All-in-One CRISPR Genome Editing: שיטה להומולוגיה של גנים מבוססי תיקון בתאים בתרבית באמצעות מערכת CRISPR-Cas9
אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 5:12 דק׳ • July 8th, 2025
התחל בהוספת פלסמיד CRISPR הכל באחד לתאי חיסון הנמצאים בצינור. פלסמיד זה מכיל גן Cas9 בשילוב עם רצף קידוד sgRNA או RNA חד-מוביל, המשלים לרצף המטרה בגנום המארח.
הוסף פלסמיד תורם ליניארי המכיל טרנסגן דחוס בין זרועות הומולוגיה או HAs - ה-DNA חוזר על עצמו הדרוש לרקומבינציה הומולוגית. בצע אלקטרופורציה, המשתמשת בזרם חשמלי כדי להזריק את תערובת הפלסמיד לתא. ברגע שנכנס פנימה, ה-sgRNA המעובד יוצר קומפלקס עם נוקלאז Cas9 המבוטא.
ה-sgRNA קושר את אתר המטרה, ומאפשר לנוקלאז Cas9 לזהות את רצף הזיהוי הספציפי המכונה מוטיב סמוך לפרוטוספייסר או PAM, ולבקע את ה-DNA המארח בקרבתו. זה יוצר שבר דו-גדילי קהה שבו המנגנון התאי חותך את ה-DNA, ויוצר תלייה של 3 אינץ'. נוכחותם של אתרי אגף HA מפעילה את מנגנון התיקון המכוון הומולוגיה שבו ה- DNA החתוך מצטרף לרצף ה- HA, ויוצר מבנה הטרודופלקס - לולאת D.
סינתזת ה-DNA נמשכת, ויוצרת גדיל משלים לרצף הטרנסגנים עד שהוא מצטרף מחדש לגדיל ה-DNA המקורי. החלק העליון של לולאת ה-D משמש כתבנית לסינתזה של החלק החסר של ה-DNA, ויוצר את צומתי הולידיי הכפולים - מבנים שבהם ארבעה גדילי DNA מתקשרים. צמתים אלה נפתרים והפערים מתקנים, מה שמקל על החדרת גן המטרה.
הכינו צלחת של 24 בארות המכילה 500 מיקרוליטר של מצע גידול שלם ללא אנטיביוטיקה בכל באר. מחממים מראש את הצלחת בחממת פחמן דו חמצני לחה 37 מ
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים