סידן הדמיה של ריח עוררו התגובות תסיסנית מחושים האונה

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד את הפעילות הפיזיולוגית של נוירוני הריח בדרוזופילה ובאונה האנטנה על ידי הדמיה אופטית של שינויים בסידן תוך תאי. זה מושג על ידי הרכבה ראשונה של מחזיק חוט בלוק ההרכבה ומגן האנטנה. לאחר מכן, זבוב המבטא את חיישן הסידן הפלואורסצנטי GCaMP מותקן ומקובע לבלוק.

לאחר הרכבת הזבוב, הציפורן בחלק העליון של ראש הזבוב נחתכת כדי לחשוף את אונות האנטנה. השלב האחרון בהליך הוא להציב את הזבוב מתחת למיקרוסקופ ולעורר אותו בריח. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות דפוסי פעילות מעוררי ריח באונות האנטנה של DLA באמצעות שינויים מתועדים בקרינה היחסית של חיישן הסידן G camp.

שיטה זו יכולה לעזור לחשוף כיצד ריחות מיוצגים כדפוסים מרחביים וזמניים של פעילות עצבית ברמות שונות של מעגלי הריח. היתרון העיקרי של השיטה הזו על פני שיטות אחרות כמו אלקטרופיזיולוגיה הוא שאנו יכולים לתעד את הפעילות של נוירונים שזוהו גנטית שאינם נגישים לאלקטרודות הקלטה. אם כי שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי העיבוד העצבי של ריחות.

ניתן ליישם אותו גם על אזורים אחרים במוח הג'וף, כגון מערכת השמיעה ומערכת הגזים. ראשית, השחילו את הברגים דרך החלק האחורי של בלוק ההרכבה של פרספקס, כך שהם לא יתרחבו מעבר לחזית. השתמש במקדחה מדויקת כדי ליצור שקע בגבול העליון של החדר העגול עבור הזבוב על ידי חפירה מתחת לפני השטח כדי להפחית את עובי הבלוק.

תחת טווח ניתוח, חותכים רשת נחושת עם אזמל בניצב וקרוב לתחתית החריץ כדי ליצור צווארון להחזקת הזבוב. ודא ששני הדשים המתקבלים מפולסים מכיוון שהדבר יסייע בהחדרת הזבוב. בעזרת קיסם, הניחו טיפה קטנה של דבק סופר על גוש ההרכבה מעל החדר העגול.

עבור הזבוב, הנח את רשת הנחושת על הדבק ומקם כך שהחריץ יהיה מרוכז על הבלוק. לחץ בעדינות על הרשת והסר את כל הדבק העודף בעזרת פינצטה. הוסף טיפות דבק זעירות מתחת לדשים מכל צד וקפל את הרשת מעל החלק הקדמי של הבלוק כך שהחריץ יפנה ישר כלפי מטה.

ודא שהחלק העליון של הרשת ישר עם הבלוק ואפשר לו להתייבש לחלוטין. כדי ליצור מחזיק תיל, חותכים כיסוי פלסטיק להחליק לשניים ומסירים חתיכה מרכזית ליצירת צורת U. השתמש בשעוות דבורים כדי להדביק חתיכת חוט על פני החלק העליון של ה-U כך שהחוט לא יהיה t מדי.

בנה מגן אנטנה באמצעות ניקוב חור נייר כדי לגרום לחור בכיסוי פלסטיק להחליק. חתוך את שולי החלקת הכיסוי ל 0.5 על 0.7 סנטימטרים. הדביקו את כיסוי הפלסטיק המנוקב על סרט דביק, ולאחר מכן הניחו טיפת אתנול על הסרט שנחשף דרך החור.

כדי להסיר את הדבק, יש להרדים זבובים בני שבוע עד שלושה שבועות של הגנוטיפ המתאים על ידי קירורם על קרח. תחת טווח הניתוח, הרם זבוב על ידי מפרק הכנף והחלק אותו תחילה על פני השטח הגבי לאורך רשת הנחושת כך שהוא תלוי על ידי הצוואר. במידת הצורך, סובב את הזבוב עד שהוא מסתכל למטה.

הניחו עמוד שדרה דק של קקטוס מול ראשו של הזבוב כדי למנוע ממנו לברוח ומקמו את עמוד השדרה מול החרטום כדי למנוע ממנו לנוע. קבע את עמוד השדרה של הקקטוס לבלוק באמצעות שעוות דבורים, וודא שהחלק העליון של הראש ישר עם החלק העליון של הבלוק. תקן את ראש הזבוב לבלוק עם טיפה קטנה של רוזין מומס באתנול.

מניחים את הבלוק בקופסה לחה ומניחים לרוזין להתקשות כשעה. בעזרת מלקחיים, משוך את לוחית האנטנה קדימה ושחרר את מחזיק החוט בקפל הציפורני בין האנטנה לראש. תקן את המחזיק לקדמת הבלוק עם שעוות דבורים נוספת.

