אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 4:21 דק׳ • July 8th, 2025
phiC31 integrase הוא אנזים רקומבינאז שמקורו בפאג'ים המזרז את הרקומבינציה הספציפית לאתר של טרנסגן, גן זר, לגנום מארח. לשילוב טרנסגנים במארח אנופלס, התחל עם עובר אנופלס במאגר מתאים.
הגנום של אנופלס מהונדס מראש עם אתר חיבור לשילוב גנים וסמן ציאן-פלואורסצנטי לברירה חזותית. לאחר מכן, הוסף לבקבוקון נפח קטן של פלסמיד תורם הנושא את מטען הטרנסגנים הרצוי, אתר התקשרות, סמן פלואורסצנטי אדום ורכיבי עמוד שדרה של פלסמיד. לאחר מכן, הוסף נפח אופטימלי של פלסמיד עוזר הנושא אינטגראז מקודד גנים. כעת, טען את תערובת הפלסמיד למיקרו-מזרק.
הזרקו בעדינות את הפלסמידים לקוטב האחורי של העובר, אתר המוצא של תאי הנבט, וכתוצאה מכך תנועה קלה של הציטופלזמה. ברגע שנכנס לעובר, הפלסמיד המסייע מתחיל לסנתז אנזימי אינטגראז.
אנזים האינטגראז מתווך רקומבינציה ספציפית לאתר בין הפלסמיד התורם לגנום המארח. לפיכך, הטרנסגן והסמן הפלואורסצנטי האדום מפלסמיד התורם משתלבים באתרי ההתקשרות הרקומביננטיים בגנום האנופלס. לאחר מכן, יש לדגור על העובר המוזרק בתנאים פיזיולוגיים לבקיעה, עם מערבולת לסירוגין.
תוך ימים ספורים, העובר בוקע לזחל. תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, זחל האנופלס עם גנים משולבים בהצלחה מבטא הן פלואורסצנטיות ציאן, המסמנת את הגנום המארח, והן פלואורסצנטיות אדומה, המסמנת את הטרנסגן מפלסמיד התורם.
טהר פלסמידים של תורמים ועוזרים באמצעו
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים