מודל הקרנית Porcine Ex vivo של קרטיטיס חיידקית: טכניקה ליצירת זיהום חיידקי בתאי אפיתל בקרנית

בעין החולייתנים, הקרנית - כיסוי המגן החיצוני ביותר - נגועה ב- Pseudomonas aeruginosa, וכתוצאה מכך מצב דלקתי בקרנית - קרטיטיס.

כדי לבסס מודל של קרטיטיס בקרנית ex vivo, הנח כפתור קורנאוסקלרלי של עין חזיר בצלחת פטרי. קטע רקמה זה מורכב מהקרנית המוקפת בשרידי סקלרה - כיסוי העיניים הסיבי. השלימו את צלחת הפטרי בחומר המכיל אנטיביוטיקה כדי לחסל חיידקים מזהמים מפני השטח של האפיתל בקרנית.

אתר את החלק המרכזי של הקרנית. בצע חתכים אופקיים ואנכיים שטחיים בתבנית הרצויה החודרים את שכבת האפיתל החיצונית ביותר של הקרנית. מעבירים את הרקמה החתוכה, כשהקרנית כלפי מטה, לתבנית חלולה מיוחדת.

מלאו את חלל הקרנית באגר נוזלי והניחו להתמצקות, ורסנו את הרקמה בתוך התבנית. הפוך את התבנית כדי לחשוף את המשטח הפצוע של אפיתל הקרנית. פיפטה את מתלה הפסאודומונס לתוך האזורים החתוכים של הקרנית. כסו את התבנית במצע גידול נוסף לצמיחת חיידקים אופטימלית. משלימים את מנת התרבות במדיה ומדגרים.

חיידקים חוצים את חתך האפיתל כדי לפלוש לסטרומה. בתוך הסטרומה, חיידקים גורמים לחדירת תאי חיסון, חלבונים ונוזלים בקרנית וכתוצאה מכך תגובה דלקתית. הצטברות הנוזלים מגבירה את אטימות הקרנית, ומאשרת קרטיטיס חיידקית.

מוציאים את המדיה מצלחת הפטרי, ושוטפים את הקרניות פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS סטרילי. החזיקו את הקרנית בעזרת מלקחיים וסחטו בעדינות. השתמש באזמל 10A כדי לבצע ארבעה חתכים - שניים אנכיים, שניים אופקיים - בחלק המרכזי של כפתור הקורנאוסקלר דרך שכבת האפיתל לסטרומה הבסיסית.

מניחים תבנית זכוכית סטרילית בצלחת של שש בארות כשהחלק הרחב כלפי מעלה. לאחר מכן, הניחו את הקרנית באמצע תבנית הזכוכית, כשצד האפיתל פונה כלפי מטה, והחלק הפצוע של הקרנית מרוכז בתבנית הזכוכית.

מלאו את תבנית הזכוכית לחלוטין על ידי הוספת מיליליטר אחד של תמיסת אגר. לאחר שאפשרו לאגר להתייצב, הפכו את תבנית הזכוכית כך שאפיתל הקרנית פונה כלפי מעלה.

יש לאטום את תבנית הזכוכית עם אגר עד אפס מקום כדי למנוע דליפה של החיסון או תמיסת התרופה.

פיפטה 200 מיקרוליטר של תרבית החיידקים ישירות לאזור חתוך. כמו כן, עבור כל ניסוי, הגדירו בקרה על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של PBS סטרילי לקרנית אחת, במקום להוסיף את תרבית החיידקים.

לאחר מכן, הוסף 185 מיקרוליטר PBS לחלק העליון של כל קרנית כדי לשמור על לחות האפיתל. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של DMEM ללא אנטיביוטיקה לתחתית כל באר. דגרו את הצלחת בעלת שש הבארות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם לחות ו-5% פחמן דו חמצני, עד 24 שעות.

השליכו את ה-DMEM מהצלחת בעלת שש הבארות והוסיפו מיליליטר אחד של PBS סטרילי לכל באר כדי לשטוף אותה. הסר את ה-PBS בעדינות, מבלי לגעת בחלק המרכזי של כפתור הקורנאו-סקלרלי. הסר את תבנית הזכוכית בעזרת מלקחיים סטריליים, והנח אותה ב-5% דיסטל. שטפו בעדינות את החלק העליון של כפתור הקורנאוסקלר פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS.

השתמש במלקחיים עדינים כדי להרים את קצה הכפתור הקורנאוסקלרי, נתק אותו מהאגר שמתחתיו והעביר אותו לצינור של 50 מיליליטר מלא במיליליטר אחד עד שניים של PBS קר כקרח. כדי לסייע בניתוק חיידקים מאפיתל הקרנית ומאזור החיתוך, הוסף PBS לצינור והשתמש בהומוגנייזר בעל קצה דק כדי לגזור את החלק העליון של הקרנית הנגועה. הרקמה לא חייבת להיות מחוסלת לחלוטין.

מערבולת להשעיית חיידקים מיושבים, והוספת 20 מיקרוליטר מהקרנית ההומוגנית ל -180 מיקרוליטר PBS. לאחר מכן, בצע דילולים סדרתיים של ההומוגנאט בצלחת של 96 בארות.

פיפטה 10 מיקרוליטר של ההומוגנאט המדולל על צלחת אגר דם.

לאחר דגירה של הצלחת למשך 16 שעות, ספרו את מספר היחידות היוצרות מושבה.