בעזרת הברגים המובנים בבלוק, דחף בעדינות את מחזיק החוט קדימה כדי ליצור מרווח בין לוחית האנטנה לראש. הנח את מגן האנטנה מעל החלק העליון של ראש הזבוב כשכולו ממוקם במרכז. תקן את המגן לראש גוש ההרכבה בעזרת שעוות דבורים.

בעזרת מפצל להב, חותכים חור קטן בסרט שעל המגן, חושפים את הציפורן של ראש הזבוב מאחורי האנטנה. החור לא אמור להתרחב מעבר לעיניים כדי למנוע דליפת התכשיר. אטום את החור בין הסרט לציפורן עם סיליקון דו-רכיבי.

הסר את כל עודפי הסיליקון מהחלק העליון של ראש הזבוב. הניחו טיפה של מי מלח צלצול דרוזופילה על ראשו של הזבוב, וודאו שאין נזילות ושהאנטנות יישארו יבשות לחלוטין. בעזרת להב ספיר קלעו קלות לאורך הקפל הקוטיקולרי ישירות מאחורי האנטנה.

לאחר מכן חותכים לאורך העיניים ולרוחב הסלי מאחור. לבסוף, קפלו את חתיכת הציפורן על הקצה המנוקד וחתכו מהצד התחתון. כדי להימנע מניתוק עצבי האנטנה, הסר בזהירות את הבלוטות וקנה הנשימה בעזרת פינצטה עדינה.

שוטפים שוב ושוב עם תמיסת רינגר דרוזופילה, ומשאירים טיפה גדולה על הראש. הכנס כרית תאית למזרק פלסטיק של שני מיליליטר עם מלקחיים נקיים. בעזרת קצה פיפטה מסונן, מרחו 20 מיקרוליטר של ריח מדולל.

חבר ומכסה את המזרק עד שיידרש להדמיה. הנח את התושבת המכילה את הזבוב מתחת למיקרוסקופ. הורד את המטרה עד שהיא נוגעת בתמיסת הצלצול בראשו של הזבוב.

התבוננות דרך הצופה תחת תאורת שדה בהיר, מקם את התכשיר כך שהחור בקפסולת הראש יהיה ממורכז וגבולותיו יהיו ממוקדים. עברו לאור פלואורסצנטי והתאימו את המיקוד עד שתוכלו לראות את תאי העצב המסומנים במדינה, שאמורים להיות גלויים מהפלואורסצנציה הירוקה הבסיסית של GCaMP. רכוש תמונות עם מצלמת CCD המותקנת על המיקרוסקופ באמצעות תוכנת רכישה מתאימה ומצא מיקוד בגלומרולי המעניין.

הקפד לסגור את הסרעפת בנתיב אור התאורה כדי להגביל את אור העירור לאזור התמונה. מקם את יציאת האולפקטומטר כ- 0.5 סנטימטרים מול אנטנות הזבובים. כאן, האונות האנאליות מוצגות בזבוב המבטא GCaMP 1.6 תחת שליטתו של מקדם נוירונים חושי ריח המניע ביטוי במספר גירוי גלומרולי עם 1% חומצה פרופיונית מעוררת עלייה בפלואורסצנטיות GAMP המצביעה על עלייה בסידן תוך תאי, בנוירונים חושי ריח, גלומרולים עצבניים, DC ארבע ו-DP אחד L. הדינמיקה הטמפורלית של תגובות הסידן של גלומרולי DC ארבע ו-DP אחד L לחומצה פרופיונית מוצגת כאן.

העקבות השחורים מראים את החציון של הדלתא הממוצעת F על F באזור העניין על פני שמונה בעלי חיים, והמשטח האפור מציין את הטווח בין הרבעון הראשון והשלישי של ההתפלגות. מפות החום שלהלן מציגות את התגובות של בעלי החיים הבודדים. קופסאות המג'נטה הירוקות מציינות את המסגרות הממוצעות לחישוב תגובות השיא של הגלומרולי מעל רמות הקרינה הבסיסיות של GCaMP ומוצגות כאן כמותיות.

תיקון להלבנה של המדווח הפלואורסצנטי יכול להשפיע על התגובה. ניתן לתקן נתוני מדגם שיא בלוח השמאלי ללא שינויים גדולים בצורת התגובה. לדוגמה. הנתונים בפאנל הימני מושפעים קשות מתיקון אקונומיקה, ככל הנראה מכיוון שהאות יורד ונשמר מתחת לקו הבסיס לאחר סיום גירוי הריח לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כ-30 דקות.

אם מבוצע כראוי בעת ניסיון הליך זה, חשוב לשמור על האנטנה יבשה לחלוטין אחרת הם לא יוכלו לזהות ריחות. לאחר צפייה בסרטון זה. אתה צריך להיות בעל הבנה טובה כיצד להכין תמונה ולנתח ריח.

לעורר פעילות עצבית בזבוב הפירות.