אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 5:12 דק׳ • July 8th, 2025
התחל בהוספת פלסמיד CRISPR הכל באחד לתאי חיסון הנמצאים בצינור. פלסמיד זה מכיל גן Cas9 בשילוב עם רצף קידוד sgRNA או RNA חד-מוביל, המשלים לרצף המטרה בגנום המארח.
הוסף פלסמיד תורם ליניארי המכיל טרנסגן דחוס בין זרועות הומולוגיה או HAs - ה-DNA חוזר על עצמו הדרוש לרקומבינציה הומולוגית. בצע אלקטרופורציה, המשתמשת בזרם חשמלי כדי להזריק את תערובת הפלסמיד לתא. ברגע שנכנס פנימה, ה-sgRNA המעובד יוצר קומפלקס עם נוקלאז Cas9 המבוטא.
ה-sgRNA קושר את אתר המטרה, ומאפשר לנוקלאז Cas9 לזהות את רצף הזיהוי הספציפי המכונה מוטיב סמוך לפרוטוספייסר או PAM, ולבקע את ה-DNA המארח בקרבתו. זה יוצר שבר דו-גדילי קהה שבו המנגנון התאי חותך את ה-DNA, ויוצר תלייה של 3 אינץ'. נוכחותם של אתרי אגף HA מפעילה את מנגנון התיקון המכוון הומולוגיה שבו ה- DNA החתוך מצטרף לרצף ה- HA, ויוצר מבנה הטרודופלקס - לולאת D.
סינתזת ה-DNA נמשכת, ויוצרת גדיל משלים לרצף הטרנסגנים עד שהוא מצטרף מחדש לגדיל ה-DNA המקורי. החלק העליון של לולאת ה-D משמש כתבנית לסינתזה של החלק החסר של ה-DNA, ויוצר את צומתי הולידיי הכפולים - מבנים שבהם ארבעה גדילי DNA מתקשרים. צמתים אלה נפתרים והפערים מתקנים, מה שמקל על החדרת גן המטרה.
הכינו צלחת של 24 בארות המכילה 500 מיקרוליטר של מצע גידול שלם ללא אנטיביוטיקה בכל באר. מחממים מראש את הצלחת בחממת פחמן דו חמצני לחה 37 מעלות 5%. הפעל את מערכת האלקטרופורציה. קלט פרמטרים של אלקטרופורציה עבור תאי JURKAT או RAW.
הכן תערובת תאים-DNA לאלקטרופורציה. אוספים תרבית תאי JURKAT בבקבוק של 25 סנטימטר מרובע. העבירו תאים לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל. לאחר מכן, גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 90 x גרם למשך שמונה דקות בטמפרטורת החדר.
באשר לסופרנטנטים, לשטיפה, השעו מחדש את התאים עם DPBS של 5 מ"ל. לאחר מכן, סובב את תרחיף התא על ידי צנטריפוגה, תוך שימוש באותו מצב כמו השלב הקודם. הסר את ה-DPBS והשהה מחדש את גלולת התא באמצעות 2 מ"ל של DPBS. השתמש ב-10 מיקרוליטר של תרחיף תאים, וערבב בנפח שווה של 0.2% טריפאן כחול.
כדי להעריך את ספירת התאים, טען דגימה בשקופית ספירה זו. הכנס שקופית ספירה במונה התאים האוטומטי, והצג את תמונת התאים, ולאחר מכן, קבל תוצאת ספירת תאים. חשב 2 מיליון תאים עבור 5 חזרות של אלקטרופורציה, לכל ניסוי דפיקה.
העבירו את מספר התאים הנדרש לצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל. תאי גלולה על ידי צנטריפוגה. כדי לחסוך זמן, ניתן להכין תערובת אלקטרופורציה בשלב הצנטריפוגה. הוסף 2.5 מיקרוגרם מכל וקטור CRISPR-Cas9, 2.4 מיקרוגרם של וקטור מטרה ליניארי, והשעיה מחדש של Buffer R, לנפח כולל של 55 מיקרוליטר, בצינור צנטריפוגה חדש של 1.5 מ"ל.
מערבולת עדינה, ומסובבים קצרות כדי לערבב היטב. השאירו את תערובת האלקטרופורציה בטמפרטורת החדר לפני השימוש. לאחר הסיבוב, שאפו את ה-DPBS, ולאחר מכן, צנטריפוגה למשך 30 שניות נוספות. הסר כמה שיותר סופרנטנט. השעו מחדש תאים על ידי הוספת תערובת האלקטרופורציה המוכנה. פיפטה למעלה ולמטה בעדינות.
אלקטרופורציה: באשר לתערובת האלקטרופורציה של התאים, השתמש בקצה נוקלאופקציה של 10 מיקרוליטר עם פיפטה.
חשוב: הימנע מבועות אוויר במהלך פיפטה, זה יגרום לכשל באלקטרופורציה. לחץ על "התחל".
לאחר אלקטרופורציה, העבירו את הדגימה לבאר אחת של צלחות 24 בארות עם מצע גידול מחומם מראש. בצע את אותם הליכי אלקטרופורציה כמו לעיל, על 4 הדגימות הנותרות. נדנד בעדינות את הצלחת כדי להבטיח פיזור אחיד של התאים. דגרו את התאים באינקובטור של 37 מעלות במשך 48 עד 72 שעות לפני מיון תאי FACS.