אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 3:12 דק׳ • July 8th, 2025
התחל עם מודל עכבר מהונדס גנטית המורכב מגנום שונה המכיל אתרי LoxP - רצפים ספציפיים המזוהים על ידי אנזימי Cre-recombinase - המאגפים את הגן המעניין. העכבר עובר טרנספטציה נוספת עם וקטור פלסמיד המקודד רקומבינאז CreER ספציפי לאיבר, מה שמוביל לשילוב של אלמנט המבטא CreER רקומבינאז בגנום של תאי כבד.
ה-CreER recombinase, חלבון היתוך לא פעיל הכולל Cre recombinase ותחום קשירת הליגנד המוטנטי של קולטן האסטרוגן, ER, מקיים אינטראקציה ונקשר לחלבון הלם חום בציטופלזמה. קשירה זו מגבילה את CreER רקומבינאז בציטופלזמה.
הכינו תמיסה של טמוקסיפן, תרופה הידרופובית, באמצעות אתנול ושמן מתאים. כעת, הזריק את תמיסת הטמוקסיפן תוך צפקית לרבע התחתון השמאלי של בטן העכבר כדי למנוע נזק לאיברי הבטן.
הטמוקסיפן המוזרק עובר חילוף חומרים בכבד ל-4-הידרוקסיטאמוקסיפן ו-4-OHT. יתר על כן, 4-OHT, מודולטור קולטן אסטרוגן סלקטיבי, נקשר לתחום הקישור של ליגנד ER של CreER רקומבינאז, וגורם לשינוי הקונפורמציה שלו. זה מוביל לשחרור הרקומבינאז CreER מחלבון הלם החום.
הרקומבינאזות המופעלות של CreER עוברות לתוך הגרעין ומזהות את אתרי ה-LoxP בגנום המארח. הקומבינאזות של CreER מזרזות רקומבינאזות ספציפיות לאתר בין אתרי LoxP, וכתוצאה מכך כריתת הגן המבוקש, ובכך משיגות נוקאאוט של גן ספציפי לרקמה.
התחל אינדוקציה של Cre Recombinase 10 עד 15 ימים לאחר הז
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים