד של תמיסת היברידיזציה טריה וחממו אותה מראש ל-47 °C. הפשירו את תמיסות הגששים (Probes) האוליגונוקליאוטידיים על קרח ושמרו אותם מוגנים מאור. הניחו פיסת נייר סופג בתוך צלחת פטרי ריבועית וטפטפו בעזרת פיפט 800 µL של תמיסת ההיברידיזציה על נייר הספיגה.סגרו את התא שוב באופן מיידי כיוון שהבופר מכיל formamide; הוסיפו 2 µL מכל גשוש (probe) ל-200 µL משאר בופר ההיברידיזציה. ערבבו היטב והנחте את התערובת על הדגימה המיובשת על גשרית מיקרוסקופ; הניחו מיד את הגשרית בצורה אופקית בתוך הצלחון וכסו אותה. דגרו את הצלחון בתנור למשך שעה אחת עד חמש שעות בטמפרטורה של 46 °C.הצלחת משמשת כתא לחות המונע התאיידות של תמיסת ההיברידיזציה מהשקופית. בפרט, התאיידות של form amide עלולה לגרום להיקשרה לא ספציפית של הגשש לתאים שאינם תאי מטרה. הכינו 50 milliliters של בופר שטיפה וחממו אותו מראש ל-48 degrees Celsius במקלחית.הוציאו את הצלחית עם השקופית מתנור ההיברידיזציה. שטפו מיד את תמינת ההיברידיזציה באמצעות נפח קטן של תמיסת שטיפה שחוממה מראש, והעבירו את השקופית אל שאר תמיסת השטיפה. החזירו את המבחנה המכילה את תמיסת השטיפה ואת השקופית אל מקלח המים והדגירו למשך 10 עד 15 דקות בטמפרטורה של 48 degrees Celsius.כדי לצבוע את הדגימות ביותר מגשושית אחת, חזור על השלבים הקודמים לאחר הסרת תמיסת השטיפה, והקפד להתחיל מהריכוז הגבוה ביותר ולעבור לריכוז נמוך יותר. הוצא את השקופית מהמבחנה וטבול אותה בקרח.מים קרים מזוקקים פעמיים למשך שתיים עד שלוש שניות. כדי להסיר שאריות של תמיפת שטיפה, ייבשו את הפסייד באוויר במהירות האפשרית, שכן ייבוש מהיר מפחית את הדיסוציאציה של הגששים.יש לשמור את השקופיות המיובשות בחושך בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius למשך מספר שבועות ללא אובדן משמעותי של אות הפלואורסצנציה המוענק על ידי הגשש. לצורך הדמיית הדגימות, יש להניח שתי טיפות של רכיב Antifa קרוב לקצוות השמאלי והימני של השקופית, ולאחר מכן להוסיף זכוכית כיסוי. יש לבחון את הדגימות תחת מיקרוסקופ סריקה לייזרי קונפוקאלי המצויד במסננים או בלייזרים מתאימים; ניתן לשמור את השקופיות בטמפרטורה של four degrees Celsius למשך עד שבעה ימים, או לשטוף אותן במים מזוקקים פעמיים ולשמור בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius לתקופות ארוכות יותר.זהו תהליך של קיבוע ביופילם ממכשירי אורתודונטיה קבועים. תקבלו פרוסות מתאימות שניתן להכליב ישירות על שקופיות זכוכית מצופות לצורך מיקרוסקופיה; באמצעות גשים ספציפיים, ניתן לזהות קבוצות שונות של מיקרוביום פה וחיידקים בתצורה תלת-ממדית. באיור זה, הביופילם נצבע בתערובת EUB, כאשר גוון ירוק מופיע בזכות צביעה בתערובת LGC בצבעי צהוב וכחול.כאן נצבע הביופילם עם תערובת EUB mix back 3 0 3 ו-pogi. חיידקים מקבוצת bacteria dts מופיעים בצבע ורוד ו-poor fire. Ramons gingivalis מופיע בצבע לבן-צהבהב, כיוון ששלוש הגששים נקשרים ל-DNA שלו והחפיפה של הצבעים גורמת לאות לבן מורפולוגי.ניתן לזהות גם הבדלים בין קבוצות של חיידקים, וכן מבנים מסוימים כגון צבירים גדולים של חיידקים קוקיים (coco bacteria). דוגמאות לצבירים כאלה מוצגות כאן, כאשר נעשה שימוש בתערובת EUB לצביעה. בנוסף, ניתן לעבד מבנה טיפוסי של הביופילם הדומה לפטרייה באמצעות מידול תלת-ממדי של נתוני ה-CLSM.זוהי אנימציה תלת-ממדית של ביופילם שצבעו בצביעה מעורבת של EUB. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי היווצרות ביופילם המושרה על ידי טיפול אורתודונטי. היא יכולה להיות מיושמת גם על כל משטח מלאכותי אחר בגוף האדם הנושא מבני ביופילם מורכבים בעלי פתוגניות אפשרית.לאחר צפייה בסרטון זה, תגמירו עם הבנה טובה של אופן הכנת ביופילמים אוראליים טבעיים עבור היברידיזציה פלואורסצנטית באתרים (FISH) ומיקרוסקופיה קונפוקלית עם סריקה בלייזר. חשוב לזכור כי זהו תחום רב-תחומי וניתן להצליח בו רק כחלק מצוות, לכן התייחסו תמיד לקולגות שלכם בנעימות.

oral-biofilm-analysis-palatal-expanders-fluorescence-situ

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

Biofilms נוצר על משטחי השן הם מורכבים מאוד חשוף מתמיד אתגרים סביבתיים מולד אקסוגניים, אשר לווסת את הארכיטקטורה שלהם, פיזיולוגיה transcriptome. פיתחנו ארגז הכלים לבחון את הרכב, ארגון מבניים ביטוי גנים של biofilms דרך הפה, אשר ניתן להתאים בתחומים אחרים של מחקר biofilm.

כלי אנליטי תיבת להערכת ביוכימיים, מבנית Transcriptome מקיף של Biofilms אוראלי בתיווך Mutans streptococci

סרטון זה מדגים בדיקה בזמן אמת לניטור pH חוץ-תאי בביופילמים דנטליים באמצעות בדיקה רציומטרית רגישה ל-pH. כאשר ביופילם חיידקי שגדל באתרו נחשף לגלוקוז, ירידה ברמת החומציות החוץ-תאית ליד הביומסה של החיידק מחזקת את הגשושית, מה שמוביל לריכוז מוגבר שלה בתוך החיידקים. הפער באורך גל הפליטה בין הגשושית הפרוטונית והלא פרוטונית מנוצל לחישוב ה- pH על פני המטריצה החוץ-תאית של הביופילם ולמעקב אחר שינויי pH לאורך זמן.

בדיקה לניטור בזמן אמת של pH חוץ-תאי בביופילמים דנטליים

מוצג פרוטוקול לכימות והשוואה בו-זמנית של שלושה רכיבים תאיים וחוץ-תאיים בתוך ביופילמים. המתודולוגיה כוללת שימוש במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי, תוכנת ניתוח והדמיה מבנית של ביופילם ותוכנת ניתוח סטטיסטי.

כימות בו-זמני של רכיבים תאיים וחוץ-תאיים של ביופילמים

מטרת נייר שיטות זה היא לתאר את השימוש במערכת microfluidic לפיתוח biofilms רב-מינים המכילים מינים מזוהים בדרך כלל ברובד השיניים supragingival אנושי. שיטות לתיאור ארכיטקטורת biofilm, כדאיות biofilm, וגישה לbiofilm קציר לניתוחים תלוית תרבות או תרבות העצמאית מודגשות.

שימוש בתפוקה גבוהה<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת Microfluidic לפתח Biofilms Multi-מינים שבעל פה

לצבוע ratiometric רגיש pH משמש בשילוב עם מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal וניתוח תמונה דיגיטלית לפקח pH תאיים biofilms שיניים בזמן אמת.

הדמית ratiometric של pH התאי Biofilms השיניים

פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשה לגדול ואיכותי לנתח biofilms חיידקים על עובש פטרייתי על ידי מיקרוסקופ confocal אלקטרונים.

שיטה חדשה לניתוח איכותי רב היקף של Biofilms חיידקית על פילמנטיות פטרייתיים המושבות Confocal שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים

שינויים microbiome דרך הפה לאורך כל הילדות הם עניין גובר. השוואה של מחקרים שונים microbiome מגלה חוסר דגימה מתוקננת פרוטוקולים. שטח מוגבל גורם הדגימה את sulcus subgingival צליל של ילדים מאתגרים. נייר נקודת דגימה מוצג כאן בפירוט שיטת הבחירה עבור אזור זה.

אוראלי Biofilm דגימה לניתוח Microbiome ב ילדים בריאים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להעריך ביופילמים אוראלי על חומרי טיטניום, אסתטיים תותבת שיניים abutments, כולל הניתוח של תאים חיידקיים הכדאיות ומאפיינים מורפולוגי. בחיי עיר מודל המשויך טכניקות במיקרוסקופ עוצמה משמשת לניתוח biofilm אוראלי.

ביופילמים אוראלי על חומרים שונים עבור שתלים דנטליים

הפרוטוקול מתאר את הטיפוח של ממלכת הבין-מלכות המורכבת מקנדידה מיקרובינים ו סטרפטוקוקוס ומציג שיטה מבוססת-מיקרוסקופ מבוסס על הניטור של pH מואנים בתוך הביואמים האלה.

מעקב אחר תמציות ביומיסקופיה באמצעות מיקרוסקופ Confocal וקדי

מחקר זה מציג הליך ניתוח תמונה דיגיטלי חצי אוטומטי לכימות פלנימטרי של רובד דנטלי חשוף בהתבסס על תמונות שנרכשו במצלמת פלואורסצנטיות אינטרה-אוראלית. השיטה מאפשרת כימות מהיר ואמין של פלאק דנטלי בסביבת המחקר.

כימות פלנימטרי חצי אוטומטי של פלאק דנטלי באמצעות מצלמת פלואורסצנטיות אינטרה-אוראלית

מטרת הפרוטוקול היא לספק גישה סטנדרטית להערכה כמותית של שלמות מחסום האפיתל החניכיים בעכברים על ידי יישום מקומי של דקסטרנים מסומנים בפלואורסצנציה בגדלים מולקולריים משתנים על פני החניכיים ב-vivo, ואחריהם הדמיה אקס-ביבו באמצעות מערכת מיקרוסקופיה של פוטון יחיד.

הערכה פונקציונלית של מחסום אפיתל חניכיים בעכברים באמצעות מעקבים פלואורסצנטיים

למדו לנתח ביופילם פה טבעי ממכשירי הרחבה פלטינליים באמצעות FISH ומיקרוסקופיית לייזר סריקה קונפוקלית. שיטה זו מאפשרת חקר הרכב ומבנה קהילות חיידקיות בפה.

Biofilm ניתוח שבעל פה של Palatal expanders על ידי הכלאה ב-situ פלואורסצנטי מיקרוסקופיה Confocal סריקת לייזר

גלה סרטונים נוספים