השתקת גנים מבוססת הפרעות CRISPR: טכניקה לדיכוי ממוקד של תפקוד גנים בלפטוספירה פתוגנית

הפרעות CRISPR או CRISPRi, משתמשות בגרסה מושבתת של Cas9, dCas9, להשתקת גנים ממוקדת, המדכאת את תפקוד הגנים.

כדי לבצע CRISPRi, השתמש במבנה וקטור מעבורת - פלסמיד המכיל מקורות שכפול המתאימים הן לחיידקי E. coli והן לחיידקי Leptospira, מה שמקל על התפשטות בשני המינים.

הווקטור מכיל גם רצף ספציפי לגן dCas9 ו-RNA או sgRNA מדריך יחיד, לזיהוי רצף המטרה.

בתחילה, וקטור המעבורת קיים בתוך התורם E. coli. השלימו את תרבית התורם E. coli עם הפונדקאי Leptospira כדי להקל על ההצמדה. צימוד יוצר מגע ישיר בין תא לתא בין אורגניזמים, ומקל על ספיגת פלסמיד מעבורת על ידי לפטוספירה. בתוך התא, מבנה הפלסמיד מייצר רצפי sgRNA ומבטא חלבוני dCas9.

ה-sgRNA מכיל אזור פרוטוספייסר המזהה את אזור המטרה המשלים שלו ב-DNA של לפטוספירה, קרוב למוטיב הסמוך לפרוטוספייסר או PAM - רצף זיהוי קצר על ה-DNA המארח. זה עוזר ל-dCas9 ליצור קומפלקס עם ה-sgRNA באתר היעד במורד הזרם לאתר תחילת שעתוק הגנים.

ל-dCas9 מקומפלקס sgRNA-dCas9 אין את הפעילות הקטליטית לבקע גדילי DNA, במקום זאת, הוא פועל כמחסום פיזי לתנועת אנזים RNA פולימראז היוצר mRNA, ובסופו של דבר מעכב את שעתוק הגנים. השתמש בלפטוספירה מושתקת גנטית לבדיקות נוספות.

לצורך צימוד, תאי לפטוספירה גדלים בטמפרטורה של 29 או 37 מעלות צלזיוס במדיה HAN. יום אחד לפני ההצמדה, תאי E. coli התורמים גדלים ב