phiC31-Integrase-Mediated Site-Directed Transgene Integration: טכניקת מיקרו-הזרקה לשילוב טרנסגנים ספציפיים לאתר לווקטור אנופלס

phiC31 integrase הוא אנזים רקומבינאז שמקורו בפאג'ים המזרז את הרקומבינציה הספציפית לאתר של טרנסגן, גן זר, לגנום מארח. לשילוב טרנסגנים במארח אנופלס, התחל עם עובר אנופלס במאגר מתאים.

הגנום של אנופלס מהונדס מראש עם אתר חיבור לשילוב גנים וסמן ציאן-פלואורסצנטי לברירה חזותית. לאחר מכן, הוסף לבקבוקון נפח קטן של פלסמיד תורם הנושא את מטען הטרנסגנים הרצוי, אתר התקשרות, סמן פלואורסצנטי אדום ורכיבי עמוד שדרה של פלסמיד. לאחר מכן, הוסף נפח אופטימלי של פלסמיד עוזר הנושא אינטגראז מקודד גנים. כעת, טען את תערובת הפלסמיד למיקרו-מזרק.

הזרקו בעדינות את הפלסמידים לקוטב האחורי של העובר, אתר המוצא של תאי הנבט, וכתוצאה מכך תנועה קלה של הציטופלזמה. ברגע שנכנס לעובר, הפלסמיד המסייע מתחיל לסנתז אנזימי אינטגראז.

אנזים האינטגראז מתווך רקומבינציה ספציפית לאתר בין הפלסמיד התורם לגנום המארח. לפיכך, הטרנסגן והסמן הפלואורסצנטי האדום מפלסמיד התורם משתלבים באתרי ההתקשרות הרקומביננטיים בגנום האנופלס. לאחר מכן, יש לדגור על העובר המוזרק בתנאים פיזיולוגיים לבקיעה, עם מערבולת לסירוגין.

תוך ימים ספורים, העובר בוקע לזחל. תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, זחל האנופלס עם גנים משולבים בהצלחה מבטא הן פלואורסצנטיות ציאן, המסמנת את הגנום המארח, והן פלואורסצנטיות אדומה, המסמנת את הטרנסגן מפלסמיד התורם.

טהר פלסמידים של תורמים ועוזרים באמצעות ערכת טיהור נטולת אנדוטוקסין. שלב את פלסמיד התורם המתויג attB הנושא את הטרנסגן המעניין, ואת הפלסמיד המסייע הנושא את האינטגראז, כדי לקבל תערובת עם ריכוז סופי של 350 ננוגרם למיקרוליטר של הפלסמיד התורם, ו-150 ננוגרם למיקרוליטר של הפלסמיד המסייע.

זרז את ה-DNA על ידי הוספת 0.1 נפח של 3 נתרן אצטט מולארי, ב-2.5 נפחים של 100% אתנול קר כקרח. ואז, מערבולת. משקעים לבנים צריכים להיות גלויים מיד. שטפו את הגלולה, והשעו אותה מחדש במאגר הזרקה, כדי להגיע לריכוז סופי כולל של 500 ננוגרם למיקרוליטר. לאחר מכן, הכינו מכסים של 10 עד 15 מיקרוליטר כל אחד, ואחסנו אותם בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס.

דם מאכיל יתושים בני 4 עד 7 ימים מקו העגינה הרצוי, ועמיתיהם מסוג הבר, 72 שעות לפני המיקרו-הזרקה. בצע מיקרו-הזרקות לעובר אנופלס גמביה, בנתרן כלורי של 25 מילי-מולרי, על ידי התמקדות בקוטב האחורי של העובר בזווית של 45 מעלות.

בצע מיקרו-הזרקות עובר אנופלס סטפנסי, בשמן הלוקרבון, על ידי התמקדות בקוטב האחורי בזווית של 30 מעלות. מיד לאחר ההזרקה מעבירים את הביצים לצלחת פטרי מלאה במים מזוקקים סטריליים, ומחזירים אותן לתנאי חרקים. עם הבקיעה, העבירו זחלי G₀ למגש עם מים מזוקקים מומלחים מדי יום, וחזרו לגלמים.