siRNA השתקת גנים הפוכה מבוססת טרנספקציה במבחנה: הליך להעברת RNA מפריע קטן בתאים בתרבית כדי להשבית ביטוי גן מטרה

להעברה הפוכה של RNA מפריע קטן, או siRNA, סוג של RNA דו-גדילי, לאדיפוציטים או לתאי שומן שאינם נצמדים, הכינו תרחיף של siRNAs המכוונים לגן מקודד חלבון ספציפי באדיפוציטים. הוסף מגיב טרנספקציה מבוסס ליפידים קטיוני מתאים. דגרו את התערובת ליצירת מתחמי טרנספקציה באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטיות.

מעבירים את התערובת לבארות מצופות קולגן של צלחת מרובת בארות. מתחמי הטרנספקציה משתקים על ציפוי הצלחת על ידי אינטראקציות לא ספציפיות. פיפטה השעיה של אדיפוציטים לבארות המכילות מתחמי טרנספקציה משותקים. האדיפוציטים נצמדים באופן רופף לציפוי הצלחת, ומגבירים את המגע הפיזי בין התאים למתחמים.

קומפלקס הטרנספקציה מתמזג לקרום התא ומעביר את ה-siRNA לציטופלזמה. ה-siRNA, המורכב מגדיל אנטי-סנס עם רצף משלים ל-mRNA מכוון וגדיל חישה, מזוהה על ידי קומפלקס ההשתקה המעורר RNA רב-חלבוני, או RISC. ה-siRNA נקשר ל-RISC, והגדילים נפרדים, כאשר גדיל האנטי-סנס נשאר קשור לקומפלקס.

קומפלקס ה-siRNA-RISC המופעל מזהה ונקשר לאתרים המשלימים ב-mRNA המטרה. זה מוביל לפיצול ספציפי לרצף של ה-mRNA על ידי חלבון ארגונוט של קומפלקס RISC. ה-mRNA השסוע מתפרק עוד יותר על ידי המנגנון התאי, ובכך משתיק את ביטוי גן המטרה.

יש לערבב את ה-siRNA עם מדיום חיוני מינימלי משופר, ולדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף את מגיב הטרנספקציה ואת המדיום החיוני המינימלי המשופר ל-siRNA, ופיפטה לערבב. דגרו אותו למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו את תערובת הטרנספקציה לכל באר של הצלחת המצופה בקולגן.

שוטפים את התאים בצלחת פטרי 100 מילימטר פעמיים עם DPBS. הוסף טריפסין פי 5 לתאים, והקפד לכסות את כל פני השטח בטריפסין. המתן 30 שניות, והסר בזהירות את הטריפסין. דוגרים את צלחת הפטרי למשך 5 עד 10 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס בחממה.

לאחר מכן, הקש על הצלחת כדי לנתק את התאים, והימנע מנזק לתאים. הוסף 10 מיליליטר DMEM ללא פירובט, 25 מ"מ גלוקוז, 10% FCS ו-1% פניצילין וסטרפטומיצין, כדי לנטרל את הטריפסין. פיפטה בזהירות את המדיום למעלה ולמטה כדי לנתק את התאים ולהומוגניזציה של תרחיף התאים.

ספרו את התאים באמצעות תא ספירה Malassez או מונה תאים אוטומטי, והתאימו את ריכוז התאים ל-6.25 x 10⁵ תאים/מ"ל של מדיום. זרע 800 מיקרוליטר של תרחיף התא לכל באר של צלחת של 12 בארות, או 400 מיקרוליטר של תרחיף התא לכל באר של צלחת של 24 בארות המכילה את תערובת הטרנספקציה.

דגרו את הצלחות בחממת תרבית תאים, ואל תפריעו להן למשך 24 שעות. למחרת, החליפו בזהירות את הסופרנטנט ב-DMEM טרי ללא פירובט, גלוקוז של 25 מ"מ, 10% FCS ו-1% פניצילין וסטרפטומיצין, והחזירו את התאים לאינקובטור.