Name: בידוד של תאים חיסוניים פונקציונלית לב (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: למדו שיטה לבידוד תאים חיסוניים פונקציונלית מהלב באמצעות שטיפת מרחב הפריקרד ב-HBSS. השיטה שומרת על תפקוד התאים ומונעת הפעלה בלתי רצויה שלהם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי UNCF-Merck בוגר עבודת מחקר מדעי Fellowship (JLM), הלאומי ללב, ריאות ודם המכון מענקים RO1-HL-62228 (JSJ) ו RO1-HL-073990 (JSJ).

1. הכנת פתרון "הנקס מאזן מלח (HBSS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי 1 כוס כוס L, סיים את 1000 מ"ל גליל, ומערבבים בר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש את אבקת פתרון HBSS את כוס L autoclaved 1 כוס לציון 900 מ"ל עם מים מזוקקים כפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים פתרון HBSS עם 3.4 גרם של מלח Na + Hepes ולהתאים את ה-pH לערך בין 7.35-7.41 שימוש או HCL מרוכז או NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר pH הרצוי שהושגה ונשאר יציב, להוסיף 5 גרם של אלבומין בסרום שור לפתרון בטמפרטורת החדר עד אלבומין הוא נמס לגמרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ"ל של מים מזוקקים אנטיביוטיקה, antimyotic, לפתרון כפולה עד הנפח הכולל עומד בסימן מ"ל 1000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב את הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן הפתרון HBSS ולהפריד אותו לתוך צינורות 50 מ"ל פלקון לשימוש מאוחר יותר. צינורות נוספים אפשר להקפיא ולהשתמש בהם במועד מאוחר יותר. </li></ol> 2. בעלי חיים Preparation - החדרת צינורות לקנה הנשימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מגש עם מכשירים נדרש חומר החדרת צינור לקנה הנשימה (כלומר מלקחיים, מספריים, צינור לקנה הנשימה, 3-0 תפר שחור קלוע, הנשמה חיה קטנה, וכו '). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר עכברוש הוא מורדם לחלוטין עם קוקטייל קטמין / xylazine ביחס של 2 ל קטמין xylazine 1, לגלח את הבטן, החזה, הגרון של החולדה. כדי להבטיח מדינה עמוק הרדמה הושגה, קמצוץ הבוהן של החולדה ולבדוק לנסיגה הדוושה של איבר. ודא עכברוש הוא הרדים עמוק לפני ביצוע כל החתכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את עכברוש עם ראש מורם על קרש חיתוך, כי הוא נוטה על 30 מעלות זווית </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך בעור מהבטן באמצע כדי מתחת ללסת התחתונה. משם לנתח את שרירי המשולש הקדמי של הצוואר כדי לחשוף את קנה הנשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים תפר 3-0 קלוע שחור מתחת לקנה הנשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושים חתך קנה הנשימה בין טבעות סחוסד להכניס את צינור לקנה הנשימה. עניבה תפר חזק כדי לאבטח את צינור לקנה הנשימה על קנה הנשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חברו את צינור לקנה הנשימה כדי הנשמה חיה קטנה. </li></ol> 3. כלי הכנה בידוד תא החיסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מגש עם מכשירים את ההליך תא החיסון בידוד (כלומר מלקחיים, מספריים, HBSS, גזוז רך טפלון 24 מד בקסטר intravascular מעל המחט מהיר קת') </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שני מזרקים 10cc, מילוי במזרק אחד עם HBSS מציגה החיץ לתוך שק קרום הלב ואת מילואים והשני עבור aspirating התאים המכילים HBSS. 3.2.1. מנמיכים את קצה טפלון של 24 מד בקסטר intravascular על (1.6 ס"מ) מהירה קת' על ידי מחט 1 / 2 עד 3 / 4 אורך המקורי עבור ההליך בבידוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמים את כל מזרקים, מאגרים, ואת ריקה 15 מ"ל Tube פלקון (להחזיק את נוזל חילוץ פעם ההליך הסתיים) על קרח. </li></ol> &lt;בכיתה p = "jove_title"&gt; 4. תא החיסון בידוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך קו האמצע של דופן הבטן (לאורך linea alba) עד שתגיע תהליך xiphoid. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מעט רוחבית לתהליך xiphoid, לעשות חתכים דו צדדי דרך כלוב הצלעות המשך בזווית כלפי השחי. להיזהר לא לנקב את הריאות, הלב, או קרום הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חתכים משני צדי החזה הושלמו, משם לנתח את הסרעפת מן הצלעות התחתונות, חיתוך לרוחב המדיאלי. הערה: שימו לב אי פעם של קרום הלב שבו מתחבר הסרעפת ועצם החזה כדי למנוע נזק. השתמש ברצועות falciform כציון דרך לציין היכן קרום הלב מחוברת בצד השני של הסרעפת. כמו כן, אם קרום הלב הוא חתך, היכולת לבודד תאים אבוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם בעדינות צד אחד של בית החזה כדי לחשוף את חלל בית החזה והלב (במארז עדיין קרום הלב).</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את המזרק מלא HBSS ולמצוא טעם שק קרום הלב בערך בחצי הדרך בין עצם החזה ואת הלב (רצוי יותר מקורי מאשר הזנב) והכנס את קצה טפלון של מקוצר מהיר קת' דרך שתי שכבות של קרום הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קטטר נמצא במקום, המשך בעדינות למלא את החלל עם קרום הלב מ"ל 2-3 של החיץ HBBS. אתה יודע מיד אם את הקטטר ממוקם כראוי כאשר אתה מבחין החלל קרום הלב מתרחב. אם אין הוא ממלא עדים, לסגת למקם את מהיר קת'. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר שק קרום הלב מתמלא, לקחת את המזרק השני 10 סמ"ק והמקום טיפ בחזרה קרום הלב ולהתחיל aspirating החיץ. חור הכניסה אותו ניתן להשתמש בו או אחרת ניתן ליצור. ודא קצה לא להתקרב יותר מדי אל קירות שק קרום הלב תוך מתן יניקה, בעיקר על החלק התחתון של הלב. זה יכול להוביל ניקוב שק אובדן קרום הלב ושל תא תא המכילs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד aspirating החיץ, קצה הצנתר ניתן להעביר מסביב על מנת לאסוף חיץ ככל האפשר בתוך שק קרום הלב. </li></ol> הערה: אם בכך אתה קצת לקרוע את קרום הלב ולעשות את החור בחלק העליון של הלב גדול יותר מאשר חור המקורי, אין פאניקה. כל עוד קרום הלב עדיין מקיפה מספיק של הלב אתה עדיין יכול לבצע עוד לשטוף הלב אם כי עם כמות פחותה של המאגר. עבור אוסף של כמות אופטימלית של תאים, 03:57 רוחץ נוספים נדרשים. <ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החיץ חילוץ לתוך צינורות פלקון שהונחו על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הלב, הריאות, ו / או כל רקמה אחרת במידת הצורך למחקרים נוספים. לאחר איסוף של תאים חיסוניים ורקמות אחרות, החולדה צריכה להיות במהירות המתת חסד הומנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את הדוגמאות שנאספו תא החיסון במשך 10 דקות ב 200 גרם ב 4 ° C. שמור תמיד את הצינורות על הקרח כאשר אינו בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו מחדש את גלולה ב 1 מ"ל של הצפת Hyclone או HBSS. </li></ol> הערה: חשוב לספור את מספר תאים חיסוניים המתקבל לב לאחר כל הליך תא החיסון בבידוד. 5. נציג תוצאות: דוגמה מבודדים תאים התורן הלב שהושגו עם הטכניקה הזו מוכתמת toluidine כחול safranin O / alcian כחול מוצגות דמויות 2 א ו -2, בהתאמה. כפי שניתן לראות באיור 3, התורן לב, שמרו על יכולתם שחרור היסטמין לאחר טיפול activators ידוע כגון 48/80 המתחם חומר P כמתואר מורגן et al. 9 פיזור נציג מגרשים מתוך cytometry הזרימה של תאים מסוג CD4 + CD8 + תאים מוצגים נתוני 4 ו -5, בהתאמה. לימפוציטים מסוג T מזוהים נוספים phenotyped כאוכלוסייה התא טכניקה זו. ss = "jove_content"&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3020/3020fig1.jpg"> באיור 1. תרשים זרימה של תהליך הבידוד לב החיסונית התא. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3020/3020fig2.jpg"> . באיור 2 תמונות נציג היסטולוגית של תא הפיטום לב מוכתמות כדלקמן: (א) עם toluidine כחול (B) הם safranin O / alcian כחול. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3020/3020fig3.jpg"> באיור 3. מחקר פונקציונלית של תא הפיטום לב מבודד באזור שריר הלב epicardial ועורר עם 48/80 מתחם (10μg/mL) ו חומר P (10μM). <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3020/3020fig4.jpg"> איור 4. הנציג cytometry זרימה פיזור חלקות CD4 + תאים מבודדים שכותרתו עם חומר P (1:100 dilutיון). <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/3020/3020fig5.jpg"> איור 5. Cytometry זרימה נציג בודד CD8 + תאים עם חומר הנקרא P (1:100 דילול).

<ol><li>Brower, G. L., Chancey, A. L., Thanigaraj, S., Matsubara, B. B., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cause+and+effect+relationship+between+myocardial+mast+cell+number+and+matrix+metalloproteinase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cause and effect relationship between myocardial mast cell number and matrix metalloproteinase activity.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 283, H518-H525 (2002).</li>
<li>Brower, G. L., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacologic+inhibition+of+mast+cell+degranulation+prevents+left+ventricular+remodeling+induced+by+chronic+volume+overload+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiac+Failure%22%5BJournal%5D)">Pharmacologic inhibition of mast cell degranulation prevents left ventricular remodeling induced by chronic volume overload in rats.</a> Journal of Cardiac Failure. 11, 548-556 (2005).</li>
<li>Chancey, A. L., Brower, G. L., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+mast+cell-mediated+activation+of+gelatinase+and+alteration+of+ventricular+diastolic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac mast cell-mediated activation of gelatinase and alteration of ventricular diastolic function.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 282, H2152-H2158 (2002).</li>
<li>Levick, S. P., Gardner, J. D., Holland, M., Hauer-Jensen, M., Janicki, J. S., Brower, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+from+adverse+myocardial+remodeling+secondary+to+chronic+volume+overload+in+mast+cell+deficient+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Protection from adverse myocardial remodeling secondary to chronic volume overload in mast cell deficient rats.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 43, 56-61 (2008).</li>
<li>Levick, S. P., McLarty, J. L., Murray, D. B., Freeman, R. M., Carver, W. E., Brower, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Mast+Cells+Mediate+Left+Ventricular+Fibrosis+in+the+Hypertensive+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Cardiac Mast Cells Mediate Left Ventricular Fibrosis in the Hypertensive Rat.</a> Hypertension. 53, 1041-1047 (2009).</li>
<li>Batista, M. L., Santos, R. V., Cunha, L. M., Mattos, K., Oliveira, E. M., Seelander, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+pro-inflammatory+cytokine+production+and+peritoneal+macrophage+function+in+rats+with+chronic+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Changes in the pro-inflammatory cytokine production and peritoneal macrophage function in rats with chronic heart failure.</a> Cytokine. 34, 284-290 (2006).</li>
<li>Galli, S. J., Tsai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+Cells%3A+Versatile+regulator+of+inflammation%2C+tissue+remodeling%2C+host+defense+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dermatological+Science%22%5BJournal%5D)">Mast Cells: Versatile regulator of inflammation, tissue remodeling, host defense and homeostasis.</a> Journal of Dermatological Science. 49, 7-19 (2008).</li>
<li>Yndestad, A., Holm, A. M., Muller, F., Simonsen, S., Froland, S. S., Gullested, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+expression+of+inflammatory+cytokines+and+activation+markers+in+T-cells+from+patients+with+chronic+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Enhanced expression of inflammatory cytokines and activation markers in T-cells from patients with chronic heart failure.</a> Cardiovasc. Res. 60, 141-146 (2003).</li>
<li>Bozkurt, B., Kribbs, S. B., Clubb, F. J., Michael, L. H., Didenko, V. V., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiologically+Relevant+Concentrations+of+Tumor+Necrosis+Factor-%C9%91+Promote+Progressive+Left+Ventricular+Dysfunction+and+Remodeling+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Pathophysiologically Relevant Concentrations of Tumor Necrosis Factor-ɑ Promote Progressive Left Ventricular Dysfunction and Remodeling in Rats.</a> Circulation. 97, 1382-1391 (1998).</li>
<li>Frangogiannis, N. G., Lindsey, M. L., Michael, L. H., Youker, K. A., Bressler, R. B., Mendoza, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+Cardiac+Mast+Cells+Degranulate+and+Release+Preformed+TNF-%C9%91%2C+Initiating+the+Cytokine+Cascade+in+Experimental+Canine+Myocardial+Ischemia%2FReperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Resident Cardiac Mast Cells Degranulate and Release Preformed TNF-ɑ, Initiating the Cytokine Cascade in Experimental Canine Myocardial Ischemia/Reperfusion.</a> Circulation. 98, 699-710 (1998).</li>
<li>Jobe, L. J., Melendez, G. C., Levick, S. P., Du, Y., Brower, G. L., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-%CE%B1+inhibition+attenuates+adverse+myocardial+remodeling+in+a+rat+model+of+volume+overload%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">TNF-α inhibition attenuates adverse myocardial remodeling in a rat model of volume overload.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, H1462-H1468 (2009).</li>
<li>Forman, M. F., Brower, G. L., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+histamine+secretion+during+isolation+of+rat+cardiac+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+Research%22%5BJournal%5D)">Spontaneous histamine secretion during isolation of rat cardiac mast cells.</a> Inflammation Research. 53, 453-457 (2004).</li>
<li>Levick, S. P., Murray, D. B., Janicki, J. S., Brower, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sympathetic+nervous+system+modulation+of+inflammation+and+remodeling+in+the+hypertensive+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Sympathetic nervous system modulation of inflammation and remodeling in the hypertensive heart.</a> Hypertension. 55, 270-276 (2010).</li>
<li>Morgan, L., Levick, S., Voloshenyuk, T., Murray, D., Forman, M., Brower, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+isolating+functional+mast+cells+from+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+Research%22%5BJournal%5D)">A novel technique for isolating functional mast cells from the heart.</a> Inflammation Research. 57, 241-246 (2008).</li>
</ol>

אין לנו שום דבר לגלות.

<html> שיטה זו של בידוד תאים חיסוניים לב מאפשר ניתוח של תפקידם, פנוטיפ, ובגרות ללא הפעלה לא רצויה, כי בדרך כלל מתרחשת במהלך טכניקה הבידוד המסורתי האנזימטית העיכול. המספר הכולל הממוצע של תאים שהושגו עם טכניקה זו היא בסביבות 400,000 דולר הלב העכברוש, מכתים דיפרנציאלי cytometry ניתוח תזרים של תאים אלה מציין אוכלוסייה מעורבת של לימפוציטים מסוג T (~ 70%), מקרופאגים (~ 12%) עם תא הפיטום השימוש בטכניקה זו. (~ 12%). 13, 14 לכן, שיטות טיהור להפרדה נוספת של לב אוכלוסיות תאים חיסונ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב וציוד </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> מלח מאוזן הנקס &quot; </td><td> סיגמא </td><td> H4891 </td><td> בקבוק אחד עושה 1 ליטר של מלח מאזן &quot;הנקס פתרון. מאזן מלח מחדש הנקס &quot; הפתרון כחלק מן ההליך. </td></tr><tr><td> לאנטיביוטיקה Antimyotic </td><td> Gibco </td><td> 15240-062 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> סיגמא </td><td> H3784 </td><td></td></tr><tr><td> שור סרום אלבומין </td><td> סיגמא </td><td> A3912 </td><td></td></tr><tr><td> בקבוק 250 מ&quot;ל סינון Nalogene </td><td> Thermoscientific </td><td> 157-0020 </td><td></td></tr><tr><td> 12 N-HCL </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> CAS 7647-01-0 </td><td> במשך 6 N, להוסיף כמויות שוות של HCL כדי deionizedהמים. </td></tr><tr><td> 10 N NaOH </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> SC267 </td><td> במשך 5 N, להוסיף כמויות שוות של NaOH למים deionized. </td></tr><tr><td> מים מזוקקים פעמיים </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> טבלה של ציוד ספציפיות: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב וציוד </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> 3-O תפר משי קלועה </td><td> Ethicon מוצרים </td><td> SA64H </td><td></td></tr><tr><td> בעלי חיים קטנים מאוורר </td><td> CWE Incorporated </td><td> SAR-830 </td><td> הגדר קצב הנשימה עד 40.5 נשימות לדקה. </td></tr><tr><td> 18 שפוע מחט מד </td><td> BD Biosciences </td><td> 305199 </td><td> חתוך על ידי מחט 1 / 2 עד 3 / 4 אורך המקורי לשימוש צינור לקנה הנשימה. </td></tr><tr><td> טפלון עצה (עם מחט הסיר) של 24-מד קטטר מהיר קת&#39; בקסטר </td><td> בקסטר </td><td> 2N111 </td><td> מנמיכים את אורך עצה טפלון על ידי 1 / 2 עד 3 / 4. </td></tr><tr><td> 10 סמ&quot;ק מזרק </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 14-823-16B </td><td></td></tr><tr><td> 15 מ&quot;ל פלקון צינורות </td><td> BD Biosciences </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> Sorvall RT6000B בקירור צנטריפוגה </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 75-004-377 </td><td> זכור מראש לצנן ולשמור על 4 ° C. </td></tr><tr><td> Hyclone </td><td> Thermoscientific </td><td> S300030.02 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td> האוסר מדעי </td><td> HS-LB-1483 </td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד של תאים חיסוניים פונקציונלית לב

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

תאים חיסוניים לב צוברים ריבית התפקידים שהם ממלאים שיפוץ הפתולוגי במחלות לב רבים 1-5 אלו תאים חיסוניים, הכוללים תא הפיטום, T-תאים מקרופאגים;. לאחסן ולשחרר מגוון של מתווכים פעילים ביולוגית כולל ציטוקינים פרוטאזות כמו tryptase. 6-8 מתווכים אלה הוכחו להיות שחקני מפתח מטבוליזם תאי מטריקס ידי הפעלת metalloproteinases מטריצה ​​או גרימת הצטברות קולגן על ידי פונקציית ויסות fibroblasts &#39;לב. 9-11 עם זאת, הטכניקות הזמינות עבור לבודד תאים חיסוניים יש לב היה בעייתי כי הם משתמשים collagenase חיידקי לעכל את רקמת שריר הלב. טכניקה זו גורמת להפעלה של תאים חיסוניים, ולכן אובדן תפקוד. לדוגמה, תא הפיטום לב להיות קשוב באופן משמעותי פחות תרכובות הגורמות degranulation. 12 לפיכך, אנו פיתחו שיטה המאפשרת tהבידוד של תפקודי לב תאים חיסוניים אשר יוביל להבנה טובה יותר של התפקיד של תאים אלה במחלת לב הוא. 13, 14 שיטה זו מחייבת היכרות עם המיקום האנטומי של xiphoid השחי של החולדה תהליך, רצועה falciform, ואת קרום הלב של הלב. ציוני דרך אלו חשובים כדי להגדיל את ההצלחה של ההליך כדי להבטיח תשואה גבוהה יותר של תאים חיסוניים לב. תאים אלו מבודדים החיסונית הלב יכול לשמש לאפיון הפנוטיפ של פונקציונליות, בגרות, ושיתוף תרבות ניסויים בתאי לב אחרים כדי להשיג הבנה טובה יותר של האינטראקציות שלהם.

שיטה זו של בידוד תאים חיסוניים פונקציונלי מהלב מספק אלטרנטיבה בשיטות המקובלות של collagenase העיכול, מה שגורם לתא רצויות הפעלת המערכת החיסונית, וכתוצאה מכך תגובה לירידה של תאים אלה. השיטה שלנו של בידוד התשואות תפקודית תאים חיסוניים לב על ידי הימנעות בעיות הקשורות עיכול אנזימטי.

תאי חיסון בלב מעוררים עניין גובר בשל התפקידים שהם ממלאים ברמיodeling פתולוגי במחלות לב רבות.1-5 תאי חיסון אלו, אשר...

המטרה הכללית של הליך זה היא לבודד תאי מערכת חיסון תפקודיים מהלב. הדבר מבוצע תחילה על ידי הנשמה של החולדה וחשיפת שקיק פריקרדיום העוטף את הלב. לאחר מכן, מוזרק תמיסת מלח מאוזנת של הנק (Hank's balance salt solution) או HBSS אל החלל הפריקרדיאלי.לאחר מכן שואבים את ה-HBSS, המכיל כעת תאי חיסון מהחלל הפריקרדיאלי. לבסוף, סופרים את מספר תאי החיסון שהתקבלו בתהליך הבידוד. בסופו של דבר, ניתן לבצע ניסויי דגרנולציה כימית או תרביות משותפות (co-culture), ציטומטריה זרימה, ניתוח אימונופלואורסצנטי או טיפול פרמקולוגי בתאים, כדי להעריך את התפקוד והפעילות הביולוגית של תאי החיסון הלבביים.שלושה אנשים מהמעבדה שלי ידגימו את ההליך הזה: ג'ניפר מקלארטי, סטודנטית לתואר שני, גיזל מלנדז, עמיתת פוסט-דוקטורט, והטכנאי הראשי שלי, ספנסר. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות לבידוד תאי מערכת החיסון, כגון עיכול קולגני, הוא שהיא מונעת הפעלה ופגיעה לא רצויות של תאי מערכת החיסון, והיא משמרת את תגובתיות תאי מערכת החיסון לטיפול ניסויי. לפני התחלת העבודה, הטו קרש חיתוך לזווית של 30 מעלות.לאחר מכן, השתמש בכלי עבודה חשמלי מסוג Dremmel כדי לקטום מחצית עד שלושה רבעים מקצה של מחט זוויתית (bevel needle) בכישור 18. יצירת חוד קצר יותר משמשת להחדרת צינור אנדוטראכאל לאחר שהחולדה הושגחה. כדי להבטיח הרדמה נאותה, גלח את הבטן, החזה והגרון של בעל החיים, ואז בצע חתך עורי מאזור מרכז הבטן ועד מתחת לסנטר.בשלב הבא, בצעו דיסקציה לשרירי המשולש הקדמי של הצוואר כדי לחשוף את הקנה. לאחר החשיפה, מקמו תפר שחור קלוע במידה 3-0 מתחתיו. כעת, בצעו חתך בקנה הנשימה בין הטבעות הסחוסיות והחדירו את צינור הקנה. קשרו את התפר 3-0 בחוזקה סביב הקנה כדי לקבע את צינור הקנה.בשלב הבא, חברו את הפיומיקל הטרכיאלי למנשם לבעלי חיים קטנים והפעילו נשירה. כדי להבטיח חמצון מספיק של הלב והריאות, ודאו עלייה וירידה שוויונית של בית החזה בחולדה במהלך השאיפה והנשיפה של המנשם בהתאמה. לפני תחילת בידוד התאים החסיוניים, מלאו מזרק של 10 cc ב-HBSS.לאחר מכן, גזרו מחצית עד שלושה רבעים מקצה קצה הטפלון הרך של קתטר Baxter intravascular 24 gauge מעל המחט. השתמשו ב-Quick cath כדי ליצור קצה קצר יותר לצורך הליך הבידוד. מקמו את ה-Baxter intravascular 24 gauge מעל המחט.הכנס במהירות את קצה הקטטר למזרק המכיל את ה-HBSS. לאחר מכן, הנח על קרח את המזרק המלא ב-HBSS, את כל התמיסות הבאפר ואنبוב קוני ריק של 50 milliliter. כעת, בצע חתך בקו האמצע של דופן הבטן מה-linear alba ועד ל-xiphoid process.לאחר מכן, החל מהצד לתהליך החרב (xiphoid process), בצעו חתכים דו-צדדיים דרך כלוב הצלעות. המשיכו בזווית לכיוון בית השחי, תוך הקפדה שלא לגרום לקרעים בריאות, בלב או בחוצץ הלב (pericardium). לאחר מכן, הפרדו את הסרעפת מהצלעות התחתונות על ידי חיתוך מהצד כלפי המרכז.בשלב הבא, השתמשו ברצועה המגלגלת (falciform ligament) כנקודת ייחוס לסימון מקום היצמדות פריקרד (pericardium) בצדו השני של הסרעפת. הרימו בעדינות צלע אחת של כלוב הצלעות כדי לחשוף את חלל בית החזה ואת הלב. בצעו ניקור של פריקרד, שאבו את ה-HBSS והתאים, והחזירו את המחט.השימוש במזרקים הוא החלק המורכב ביותר בפרוצדורה. אם קרעתם מעט את הפריקארדיום (pericardium), אין داعג. כל עוד הפריקארדיום מקיף חלק מספיק מהלב כדי ליצור סביבו מעין קערה, עדיין ניתן לבצע שטיפות מעל הלב.בחרו נקודה על פריקרדיום (pericardium) בערך במחצית הדרך בין העצם הסטרנום ללב, רצוי במיקום רוסטרלי יותר מאשר קודאלי, ודחפו את קצה הטפלון של ה-quick cath דרך שתי השכבות של הפריקרדיום. לאחר שהקצה במקומו, מלאו בעדינות את החלל הפריקרדיאלי בשני עד שלושה מיליליטרים של HBSS. כאשר השק מלא, העבירו את הקצה למזרק ריק של 10 cc והחזירו את הקצה אל תוך החלל הפריקרדיאלי.באמצעות אותו חור כניסה, שאבו כמה שיותר מהבופר, תוך הקפדה שהפיפטה לא תתקרב מדי לדפנות של שקיק הפריקרד (pericardial sac) בזמן השאיבה, ובמיוחד בחלק התחתון של הלב. לאחר מכן, העבירו את הבופר למבחנה של 15 מ"ל עם חילוץ הנוזל. תוך שמירת המבחנה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, מלאו ואז רוקנו את שקיק הפריקרד עם שני עד שלושה מ"ל נוספים של HBSS.העברה של HBSS שהושב למבחנה בנפח 15 מיליליטר כשלוש עד ארבע פעמים נוספות. לאחר כל שטיפה, יש להוציא את הלב, הריאות וכל רקמה אחרת הדרושה למחקרים נוספים. יש לשמור על המבחנות על קרח.כאשר אינן בשימוש, סבבו במערכת צנטריפוגה את דגימות התאים החסוניים שנאספו למשך 10 דקות ב-200 ×g. בטמפרטורה של 4 °C, הסירו את העילוי ולאחר מכן השחילו מחדש את המשקע ב-1 mL של HBSS.להלן דוגמאות למחקרים היסטולוגיים לקביעת מורפולוגיה ובשלות של תאים לאחר בידוד תאי חיסון מהלב. תאי מאסט מהלב שצבעו ב-toluidine blue וב-AUM blue ו-seranin O מוצגים משמאל ומימין בהתאמה. כאן מוצגות התוצאות ממחקר תפקודי שבו תאי מאסט מהלב, שבודדו מאזור האפיקרד של הלב, עוברו גירוי באמצעות מפעילים ידועים.תאי המסטים לבביים מבודדים שומרים על היכולת לשחרר היסטמין לאחר טיפול ב-10 micrograms per milliliter של תרכובת 48 80 או ב-10 micromolar של substance P. בשתי הדמויות הבאות מוצגים תרשימי פיזור (Scatterplots) מייצגים מניתוח פלואו-ציטומטרי של תאי מערכת חיסון לבביים מבודדים; בתרשים הפיזור הראשון זוהו תאי T חיוביים ל-CD four בבידוד מהתפוח הלבבי (pericardium). בתרשים הפיזור השני מזוהים תאי T חיוביים ל-CD eight. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור על שלמות התפוח הלבבי בעת הזרקת תמיס הバפר ובעת שאיבת תמיס הבאפר המכיל את התאים החיסוניים, דבר זה יעלה את תנובת התאים המתקבלים.

isolation-of-functional-cardiac-immune-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

ניתן לבודד קרדיומיוציטים בודדים מעכברים פראיים ועכברים מוטנטיים מהלב על מנת לחקור את ההתכווצות שלהם ואת מעברי הסידן שלהם. זה מאפשר לאפיין את התרומה של תפקוד לקוי של התאים לתפקוד לקוי של הלב מכל סיבה שהיא.

בידוד ופיזיולוגי ניתוח של שריר לב העכבר

ידע הנוכחי על הבסיס התאי של מחלות לב בעיקר מסתמך על מחקרים במודלים של בעלי חיים. כאן אנו מתארים ולאמת שיטה חדשה להשיג cardiomyocytes קיימא אחת מדגימות ניתוחיות קטנות של שריר הלב חדרית האנושי. myocytes חדרית האנושי יכול לשמש למחקרי אלקטרו ובדיקות סמים.

בידוד ואפיון פונקציונלי של אדם חדרית שריר לב מדוגמאות כירורגי טריות

ברקמת לב אדם מטפחת אוכלוסיות תאי מבשר perivascular מולטיפוטנטיים שעשויה להיות מתאים התחדשות שריר לב. הטכניקה המתוארת כאן מאפשרת בידוד סימולטני וטיהור שתי אוכלוסיות תאי סטרומה מולטיפוטנטיים קשורות כלי דם מקומיים, כלומר CD146 + CD34 - pericytes ו CD34 + CD146 - תאי adventitial, מן שריר הלב האנושי.

בידוד של אוכלוסיות תאי perivascular מולטיפוטנטיים המבשרים מרקמות אדם לב

פרוטוקול זה מציג שיטה פשוטה ויעילה כדי לבודד, לזהות ולכמת תאים חיסוניים המתגוררים במהלך מצב יציב או דלקת שריר הלב של עכברים. הפרוטוקול משלב עיכול אנזימטי ועל מכניים לדור של השעיה תא בודד מסוגל לנתח עוד יותר על ידי cytometry זרימה.

בידוד וזיהוי של תאים חיסוניים Extravascular של הלב

המטרה הכוללת של מאמר זה היא כדי לתקנן את הפרוטוקול עבור בידוד, אפיון, התמיינות של תאי גזע הלב (CSCs) מהלב העכבר למבוגרים. כאן, אנו מתארים שיטה צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות לבודד CSCs מאתר ושיטות הארוטיות תרבות CSC, התפשטות של בידול לתוך cardiomyocytes.

בידוד, אפיון, התמיינות של תאי גזע הלב מהלב העכבר למבוגרים

על מנת לבודד ולטהר את קרום הלב למחקרים בסיסיים ולחקור את הפוטנציאל הטיפולי של הביולוגיה שלהם.

בידוד וטיהור של קרום הלב של מורלין

מוצג כאן הוא פרוטוקול לבידוד קבוצות מערכות שונות של מקרופאגים ותאים אחרים שאינם חסינים מפני שריר הלב של האדם והעכבר על ידי הכנת תא השעיה יחיד באמצעות עיכול אנזימטי. מערכות המשך הזדהות לצורך זרימה cy, מבוססי זיהוי ואפיון של מקרופאגים מבודדים מוצגים גם.

בידוד של מקרופאג קבוצות מערכות ותאים סטרומה מתוך שריר הלב של האדם והעכבר דגימות

מטרת עבודה זו היא לפתח שיטה לבודד באופן רקרדיומיוקיטים מהלב הבוגר ים למדוד תוכן DNA וגרעין.

בידוד של קרדיומיוציטים מלבבות קבועים עבור אימונוציטוכימיה וניתוח פלוידי

שיטה מתוארת לבידוד בו זמנית של מיוציטים ולא מיוציטים הן מהאטיה והן מחדרי הלב של עכבר בוגר יחיד. פרוטוקול זה מביא לתשואות עקביות של מיוציטים לבביים ברי קיימא מאוד ולא מיוציטים ומפרט תנאי תרבות אופטימליים ספציפיים לתאים עבור פנוטיפים וניתוח במבחנה.

בידוד ותרבות בו זמנית של מיוציטים פרך, מיוציטים חדריים, ולא מיוציטים מלב עכבר בוגר

הפרוטוקול המוצג כאן מספק גישה שלב אחר שלב לבידוד מקרופאגים תושבי לב מאזור הצומת הסינואטרלי (SAN) והצומת האטריובנטריקולרי (AVN) של לבבות העכברים.

בידוד ותרבות של מקרופאגים לבביים תושבים מהצומת הסינואטריאלית והאטריובנטריקולרית של מורין

כאן אנו מדווחים על פרוטוקול לכימות והתמיינות של לימפוציטים B שריר הלב בהתבסס על מיקומם בחלל התוך-וסקולרי או האנדותל באמצעות ציטומטריה של זרימה.

כימות וניתוח מבוססי ציטומטריה של זרימה של תאי B שריר הלב

למדו שיטה לבידוד תאים חיסוניים פונקציונלית מהלב באמצעות שטיפת מרחב הפריקרד ב-HBSS. השיטה שומרת על תפקוד התאים ומונעת הפעלה בלתי רצויה שלהם.

בידוד של תאים חיסוניים פונקציונלית לב

גלה סרטונים נוספים