אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
ביולוגיה
0 צפיות • 4:35 דק׳ • July 8th, 2025
הסימפונות הם דרכי הנשימה הצינוריות של הריאות. במהלך זיהום כרוני, הסימפונות נסתמים עקב הצטברות ריר. הריר העשיר בחומרים מזינים מספק סביבה מתאימה לצמיחת חיידקים אופורטוניסטיים. חיידקים אלה מוטמעים במטריצה פולימרית חוץ-תאית המיוצרת בעצמה ומתרבים ליצירת ביופילם.
כדי לחקות התפתחות ביופילם של חיידקים על הריאות, קחו דגימת רקמת סימפונות חזיר בצלחת פטרי. מנתחים את הרקמה לחתיכות בצורה הרצויה. הוסף מצע תרבית ביופילם לצלחת הפטרי. עקר את הכלי באור UV כדי להסיר מזהמים על פני השטח.
העבירו את חלקי הרקמה המעוקרים לצלחת מרובת בארות המכילה אמצעי תרבית ביופילם ורפידות אגרוז, המשמשות כמצע אופטימלי להדבקת חיידקים. לאחר מכן, דוקרים קצה מחט המכיל מושבה של החיידקים הרצויים על כל פיסת רקמה כדי להכניס חיידקים פלנקטוניים לרקמה. אטום את הצלחת עם קרום נקבובי מעוקר UV המקל על חילופי חמצן אחידים בכל משטח הצלחת. דגרו את הצלחת האטומה.
במהלך הדגירה, חיידקים נצמדים באופן בלתי הפיך לפני השטח של האפיתל דרך פילי ומתחילים להפריש את המטריצה החוץ-תאית. בתוך המטריצה, חיידקים מנצלים את מקורות האנרגיה, המוצין וה-DNA החופשי מאמצעי התרבית ליצירת ביופילמים. מודל הביופילם החיידקי מוכן לבדיקות נוספות.
מניחים את הסימפונות בכביסה הראשונה של DMEM/RPMI 1640. השאירו אותו בכביסה, וקצרו חלקים נוספים של סימפונות מאותה ריאה כדי להניב מספיק חלקי רקמה לניסוי המתוכנן. הכניסו לכביסה את כל חלקי הסימפונות הנוספים מאותה ריאה, והשאירו אותם בכביסה למשך שתי דקות לפחות.
מוציאים את הסימפונות מהכביסה הראשונה ומניחים את הדגימות בצלחת פטרי סטרילית. בקלילות, החזיקו כל סימפונות במלקחיים סטריליים, והקפידו לא לפגוע ברקמה. הסר כמה שיותר רקמות רכות שנותרו, וחתוך את הרקמה לרצועות ברוחב חמישה מילימטרים בעזרת מספריים לדיסקציה סטרילית.
הנח את כל רצועות רקמת הסימפונות בכביסה השנייה של DMEM/RPMI 1640. השאירו אותם בכביסה לפחות שתי דקות. לאחר מכן, הסר את רצועות הטישו מהכביסה השנייה באמצעות מלקחיים סטריליים, והניח אותן בצלחת פטרי נקייה וסטרילית. הסר את כל הרקמות הרכות שנותרו המחוברות לסימפונות, וחתוך את הרצועות לריבועים בעזרת מספריים לדיסקציה סטרילית.
מוסיפים את השטיפה השלישית DMEM/RPMI 1640 לתוך צלחת הפטרי, ומערבבים קלות את חתיכות הטישו בכביסה על ידי סיבוב המנה. יוצקים את השטיפה השלישית מצלחת הפטרי מבלי להסיר את חתיכות הרקמה.
לאחר מכן, הוסף את שטיפת ה-SCFM הסופית, וודא שכל חלקי הרקמה מכוסים. עקר את הרקמה ב-SCFM תחת אור UV למשך חמש דקות. השתמש במלקחיים סטריליים כדי להעביר כל חתיכת רקמת סימפונות מעוקרת לבארות בודדות של צלחת בת 24 בארות המכילה רפידות אגרוז SCFM.
כדי להדביק כל פיסת רקמה בזן החיידקים הרצוי, געו במושבה שגדלה על צלחת אגר עם קצה מחט בגודל 29 המחוברת למזרק אינסולין סטרילי של 0.5 מיליליטר. לאחר מכן, געו במושבה על פיסת הרקמה, ודקרו בעדינות את פני השטח. עבור הפקדים הלא נגועים, דוקרים בעדינות את פני חתיכת הרקמה עם קצה המחט.
לאחר מכן, השתמש בפיפטה כדי להוסיף 500 מיקרוליטר SCFM לכל באר. עקר קרום איטום נושם לכל צלחת של 24 בארות באור אולטרה סגול למשך 10 דקות. הסר את המכסה מצלחת 24 הבארות, והחלף אותו בקרום הנושם. לאחר מכן, דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מבלי לרעוד.