אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 4:34 דק׳ • July 8th, 2025
להעברה הפוכה של RNA מפריע קטן, או siRNA, סוג של RNA דו-גדילי, לאדיפוציטים או לתאי שומן שאינם נצמדים, הכינו תרחיף של siRNAs המכוונים לגן מקודד חלבון ספציפי באדיפוציטים. הוסף מגיב טרנספקציה מבוסס ליפידים קטיוני מתאים. דגרו את התערובת ליצירת מתחמי טרנספקציה באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטיות.
מעבירים את התערובת לבארות מצופות קולגן של צלחת מרובת בארות. מתחמי הטרנספקציה משתקים על ציפוי הצלחת על ידי אינטראקציות לא ספציפיות. פיפטה השעיה של אדיפוציטים לבארות המכילות מתחמי טרנספקציה משותקים. האדיפוציטים נצמדים באופן רופף לציפוי הצלחת, ומגבירים את המגע הפיזי בין התאים למתחמים.
קומפלקס הטרנספקציה מתמזג לקרום התא ומעביר את ה-siRNA לציטופלזמה. ה-siRNA, המורכב מגדיל אנטי-סנס עם רצף משלים ל-mRNA מכוון וגדיל חישה, מזוהה על ידי קומפלקס ההשתקה המעורר RNA רב-חלבוני, או RISC. ה-siRNA נקשר ל-RISC, והגדילים נפרדים, כאשר גדיל האנטי-סנס נשאר קשור לקומפלקס.
קומפלקס ה-siRNA-RISC המופעל מזהה ונקשר לאתרים המשלימים ב-mRNA המטרה. זה מוביל לפיצול ספציפי לרצף של ה-mRNA על ידי חלבון ארגונוט של קומפלקס RISC. ה-mRNA השסוע מתפרק עוד יותר על ידי המנגנון התאי, ובכך משתיק את ביטוי גן המטרה.
יש לערבב את ה-siRNA עם מדיום חיוני מינימלי משופר, ולדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף את מגיב הטרנספקציה ואת המדיום החיוני המינימ
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים