Name: סידן הדמיה של ריח עוררו התגובות תסיסנית מחושים האונה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: למד כיצד למדוד תגובות סידן מופעלות ריח בלובוס האנטנלי של Drosophila melanogaster באמצעות הדמיה אופטית. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור פעילות נוירונים חוש הריח בזמן אמת ולהבין עיבוד מידע ריחני במוח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מכירים סילקה Sachse וביאטה Eisermann בפיתוח מתודולוגיה זו, פבלו Traversa לשרטוט תוכניות לחסום הרכבה ודניאלה פלץ לשימוש סכמטית באיור 1. אנו מודים סילקה Sachse, פוואן Ramdya ורפאל Rytz על הערות על כתב היד. ר &#39;בל נתמך על ידי קרן Boehringer Ingelheim PhD מלגה. מחקר במעבדה של ר &#39;בנטון ממומן על ידי המועצה האירופית למחקר החל גרנט חוקר עצמאי וקרן השוויצרית הלאומית למדע.

<ol><li>Galizia, C. G., Rossler, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+olfactory+systems+in+insects%3A+anatomy+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Parallel olfactory systems in insects: anatomy and function.</a> Annu. Rev. Entomol. 55, 399-420 (2010).</li>
<li>Vosshall, L. B., Stocker, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Architecture+of+Smell+and+Taste+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular Architecture of Smell and Taste in Drosophila.</a> Annu. Rev. Neurosci. 30, 505-533 (2007).</li>
<li>Wilson, R. I., Mainen, Z. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+events+in+olfactory+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Early events in olfactory processing.</a> Annu. Rev. Neurosci. 29, 163-201 (2006).</li>
<li>Masse, N. Y., Turner, G. C., Jefferis, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+information+processing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Olfactory information processing in Drosophila.</a> Curr. Biol. 19, 700-713 (2009).</li>
<li>Hansson, B. S., Anton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+and+morphology+of+the+antennal+lobe%3A+new+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Function and morphology of the antennal lobe: new developments.</a> Annu. Rev. Entomol. 45, 203-231 (2000).</li>
<li>Galizia, C. G., Joerges, J., Kuttner, A., Faber, T., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semi-in-vivo+preparation+for+optical+recording+of+the+insect+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A semi-in-vivo preparation for optical recording of the insect brain.</a> J. Neurosci. Methods. 76, 61-69 (1997).</li>
<li>Galizia, C. G., Menzel, R., Holldobler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+odor-evoked+glomerular+activity+patterns+in+the+antennal+lobes+of+the+ant+Camponotus+rufipes%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwissenschaften%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of odor-evoked glomerular activity patterns in the antennal lobes of the ant Camponotus rufipes.</a> Naturwissenschaften. 86, 533-537 (1999).</li>
<li>Okada, K., Kanzaki, R., Kawachi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+voltage-sensitive+dye+imaging+of+an+in+vivo+insect+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">High-speed voltage-sensitive dye imaging of an in vivo insect brain.</a> Neurosci. Lett. 209, 197-200 (1996).</li>
<li>Carlsson, M. A., Knusel, P., Verschure, P. F., Hansson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+Ca2%2B+dynamics+of+moth+olfactory+projection+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal Ca2+ dynamics of moth olfactory projection neurones.</a> The European journal of neuroscience. 22, 647-657 (2005).</li>
<li>Galizia, C. G., Vetter, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGalizia%2C+CG+%22Methods+in+Insect+Sensory+Neuroscience+%28Frontiers+in+Neuroscience%29%22">Methods in Insect Sensory Neuroscience (Frontiers in Neuroscience)</a>. Christensen, T. A. 13, CRC Press. 349-392 (2005).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).</li>
<li>Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li>
<li>Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+quantitative+Ca2%2B+measurements+using+improved+cameleons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 2135-2140 (1999).</li>
<li>Martin, J. R., Rogers, K. L., Chagneau, C., Brulet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+of+Ca+signalling+in+the+brain+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging of Ca signalling in the brain of Drosophila.</a> PLoS One. 2, 275-275 (2007).</li>
<li>Murmu, M. S., Stinnakre, J., Martin, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+Ca2%2B+stores+contribute+to+odor-induced+responses+in+Drosophila+olfactory+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons.</a> The Journal of Experimental Biology. 213, 4163-4173 (2010).</li>
<li>Yuste, R., Miller, R. B., Holthoff, K., Zhang, S., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapto-pHluorins%3A+chimeras+between+pH-sensitive+mutants+of+green+fluorescent+protein+and+synaptic+vesicle+membrane+proteins+as+reporters+of+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Synapto-pHluorins: chimeras between pH-sensitive mutants of green fluorescent protein and synaptic vesicle membrane proteins as reporters of neurotransmitter release.</a> Methods Enzymol. 327, 522-546 (2000).</li>
<li>Benton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+and+specificity+in+Drosophila+pheromone+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sensitivity and specificity in Drosophila pheromone perception.</a> Trends Neurosci. 30, 512-519 (2007).</li>
<li>Elliott, D. A., Brand, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GAL4+system+%3A+a+versatile+system+for+the+expression+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The GAL4 system : a versatile system for the expression of genes.</a> Methods Mol. Biol. 420, 79-95 (2008).</li>
<li>Lai, S. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nat. Neurosci. 9, 703-709 (2006).</li>
<li>Yagi, R., Mayer, F., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refined+LexA+transactivators+and+their+use+in+combination+with+the+Drosophila+Gal4+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Refined LexA transactivators and their use in combination with the Drosophila Gal4 system.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16166-16171 (2010).</li>
<li>Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Q+System%3A+A+Repressible+Binary+System+for+Transgene+Expression%2C+Lineage+Tracing%2C+and+Mosaic+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Q System: A Repressible Binary System for Transgene Expression, Lineage Tracing, and Mosaic Analysis.</a> Cell. 141, 536-548 (2010).</li>
<li>Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112, 271-282 (2003).</li>
<li>Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+expressed+cameleon+in+Drosophila+melanogaster+is+used+to+visualize+olfactory+information+in+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetically expressed cameleon in Drosophila melanogaster is used to visualize olfactory information in projection neurons.</a> Curr. Biol. 12, 1877-1884 (2002).</li>
<li>Ng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+olfactory+information+between+three+populations+of+neurons+in+the+antennal+lobe+of+the+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transmission of olfactory information between three populations of neurons in the antennal lobe of the fly.</a> Neuron. 36, 463-474 (2002).</li>
<li>Sachse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+plasticity+in+an+olfactory+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent plasticity in an olfactory circuit.</a> Neuron. 56, 838-850 (2007).</li>
<li>Pelz, D., Roeske, T., Syed, Z., de Bruyne, M., Galizia, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+receptive+range+of+an+olfactory+receptor+in+vivo+%28Drosophila+melanogaster+Or22a%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The molecular receptive range of an olfactory receptor in vivo (Drosophila melanogaster Or22a).</a> J. Neurobiol. 66, 1544-1563 (2006).</li>
<li>Silbering, A. F., Galizia, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+odor+mixtures+in+the+Drosophila+antennal+lobe+reveals+both+global+inhibition+and+glomerulus-specific+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Processing of odor mixtures in the Drosophila antennal lobe reveals both global inhibition and glomerulus-specific interactions.</a> J. Neurosci. 27, 11966-11977 (2007).</li>
<li>Reiff, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+performance+of+genetically+encoded+indicators+of+neural+activity+in+flies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies.</a> J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).</li>
<li>Abuin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+olfactory+ionotropic+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of olfactory ionotropic glutamate receptors.</a> Neuron. 69, 44-60 (2011).</li>
<li>Benton, R., Vannice, K. S., Gomez-Diaz, C., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variant+ionotropic+glutamate+receptors+as+chemosensory+receptors+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Variant ionotropic glutamate receptors as chemosensory receptors in Drosophila.</a> Cell. 136, 149-162 (2009).</li>
<li>Pelz, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Functional+characterization+of+Drosophila+melanogaster+Olfactory+Receptor+Neurons%22">Functional characterization of Drosophila melanogaster Olfactory Receptor Neurons</a>. , Freien Universitat Berlin. (2005).</li>
<li>Ai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid+sensing+by+the+Drosophila+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Acid sensing by the Drosophila olfactory system.</a> Nature. 468, 691-695 (2010).</li>
<li>Martin, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Brain+Imaging%3A+Fluorescence+or+Bioluminescence%2C+Which+to+Choose%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">In Vivo Brain Imaging: Fluorescence or Bioluminescence, Which to Choose?</a> Journal of Neurogenetics. , 1-23 (2008).</li>
<li>Jayaraman, V., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+a+genetically+encoded+optical+sensor+of+neural+activity+using+electrophysiology+in+intact+adult+fruit+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Evaluating a genetically encoded optical sensor of neural activity using electrophysiology in intact adult fruit flies.</a> Front. Neural Circuits. 1, 3-3 (2007).</li>
<li>Pfeiffer, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9715-9720 (2008).</li>
</ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

הכנה וניתוח השיטות שתוארו כאן ניתן להשתמש כדי לנתח ריח עורר הדים בכל אוכלוסייה של נוירונים באונה מחושים (OSNs, LN ו PNS) אשר transgene הנהג המתאים זמין. בעוד אנו מתארים היישום שלה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, דימות אופטי של הכנה זו יכולה באותה מידה להתבצע באמצעות מיקרוסקופ confocal או שני פוטונים 22,32. אכן, אלה הכלים האחרונים להקל על בעיית פיזור האור של מיקרוסקופית שדה רחב, אשר יכולה להפחית את הרזולוציה של תמונות, במיוחד כאשר מספר גדול של נוירונים אקספרס הכתב. הכנה זו בדרך כלל מאפשר הקלטות של ריח עוררו תגובות במשך שעה לפחות 1/2, אבל הפעם יכול להיות משמעותי יותר או קצרה יותר בהתאם למספר ואורך של מדידות שהוקלטו, זמן החשיפה לשמש עבור כל מסגרת ואת מרווח הזמן בין הגירוי. יתר על כן, שני הפוטונים עירור יכול להפחית photobleaching של נציג ניאוןorter, כמו גם phototoxicity הסלולר, על מנת לאפשר מדידה על פני תקופות זמן ארוכות יותר 22,32. לא משנה הבחירה של המיקרוסקופ, תנועה של המוח זבוב בתוך הקפסולה הראש הוא הבעיה חוזרת ביותר כאשר הדמיה בבעלי חיים שלמים. תוך תיקון תנועת יכול לתקן בעיות קטנות (שלב 5.1), זה בדרך כלל טוב יותר רק כדי להקליט את ההכנות מאוד יציבה. אסטרטגיות להפחתת חפצים התנועה כוללות: (i) כמו שצריך להגביל את החדק של זבוב עם עמוד השדרה קקטוס, (ii) משתק את הרגליים של הזבוב על ידי לתקן אותם לשלב עם eicosane (לפני שלב 2.6) (eicosane ניתן נמס ב ~ 37 ° C; להשתמש חוטי כסף כדי להאריך ולשפר את קצה ברזל הלחמה למטרה זו), (iii) מוכנים לעצור הוושט (גלוי בין העצבים מחושים) עם פינצטה בסדר. בנוסף G-CaMP1.6 משמש כאן, מספר גרסאות אופטימיזציה של ה-G-קמפ האינדיקטורים סידן אחרים זמינים,אשר נבדלות ביחס שלהן האות לרעש, הקרינה המחקר ולאחר הדינמיקה הזמני 12,28,33. בחירה מדויקת של חיישן צריך לקחת בחשבון את כל המאפיינים האלה, סוג של הנוירונים כדי להיות מנותח השאלה הביולוגית שפונים. חיישנים הנוכחי לדווח שינויים סידן המתואמים די טוב עם פוטנציאל פעולה 12,34, ו שיפור נוסף שלהם, יחד עם מספר גדל והולך של מנהלי התקנים ספציפיים קווי גנטיים 35 תמשיך לשפר את הפוטנציאל של דימות אופטי של פעילות עצבית לטוס ללא פגע.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> ספק </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> קקטוס עמוד השדרה </td><td> גן מרכז </td><td></td><td> ~ דקה ארוכה 7mm, לא גמישה מדי </td></tr><tr><td> נטף </td><td> חנות כלי מיתר </td><td></td><td></td></tr><tr><td> דו רכיבי סיליקון </td><td> WPI </td><td> KWIK-SIL </td><td></td></tr><tr><td> מותאמים ללקוח, גוש פרספקס גובר </td><td> הזמינות שרטוטים <a href="http://neuro.uni-konstanz.de/jove_mountingblock_blueprint/" target="_blank">http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint /</a> </td><td></td><td></td></tr><tr><td> נחושת רשתות </td><td> אתנה רשתות </td><td> G220-5 </td><td> בדרך כלל משתמשים עבור דגימות במיקרוסקופ אלקטרונים. </td></tr><tr><td> ברגים </td><td> חומרה החנות </TD&gt; <td></td><td> 2 מ&quot;מ קוטר </td></tr><tr><td> פלסטיק coverslips </td><td> Plano-EM </td><td> L4193 </td><td> 22 X 22 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> ברזל טיפים הלחמה </td><td> קונרד אלקטרוניקה </td><td> 830283-62 </td><td></td></tr><tr><td> הכוח הסדיר אספקת </td><td> קונרד אלקטרוניקה </td><td> 511407-62 </td><td></td></tr><tr><td> חוט דק </td><td> Isabellenhütte </td><td> עיסא אוהם </td><td> 0.013 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> Eicosane </td><td> סיגמא </td><td> 21,927-4 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ </td><td> Zeiss </td><td> Axioexaminer D1 </td><td></td></tr><tr><td> מצלמת CCD </td><td> Visitron </td><td> CoolSnap HQ </td><td></td></tr><tr><td> Metafluor </td><td> Visitron </td><td></td><td> רכישת התוכנה </td></tr><tr><td> Monochromator </td><td> Visitron </td><td> Visichrome </td&gt; <td></td></tr><tr><td> שביר להבי </td><td> מדע כלים עדינים </td><td> 10050-00 </td><td></td></tr><tr><td> מחזיק את הלהב </td><td> WPI </td><td> 14134 </td><td></td></tr><tr><td> ספיר להב </td><td> WPI </td><td> 500314 </td><td> פעמיים שולי להב 1mm </td></tr><tr><td> גז משאבות ממברנה </td><td> KNF נויברגר AG </td><td> NMP 830 KVE </td><td></td></tr><tr><td> ספיר בעל להב </td><td> WPI </td><td> 500317 </td><td></td></tr><tr><td> שלוש דרך שסתום </td><td> לי החברה </td><td> LFAA1200118H </td><td> תצורת ה </td></tr><tr><td> Rotameter 500 מ&quot;ל / דקה </td><td> Analyt-MTC </td><td> 112-08SA </td><td></td></tr><tr><td> Rotameter 5 ליטר / דקה </td><td> Analyt-MTC </td><td> 102-08SA </td><td></td></tr><tr><td> דונג </td><td> Siladent Technik </td><td> 209212 </td><td>; </td></tr><tr><td> תאית כרית </td><td> Kettenbach רפואי </td><td> 31003 </td><td></td></tr><tr><td> מלקטת </td><td> Plano-EM </td><td> T5130 </td><td> דומון הביולוגיה # 5 </td></tr><tr><td> מזרקים </td><td> BD </td><td> 300928 </td><td> 2ml, Discardit השנייה, 2pieces </td></tr><tr><td> מחטים </td><td> בראון Sterican </td><td> 4665120 </td><td> OD 1.2 מ&quot;מ </td></tr></tbody></table>

סידן הדמיה של ריח עוררו התגובות תסיסנית מחושים האונה

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

האונה מחושים היא מרכז ההרחה במוח העיקרי חרקים מייצג המקבילה אנטומיים ותפקודיים של הנורה חוש הריח חוליות 1-5. מידע חוש הריח בעולם החיצוני מועבר באונה מחושים על ידי עצב סנסורי (חוש הריח OSNs), אשר לבודד לאזורים שונים של neuropil בשם glomeruli על פי חוש הריח לקולטן ספציפי שהם מבטאים. כאן, OSN אקסונים סינפסה עם שני interneurons המקומיות (LNs), אשר יכול innervate glomeruli תהליכים שונים, ונוירונים הקרנה (PNS), המעבירים מידע חוש הריח כדי גבוהות יותר אזורים במוח חוש הריח. דימות אופטי של פעילות OSNs, LNs ו PNS באונה מחושים - מסורתי באמצעות אינדיקטורים סידן סינתטיים (כגון סידן ירוק, פורעה-2) או רגישים מתח צבעים (למשל RH414) - כבר זמן רב בטכניקה חשוב להבין כיצד חוש הריח הגירויים מיוצגים תבניות במרחב ובזמןפעילות הסינון של מינים רבים של חרקים 6-10. התפתחות גנטית מקודדים כתבים פעילות עצבית, כגון האינדיקטורים סידן ניאון G מחנות 11,12 ו Cameleon 13, מדד סידן bioluminescent GFP-aequorin 14,15, או כתב של הולכה סינפטית, synapto-pHluorin 16 הפכה את מערכת ההרחה של פריזבוב, תסיסנית melanogaster, נגיש במיוחד הדמיה נוירופיזיולוגי, המשלימה נכסים מקיף, המתוארים שלה מולקולרית, אלקטרו ו neuroanatomical 2,4,17. כתבים אלו יכולים לבוא לידי ביטוי באופן סלקטיבי באמצעות בינאריים מערכות בקרה תעתיק (למשל GAL4/UAS 18, לכסה / LexAop 19,20, ש מערכת 21) בקרב אוכלוסיות מוגדרות של נוירונים בתוך המעגלים חוש הריח לנתח עם רזולוציה גבוהה במרחב ובזמן איך ריח עורר פעילות עצבית מיוצג, מווסתת והפך 22-24 &lt;/ Sup&gt;. כאן אנו מתארים את שיטות הכנה וניתוח למדוד ריח עורר הדים באונה תסיסנית מחושים באמצעות G-מחנה 25-27. הכנת בעלי חיים היא פולשנית והוא יכול להיות מותאם דימות באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב הקרינה, confocal ואת שני הפוטונים.

אנו מתארים טכניקה הוקמה כדי למדוד ולנתח ריח עוררו תגובות סידן באונה מחושים חיים<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt;.

האונוס האנטנלי (antennal lobe) הוא מרכז הריח הראשוני במוח של חרקים, והוא מהווה את המקבילה האנטומית והתפקודית של הפלורה האולפקטורית (olfactory bulb) בחוליייים...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא למדוד פעילות פיזיולוגית של נוירונים רייחתיים ב-drosophila ובאונה האנטנלית באמצעות דימיון אופטי של שינויים בריכוז הסידן התוך-תאי. דבר זה מושג תחילה על ידי הרכבת מחזיק התיל של בלוק הקיבוע ומגן האנטנה. לאחר מכן, זבוב המבטא את חיישן הסידן הפלורסצנטי GCaMP מותקן ומקובע לבלוק.לאחר קיבוע הזבוב, מסירים את הקוטיקולה מחלקו העליון של ראש הזבוב כדי לחשוף את אונוני האנטנה. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא הנחת הזבוב תחת המיקרוסקופ וגירויו באמצעות ריח. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות דפוסי פעילות המעוררים על ידי ריח באונוני האנטנה של ה-DLA, באמצעות רישום של שינויים בפלואורסצנציה היחסית של חיישן הסידן G camp.שיטה זו יכולה לסייע בחשיפת האופן שבו ריחות מיוצגים כתבניות מרחביות וזמניות של פעילות עצבית ברמות שונות של מעגלי הריח. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות, כגון אלקטרופיזיולוגיה, הוא היכולת להקליט פעילות של נוירונים שזוהו גנטית ואינם נגישים לאלקטרודות הקלטה. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי העיבוד העצבי של ריחות.ניתן ליישם זאת גם על אזורים אחרים במוח הזבוב, כגון המערכות השמיעתיות והריחניות. ראשית, השחילו את הברגים דרך החלק האחורי של בלוק הקיבוע מפלקסיגלס, כך שהם לא יבלטו מהחלק הקדמי. השתמשו במקדח מדויק כדי ליצור שקע בגבול העליון של התא המעגלי עבור הזבוב, על ידי קידוח מתחת לפני השטח כדי להפחית את עובי הבלוק.תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי (dissecting scope), חתכו רשת נחושת באמצעות סקלפל באופן מאונך וקרוב לתחתית החריץ כדי ליצור צווארון להחזקת הזבוב. ודאו ששתי הלשוניות שנוצרו הןC מישוריות, שכן הדבר יסייע בהחדרת הזבוב. בעזרת קיסם, הניחו טיפה קטנה של דבק מהיר (super glue) על בלוק הקיבוע שמעל התא העגול.עבור הזבוב, הניחו את רשת הנחושת על הדבק ומקמו אותה כך שהחריץ יהיה ממורכז על הבלוק. לחצו בעדינות על הרשת והסירו כל עודף של דבק באמצעות פינצטה. הוסיפו טיפות קטנות של דבק תחת הלשוניות בכל צד וקפלו את הרשת מעל חזית הבלוק כך שהחריץ יפנה ישירות כלפי מטה.ודאו שחלקו העליון של הרשת נמצא בקו אחד עם הבלוק והניחו לו להתייבש לחלוטין. כדי להכין מחזיק חוט, חתכו לכיסוי זכוכית (cover slip) פלסטי למחצית והסירו חלק מרכזי כדי ליצור צורה של U. השתמשו בשעוות דבורים כדי להדביק קטע של חוט לאורך החלק העליון של ה-U, כך שהחוט לא יהיה מתוח מדי.הכינו מגן לאנטנה באמצעות מחורר נייר ליצירת חור בלוחית כיסוי פלסטית. גזרו את קצוות לוחית הכיסוי לממדים של 0.5 על 0.7 סנטימטרים. הדביקו את לוחית הכיסוי הפלסטית המחוררת על סרט דביק, ולאחר מכן טפטפו טיפה של ethanol על הסרט החשוף דרך החור.כדי להסיר את הדבק, הרדימו זבובים בני שבוע עד שלושה שבועות בעלי הגנוטיפ המתאים על ידי קירורם על קרח. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, אחזו בזבוב במפרק הכנף והחליקו אותו, כאשר הצד הגבי פונה כלפי מטה, לאורך רשת הנחושת כך שיהיה תלוי מהצוואר. במידת הצורך, סובבו את הזבוב עד שיהיה פונה כלפי מטה.מקם קוץ קקטוס דק לפני ראש הזבוב כדי למנוע ממנו לברוח, ומקם את הקוץ לפני ה-proboscis כדי למנוע ממנו לזוז. קבע את קוץ הקקטוס לבלוק באמצעות שעוות דבורים, וודא שחלקו העליון של הראש נמצא בקו אחד עם חלקו העליון של הבלוק. קבע את ראש הזבוב לבלוק באמצעות טיפה קטנה של שרף (rosin) המומס ב-ethanol.מקמו את הבלוק בתוך קופסה ללחות והמתינו שהרוזין יתקשה למשך כשעה. בעזרת פינצטה, משכו את לוחית המחוש 앞으로 והנחיתו את מחזיק התיל בתוך הקיפול הקוטיקולרי שבין המחוש לראש. קבעו את המחזיק לחלקו הקדמי של הבלוק באמצעות שעוות דבש נוספת.באמצעות הברגים המובנים בבלוק, דחפו בעדינות את מחזיק התיל קדימה כדי ליצור מרווח בין לוחית האנטנה לראש. מקמו את מגן האנטנה מעל ראשו של זבוב, כך שהמגן ימוקם במרכז. קבעו את המגן לחלקו העליון של בלוק הקיבוע באמצעות שעוות דבורים.באמצעות סכין חיתוך (blade splitter), חוררו חור קטן בסרט הדביק שעל המגן, כך שתחשף הקוטיקולה של ראש הזבוב מאחורי האנטנה. החור לא צריך להתרחב מעבר לעיניים כדי למנוע דליפה של הדגימה. אטמו את החור בין הסרט לקוטיקולה באמצעות סיליקון דו-מרכיבי.הסיר שאריות סיליקון מחלקו העליון של ראש הזבוב. הנח טיפה של תמיסת ריינגר (Ringer saline) לדרזופילה על ראש הזבוב, תוך וידוי שאין דליפות ושהמחושים נשארים יבשים לחלוטין. באמצעות להב ספיר, חרוץ קלות לאורך קיפול הקוטיקולה ישירות מאחורי המחוש.לאחר מכן, גזרו לאורך העיניים ולרוחב ה-selli בגב. לבסוף, קפלו את פיסת הקוטיקולה מעל הקצה החרוץ וגזרו מהצד התחתון. כדי למנוע את חיתוך עצבי האנטנות, הסירו בזהירות את הבלוטות ואת הטרכיא באמצעות פינצטה עדינה.שטפו שוב ושוב בתמיסת רינגר ל-Drosophila, והשאירו טיפה גדולה על הראש. הכניסו רפידת תאית למזרק פלסטיק של 2 מיליליטר באמצעות פינצטה נקייה. בעזרת טיפ של פפיטה עם פילטר, טפטפו 20 µL של חומרי ריח מדוללים.יש לסתום ולכסות את המזרק עד למועד הצילום. מקמו את התושבת המכילה את הזבוב תחת המיקרוסקופ. הורידו את העדשה עד שתיגע בתמיסת הרינגר שעל ראש הזבוב.הביטו דרך העינית תחת תאורה בשדה בהיר (brightfield), ומקמו את הדגימה כך שהחור בקפסולת הראש יהיה במרכז וגבולותיו יהיו במיקוד. עברו לתאורה פלואורסצנטית וכוונו את המיקוד עד שתוכלו לראות את הנוירונים המסומנים, אשר אמורים להיות גלויים הודות לפלואורסצנציה ירוקה בסיסית של GCaMP. רכשו תמונות באמצעות מצלמת CCD המותקנת על המיקרוסקופ בעזרת תוכנת רכישה מתאימה, ומקדו את המבט על הגלומרולי הרלוונטיים.יש לוודא שדיאפרגמת נתיב תאורת ההארה סגורה כדי להגביל את אור העירור לאזור המצולם. מקמו את יציאת האולפקטומטר במרחק של כ-0.5 סנטימטרים לפני מחושי הזבוב. כאן מוצגות האונות האנאליות בזבוב המבטא GCaMP 1.6 תחת בקרת פרומוטור של נוירון חושי ריח המניע ביטוי במספר גלומרולי; גרייה באמצעות 1% propionic acid גורמת לעלייה בفلואורסצנציית GAMP, המעידה על עלייה בסידן התוך-תאי בנוירונים חושיים של הריח העצבניים של הגלומרולי DC four ו-DP one L. הדינמיקה הזמנית של תגובות הסידן של הגלומרולי DC four ו-DP one L ל-propionic acid מוצגת כאן.הקוים השחורים מציגים את החציון של ממוצע ה-delta F over F בתוך אזור העניין (region of interest) בקרב שמונה בעלי חיים, והמשטח האפור מציין את הטווח בין הרבעון הראשון לשלישי של ההתפלגות. מפות החום שמתחת מציגות את התגובות של בעלי חיים בודדים. התיבות במגנטה-ירקרק מציינות את הפריימים ששוקללו כדי לחשב את תגובות השיא של הגלומרולי מעל רמות פלואורסצנציית הבסיס של GCaMP, והן מוצגות כאן כערכים כמותיים.תיקון עבור הבהרה (bleaching) של הרפורטר הפלואורסצנטי עשוי להשפיע על התגובה. ניתן לתקן נתוני שיא של דגימה בפאנל השמאלי ללא שינויים משמעותיים בצורת התגובה. נתוני דגימה בפאנל הימני מושפעים קשות מתיקון ההבהרה, ככל הנראה משום שהאות יורד ונשמר מתחת לקו הבסיס לאחר סיום גירוי הריח. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בכ-30 דקות.במידה ופועלים כראוי בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לשמור על האנטנות יבשות לחלוטין, אחרת הן לא יוכלו לזהות ריחות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן הכנת הדגימה וניתוח הריח.עוררו פעילות עצבית בזבוב הפירות.

calcium-imaging-odor-evoked-responses-drosophila-antennal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

דבורים יכול להיות מותנה פרדיגמה למידה תיאבון חוש הריח (PER מיזוג). באמצעות ריחות כמו גירויים, הקמנו שיטה שבה התנהגות נרשם ובמקביל הדמיה סידן משמשת למדידת פעילות ריח עורר בנוירונים גוף...

בשנת vivo Ca 2 + - הדמיה של נוירונים גוף אינפקטד במהלך הלמידה חוש הריח של דבורת הדבש

סרטון זה מתאר הדמיית סידן in vivo בנוירונים דרוזופילה באמצעות GCaMP. סרטון הפרוטוקול המוצג מראה כיצד לתעד שינויים בפלואורסצנטיות GCaMP מנוירונים בגוף פטריות במהלך ניסוי מיזוג ריח.

דרוזופילה אין ויוו דימות סידן: שיטה לדימות פונקציונלי של פעילות עצבית

סרטון זה מדגים שיטה לזיהוי תגובות נוירונים חושיים בדרוזופילה באמצעות קשירת ליגנדים והדמיה פלואורסצנטית. ליגנדות נקשרות לקולטני נוירונים, וגורמות לזרם סידן. הסידן נקשר למתחמי אינדיקטור, מה שמוביל לפליטת פלואורסצנטיות, המאשרת את התגובה העצבית לליגנד.

זיהוי תגובות פיזיולוגיות מתאי עצב חושיים בדרוזופילה

סרטון זה מדגים שיטה להדמיית סידן in vivo באמצעות חיישני סידן סינפטיים מקומיים בזבובים. הוא מתאר את השלבים להכנת הזבובים למיקרוסקופיה, ביצוע מיזוג חוש הריח, והדמיית זרימת סידן הנגרמת על ידי ריח.

ב Vivo הדמיית סידן באמצעות חיישני סידן סינפטיים מקומיים בדרוזופילה מלנוגסטר

מקור: Ishimoto, H. et. al., הדמיית סידן ex vivo להמחשת תגובות המוח לאיתות אנדוקריני בדרוזופילה. J. Vis. exp. (2018)}{{}}} {{}}} סרטון זה מדגים הדמיית סידן למחקרDrosophila תגובות מוח לנוירופפטידים. נוירונים המבטאים אינדיקטור סידן פלואורסצנטי חושפים דינמיקת סידן תוך תאית ותגובות תפקודיות למולקולות איתות.

הדמיית סידן ex vivo לחקר תגובות המוח של דרוזופילה לנוירופפטידים

הרגליים הקדמיות והפרובוסקיס של דרוזופילה מכילים רפרטואר עשיר של נוירונים חושיים טעמיים. כאן, אנו מציגים שיטה המשתמשת בהדמיית סידן כדי למדוד תגובות פיזיולוגיות מנוירונים חושיים ברגל הקדמית וחוטם של זבובים חיים ביישום אקסוגני של פרומון טעם.

מדידת תגובות פיזיולוגיות של<em&gt; תסיסנית</em&gt; עצב סנסורי כדי ליפידים פרומונים שימוש סידן הדמיה חיה

מאמר זה מתאר פרוטוקול לשעבר vivo להתאמה המאפשר הדמיה Ca 2+ במהלך ההפעלה ביצה תסיסנית.

סידן הדמיה ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; ב ביצת הפעלה

כאן אנו מציגים פרוטוקול שבו ניתן לדמיין את הסידן הטרום ו/או הפוסט-סינפטיות בהקשר של למידה וזיכרון של דרוזוהילה . בשנת הדמיה vivo סידן באמצעות synaptically חיישנים סידן מקומי משולב עם הפרדיגמה הקלאסית מיזוג ריח כגון הפלסטיות הסינפטית הבסיסית בבסיס סוג זה של למידה אסוציאטיבית עשוי להיקבע.

ב-Vivo סידן הדמיה אופטית של למידה הנגרמת הפלסטיות הסינפטית בדרוזופילה מלאנוסטר

גישת הדמיית סידן מאפשרת להקליט תגובות הנגרמות על ידי טעם במוחם של זבובים ערים בזמן שתמיסה מוחלת על התווית. תגובות טעם ראשוניות ב-Drosophila melanogaster משמשות כדוגמה, אך ניתן להתאים פרוטוקול זה לחקר נוירונים במורד הזרם או מינים אחרים.

ב Vivo הדמיית סידן של תגובות עצביות הנגרמות על ידי טעם בדרוזופילה בוגרת

מחסום משמעותי לחקר הפעילות התאית במהלך תהליכים קוגניטיביים כמו למידה וזיכרון הוא השימוש בחומרי הרדמה להכנת הדמיה in vivo . הרדמה פוגעת בזיכרון לטווח קצר ובקוגניציה במספר מודלים, כולל דרוזופילה. מחקר זה מציג שיטה ייחודית להכנת דרוזופילה בוגרת להדמיה in vivo ללא הרדמה.

ב Vivo הדמיה של פעילות עצבית בזבובים בוגרים של דרוזופילה לא מורדמת

אנו מציגים פרוטוקולי הדמיית סידן עבור נוירון ריח של זחל דרוזופילה, באמצעות דבק רקמות מקומי לקיבוע. שיטה זו משפרת את היציבות, ומאפשרת ניסויים אמינים in vivo ו-ex-vivo. סקריפטים מותאמים אישית של R מנתחים אותות סידן, ומספקים פלטפורמה יעילה למחקר נוירופיזיולוגי מפורט.

הדמיית סידן in vivo ו-ex-vivo של נוירון במעגל הריח בזחל Drosophila melanogaster בכוכב השלישי

למד כיצד למדוד תגובות סידן מופעלות ריח בלובוס האנטנלי של Drosophila melanogaster באמצעות הדמיה אופטית. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור פעילות נוירונים חוש הריח בזמן אמת ולהבין עיבוד מידע ריחני במוח.

סידן הדמיה של ריח עוררו התגובות תסיסנית מחושים האונה

גלה סרטונים נוספים